一種蛋白純化的新思路新方發(fā)法

1、ssb親和層析使用說(shuō)明書(shū)一、 簡(jiǎn)介噬菌體t7 單鏈dna結(jié)合蛋白（ssb, single-stranded dna binding protein）由696bp核苷酸編碼，計(jì)算分子量為 25.6kda（sds-page凝膠電泳，該蛋白條帶約在27 kda位置）。它與單鏈dna有很強(qiáng)的親和性，且無(wú)序列特異性。利用這一特性，將ssb構(gòu)建到不同宿主的表達(dá)載體中，可以實(shí)現(xiàn)在不同宿主中表達(dá)帶有ssb標(biāo)簽的融合蛋白，從而與偶聯(lián)在介質(zhì)中的單鏈dna高效、特異性結(jié)合，這種結(jié)合是可逆的，能夠在溫和、非變性的條件下通過(guò)改變洗脫液的ph值或鹽濃度對(duì)融合蛋白進(jìn)行洗脫，達(dá)到純化某一目標(biāo)蛋白的目的。 pssb系列載體用于

2、構(gòu)建可誘導(dǎo)、高水平表達(dá)的基因或基因片段，表達(dá)的融合蛋白的n端或c端帶有ssb標(biāo)簽。ssb標(biāo)簽可根據(jù)需要由位點(diǎn)特異的蛋白酶切除，pssb系列質(zhì)粒上多克隆位點(diǎn)上游包含有腸激酶（enterokinase）、凝血酶、tev等識(shí)別序列。帶有標(biāo)簽的蛋白可以通過(guò)免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定是否切除標(biāo)簽。ssb親和層析介質(zhì)（經(jīng)過(guò)特殊處理的ssdna-cellulose）是專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于純化ssb融合蛋白及與目的蛋白有親和作用的蛋白復(fù)合體的分離介質(zhì)，通過(guò)鹽離子梯度洗脫可得到高純度的ssb融合蛋白。純化條件溫和，不引入其他物質(zhì)，能夠保證蛋白的活性。二、 pssb載體現(xiàn)有的pssb載體系列按宿主不同可以分

3、為以下四類(lèi)：1）大腸桿菌類(lèi); 2）酵母類(lèi); 3）人細(xì)胞類(lèi)；4）昆蟲(chóng)細(xì)胞類(lèi)。每一個(gè)類(lèi)別中均含有帶有n端和c端的ssb標(biāo)簽質(zhì)粒，每個(gè)質(zhì)粒都含有相應(yīng)的蛋白酶切位點(diǎn)，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將ssb標(biāo)簽從融合蛋白中切去。在不同的宿主載體中，它們的啟動(dòng)子也各不相同，通過(guò)各自的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格調(diào)控插入片段的表達(dá)。相關(guān)參數(shù)如下頁(yè)表一所示： 表一：pssb系列載體宿主載體ssb位于目的蛋白的n端或c端抗性啟動(dòng)子蛋白酶切位點(diǎn)是否帶his標(biāo)簽大腸桿菌e.colipssb-e1n端卡納抗性t7腸激酶否pssb-e2n端卡納抗性t7腸激酶是pssb-e3n端（ssb(26c)標(biāo)簽）卡納抗性t7腸激酶是pssb-e4n端卡納抗

4、性t7凝血酶是pssb-e5n端卡納抗性t7凝血酶否pssb-e6c端卡納抗性t7腸激酶是酵母yeastpssb-y1n端卡納抗性nmt1腸激酶是pssb-y2n端氨芐抗性nmt1腸激酶是pssb-y3c端氨芐抗性nmt1腸激酶是人細(xì)胞humanpssb-h1n端氨芐抗性cmvtev是pssb-h2c端氨芐抗性cmv腸激酶是昆蟲(chóng)細(xì)胞insectpssb-i1n端氨芐抗性ph腸激酶是pssb-i2c端氨芐抗性ph腸激酶是具體信息詳見(jiàn)網(wǎng)站：。三、 插入基因片段 每一個(gè)pssb表達(dá)載體設(shè)計(jì)有多個(gè)克隆位點(diǎn)。 根據(jù)需要，dna片段可被插入到某一特定的位點(diǎn)。四、 優(yōu)化表達(dá)插入dna片段的方向和載體的連接確

