離心分離技術(shù)知識(shí)應(yīng)用

1、 離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純的一種方法。顆粒的沉降速度取決于離心機(jī)的轉(zhuǎn)速及其自身與中心軸的距離。不同大小、形狀和密度的顆粒會(huì)以不同的速度沉降。 類型普通離心機(jī)高速離心機(jī)超速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速(r/min)600025000可達(dá)75000以上 最大rcf（g）600089000可達(dá)510000以上 分離形式固液沉淀固液沉淀分離密度梯度區(qū)帶分離或差速沉降分離轉(zhuǎn)子角式和外擺式轉(zhuǎn)子角式、外擺式轉(zhuǎn)子等角式、外擺式、區(qū)帶轉(zhuǎn)子等儀器結(jié)構(gòu)性能和特點(diǎn)速率不能嚴(yán)格控制，多數(shù)室溫下操作有消除空氣和轉(zhuǎn)子間摩擦熱的制冷裝置，速率和溫度控制較準(zhǔn)確、嚴(yán)格。備有消除轉(zhuǎn)子與空氣

2、摩擦熱的真空和冷卻系統(tǒng)，有更為精確的溫度和速度控制、監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、有保證轉(zhuǎn)子正常運(yùn)轉(zhuǎn)的傳動(dòng)和制動(dòng)裝置等。應(yīng)用收集易沉降的大顆粒（如rbc、酵母細(xì)胞等）收集微生物、細(xì)胞碎片、大細(xì)胞器、硫酸銨沉淀物和免疫沉淀物等。但不能有效沉淀病毒、小細(xì)胞器（如核糖體）、蛋白質(zhì)等大分子。主要分離細(xì)胞器、病毒、核酸、蛋白質(zhì)、多糖等甚至能分開(kāi)分子大小相近的同位素標(biāo)記物15n-dna和未標(biāo)記的dna。 離心力（centrifugal force，fc）離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運(yùn)動(dòng)的任何物體都受到一個(gè)向外的離心力進(jìn)行的。離心力（fc）的大小等于離心加速度2x與顆粒質(zhì)量m的乘積，即： 其中是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為

3、單位；x是顆粒離開(kāi)旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。 由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻(xiàn)中常用“相對(duì)離心力”或“數(shù)字g”表示離心力，只要rcf值不變，一個(gè)樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。rcf就是實(shí)際離心場(chǎng)轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。 式中x為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。將離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)換成相對(duì)離心力時(shí)，先在離心機(jī)半徑標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，在圖中間rcf標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)，即為相應(yīng)的離心力

4、數(shù)值。例已知離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機(jī)的半徑為7.7cm，將兩點(diǎn)連接起來(lái)交于rcf標(biāo)尺，此交點(diǎn)500g即是rcf值。 它利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過(guò)程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開(kāi)，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。 差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開(kāi)，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。low speedhigh speeddifferential centri

5、fugation 特點(diǎn)： 介質(zhì)密度均一； 速度由低向高，逐級(jí)離心。 用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。 沉降順序：核線粒體溶酶體與過(guò)氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。 可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過(guò)密度梯離心再行分離純化。 又稱密度梯度區(qū)帶離心, 是在有密度梯度的惰性密度梯度的介質(zhì)液中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，即在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的離心方法。 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。 類型：速度沉降、等密度沉降。 常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細(xì)胞的

6、介質(zhì)要求： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高； 2）ph中性或易調(diào)為中性； 3）濃度大時(shí)滲透壓不大； 4）對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。 （一）速率區(qū)帶離心法 將樣品置于平緩的預(yù)先制好密度梯度介質(zhì)上，進(jìn)行離心，較大的顆粒將比較小的顆粒更快地沉降通過(guò)梯度介質(zhì)，形成幾個(gè)明顯的區(qū)帶（條帶）。 差速區(qū)帶離心法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒，與密度無(wú)關(guān)。大小相同、密度不同的顆粒（如溶酶體、線粒體和過(guò)氧化物酶體）不能用本法分離。 離心時(shí)，由于離心力的作用，顆粒離開(kāi)原樣品層，按不同沉降速率沿管底沉降。離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開(kāi)，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降的越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也

7、越低。沉降系數(shù)較小的顆粒，則在較上部分依次出現(xiàn)。從顆粒的沉降情況看來(lái)，離心必須在沉降最快的顆粒（大顆粒）到達(dá)管底前或剛到達(dá)管底時(shí)結(jié)束，使顆粒處于不完全的沉降狀態(tài)，而出現(xiàn)在某一些特定的區(qū)帶內(nèi)。在離心過(guò)程中，區(qū)帶的位置和形狀（或帶寬）隨時(shí)間而改變，因此，區(qū)帶的寬度不僅取決于樣品組分的數(shù)量、梯度的斜率、顆粒的擴(kuò)散作用和均一性，也與離心時(shí)間有關(guān)。時(shí)間越長(zhǎng)，區(qū)帶越寬。適當(dāng)增加離心力可縮短離心時(shí)間，并可減少擴(kuò)散導(dǎo)致的區(qū)帶加寬現(xiàn)象，增加區(qū)帶界面的穩(wěn)定性。 速率區(qū)帶離心法 用途：分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。 特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。 原理：介質(zhì)密度梯度平緩，

8、分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。 等密度離心, 被分離的樣品中顆粒的密度在密度梯度液密度范圍內(nèi)，在離心過(guò)程中，顆粒沉或浮分別移動(dòng)到與梯度液某密度相等處而成為一懸浮層，此種密度梯度離心方式稱為等密度離心。 它與密度梯度沉降離心不同，是被分離樣品中的各種顆粒的密度在整個(gè)密度梯度液的范圍內(nèi)，介質(zhì)的梯度密度往往是利用強(qiáng)大的離心力使組成梯度液的成份自形成密度梯度，當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時(shí)，在離心力的作用下，顆?；蛳蛳鲁两祷蛳蛏细∑穑恢毖靥荻纫苿?dòng)到與它們恰好相等密度梯度的位置上（即等密度點(diǎn)）形成區(qū)帶層。 用途：分離密度不等的顆粒。 特點(diǎn)： 介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。 力場(chǎng)比速率沉降法大101