5、定無(wú)誤后，下一步將要優(yōu)化帶ssb標(biāo)簽融合蛋白的表達(dá)，確定了最佳的蛋白表達(dá)水平及相應(yīng)的生長(zhǎng)條件后就可以進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)。生長(zhǎng)條件應(yīng)考慮最佳的蛋白表達(dá)水平，確定一系列諸如培養(yǎng)基、生長(zhǎng)溫度、密度、誘導(dǎo)條件等參數(shù)。保證足夠的通氣條件、縮短各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的時(shí)間以及使用正確的抗生素進(jìn)行篩選都是非常重要的。同時(shí)應(yīng)當(dāng)確定表達(dá)的融合蛋白是在包涵體狀態(tài)或可溶狀態(tài)。ssb在一定程度上可以促進(jìn)目的蛋白的溶解，但有時(shí)候會(huì)因?yàn)檫^(guò)度表達(dá)而導(dǎo)致蛋白不能以正確的方式折疊，從而形成包涵體。為降低包涵體的形成，可以適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基條件來(lái)提高重組蛋白的溶解能力，如：生長(zhǎng)溫度降低至15-30，增加通氣，改變誘導(dǎo)條件如降低蛋白表達(dá)的速率等。

6、五、 ssdna-cellulosessdna-cellulose由單鏈dna（ssdna）與處理過(guò)的cellulose進(jìn)行偶聯(lián)所得，大約1g cellulose可以偶聯(lián)2-3mg 的ssdna。ssdna可以與ssb特異性結(jié)合，且1ml 溶脹好的ssdna-cellulose柱料可以結(jié)合1-2mg 的帶有ssb 標(biāo)簽的融合蛋白。此介質(zhì)是自主設(shè)計(jì)合成的，具有優(yōu)良的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，操作方便，批次重復(fù)性好，是研發(fā)的理想選擇，具體性能參數(shù)如表二所示：表二：ssdna-cellulose的性能參數(shù)特點(diǎn)成本低，操作方便基質(zhì)纖維素吸附載量1ml吸附1-2mg的ssb融合蛋白介質(zhì)平均直徑100mph范圍3

7、-10保存溫度4-8保存條件干燥保存六、 純化ssb標(biāo)簽蛋白可以通過(guò)親和層析柱（ssdna-cellulose）比較方便的從細(xì)胞裂解物中純化。純化時(shí)，標(biāo)簽蛋白與配體結(jié)合，雜質(zhì)通過(guò)結(jié)合緩沖液被洗脫去除，之后標(biāo)簽蛋白在溫和、非變性的條件下被洗脫下來(lái)，可以使蛋白的抗原性能和功能得以保護(hù)。如果需要將ssb標(biāo)簽從目的蛋白上切除，標(biāo)簽蛋白可以在與ssdna-cellulose結(jié)合時(shí)使用合適的位點(diǎn)特異性蛋白酶酶切，也可在洗脫之后再酶切，在標(biāo)簽蛋白與介質(zhì)結(jié)合時(shí)酶切可以節(jié)省分離ssb標(biāo)簽與目的蛋白的步驟，因?yàn)檫@樣在洗脫目的蛋白時(shí)ssb標(biāo)簽仍舊結(jié)合在介質(zhì)上。七、 操作說(shuō)明1) 緩沖液配制：te：10mm tris

8、-hcl （ph=8.0），1mm edta;結(jié)合緩沖液：50 mm tris-hcl (ph=8.0), 100 mm nacl 或 100 mm kcl, 5 mm edta, 2 mm dtt, 10% glycerol。（結(jié)合緩沖液的鹽濃度可以根據(jù)要純化的蛋白性質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)）2) 操作步驟：1、 取適量ssdna-cellulose干料，用te緩沖液溶脹約2-4個(gè)小時(shí)。0.2g干料可溶脹為1ml 柱材料。裝入層析柱后，用5-10倍的柱體積的te（ph=8.0）洗滌柱子，將未偶聯(lián)的多余dna去除。 2、用結(jié)合緩沖液平衡柱子5-10個(gè)床體積。 3、用上述結(jié)合緩沖液溶解表達(dá)的帶有ssb標(biāo)簽融合蛋

9、白的細(xì)胞，然后將其超聲破碎或者裂解破碎，細(xì)胞裂解液高速離心后取其上清，緩慢注入層析柱，如果樣品掛柱效率低，可降低流速及重復(fù)上樣。上樣完畢后用平衡緩沖液再洗至基線。 4、用5-10個(gè)柱床體積的低鹽（0.1 m nacl 或 kcl）緩沖液洗脫雜蛋白。 5、然后，梯度性地提高鹽濃度，洗脫目的蛋白。 3) 柱子再生：如果連續(xù)重復(fù)純化同一個(gè)蛋白，柱子可以再生：首先用含有1.5m或2m的高鹽緩沖液清洗柱子5-10個(gè)柱床體積，然后用大量蒸餾水清洗，最后用結(jié)合緩沖液重新平衡。如果長(zhǎng)時(shí)間不用或者是純化其它蛋白，建議重新使用新的柱材料進(jìn)行純化。4) 注意事項(xiàng)： 結(jié)合緩沖液可以隨自己所需的要求進(jìn)行適當(dāng)更換，如可以

10、使用pbs等其它buffer，但需注意的是，最好不要加入mg2+，edta的濃度保持在2-5mm左右。 層析柱在純化之前溶脹，時(shí)間2-4小時(shí)，由于dna與cellulose是物理偶聯(lián)，所以不建議長(zhǎng)時(shí)間溶脹后使用，重復(fù)使用次數(shù)不要超過(guò)三次。八、 應(yīng)用舉例實(shí)例1：將sap1蛋白的基因重組于質(zhì)粒pssb-e4中，并對(duì)表達(dá)的融合蛋白ssb-sap1進(jìn)行純化。在e.coli中表達(dá)的ssb融合蛋白，每升細(xì)胞培養(yǎng)物可以得到3至30毫克蛋白。不同的目的蛋白，表達(dá)起伏較大。下面詳細(xì)介紹用ssdna-cellulose純化融合蛋白ssb-sap1并用凝血酶對(duì)標(biāo)簽蛋白進(jìn)行切割。sap1在裂殖酵母中大量存在，分子量為

11、30kda。通過(guò)pcr反應(yīng)從裂殖酵母基因組dna中擴(kuò)增得到sap1基因的dna片段，插入到pssb-e4載體的bam hi和hind iii位點(diǎn)。通過(guò)篩選獲得的編碼融合蛋白6his-ssb-sap1的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到e.coli bl21(de3)plyss細(xì)胞中，次日，挑取單菌落接到50ml含有50g/ml卡那霉素lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜的菌液以1:100的比例接到新鮮的培養(yǎng)基中，在37培養(yǎng)至od600為0.5左右，加iptg到0.1mm的終濃度，繼續(xù)37培養(yǎng)誘導(dǎo)3.5h，然后離心收集細(xì)胞，用含有0.4m nacl的結(jié)合緩沖液（50 mm tris-hcl (ph=8.0), 5 mm ed

12、ta, 2 mm dtt, 10% glycerol）懸浮菌體，超聲破碎細(xì)胞，37000g離心30分鐘。全細(xì)胞提取物，以及隨后的細(xì)胞裂解液的沉淀和上清用sds-page檢測(cè)，圖一表明：6his-ssb-sap1融合蛋白可溶性高，離心后約90%以上在上清中。由于sap1蛋白對(duì)鹽濃度較為敏感，所以我們選擇先高鹽得到可溶性蛋白后，將其稀釋到100mm的鹽濃度，高速離心后取上清再對(duì)其進(jìn)行層析純化。figure1: the overexpression of the fusion proteins 6his-ssb-sap1 in e.coli bl21(de3) plys cells.用50 mm t

13、ris-hcl (ph=8.0) ，5 mm edta, 2 mm dtt, 10% glycerol將6his-ssb-sap1的鹽濃度調(diào)到0.1m，再進(jìn)行ssdna-cellulose層析：1. 層析柱先用te清洗5-10個(gè)柱床體積以去除未偶聯(lián)的dna，后用結(jié)合緩沖液平衡5-10個(gè)柱床體積。2. 用注射器或蠕動(dòng)泵加入已處理好的樣品，為了獲得最好的結(jié)果，上樣時(shí)可以調(diào)低流速或者重復(fù)上樣。3. 用結(jié)合緩沖液至少洗滌5-10個(gè)柱床體積，直到吸收達(dá)到平穩(wěn)的基線或在流出物中沒(méi)有物質(zhì)流出。4. 低鹽緩沖液50 mm tris-hcl (ph=8.0) ，0.2m nacl，5 mm edta, 2 mm

14、 dtt, 10% glycerol洗滌柱子3-4個(gè)柱床體積以進(jìn)一步去除非特異性結(jié)合的雜蛋白。5. 用高鹽緩沖液50 mm tris-hcl (ph=8.0) ，0.4m nacl，5 mm edta, 2 mm dtt, 10% glycerol洗脫目的蛋白，分管收集。純化結(jié)果如圖二所示，根據(jù)密度測(cè)定法，6his-ssb-sap1的純度可達(dá)到96%左右。figure2: the purification of 6his-ssb-sap1 in e.coli cell extract with ssdna-cellulose affinity chromatography.取100g6his-

15、ssb-sap1加入1單位的凝血酶在0.1m nacl，2.5m cacl2，50 mm tris-hcl (ph=8.0)，5 mm edta, 2 mm dtt，10% glycerol中室溫溫育2到5個(gè)小時(shí)，如圖三所示，6his-ssb-sap1融合蛋白被凝血酶充分酶解，6his-ssb可以進(jìn)一步通過(guò)鎳-瓊脂糖層析除去。figure3: removal of 6his-ssb tag by ni2+-nta agarose column after thrombin digestion.實(shí)例2：將cds1基因重組入質(zhì)粒pssb-y2中，并對(duì)表達(dá)的融合蛋白ssb-cds1進(jìn)行純化在酵母中表

16、達(dá)的蛋白，一般表達(dá)量都很少，目的蛋白占總蛋白的量比例在1%左右甚至更低，只有用western-bloting才能檢測(cè)出來(lái)，但是，酵母中表達(dá)的蛋白質(zhì)一般不會(huì)形成包涵體，所以也是蛋白表達(dá)較好的一種宿主菌株。cds1基因全長(zhǎng)1383bp，編碼460aa，是一個(gè)dna復(fù)制過(guò)程中細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)中關(guān)鍵的蛋白激酶。將cds1的dna片段插入到pssb-y2中的not和bgl的兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，通過(guò)篩選獲得編碼融合蛋白6his-ssb-cds1的質(zhì)粒，通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞ld330，在含有5g/ml的維生素b1與不含有uracil的培養(yǎng)基emm平板上32生長(zhǎng)，約三四天后，將平板上適量的菌轉(zhuǎn)入50ml含

17、有5g/ml的維生素b1的emm液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)菌體長(zhǎng)到一定濃度后，收集菌體并用滅菌水洗菌體2-3次后，將培養(yǎng)基中的維生素b1去除干凈，最后將其換至新鮮的不含有維生素b1的emm培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，12.5h后收集菌體并進(jìn)行蛋白純化。用1.2m sorbital將菌體懸起，加入10mm的dtt及適量的lyticase在30消化細(xì)胞，待90%的細(xì)胞在1% triton x-100中為ghost cell時(shí)，立即加入buffer 1（50 mm tris-hcl (ph=8.0) ，0.1m nacl，5 mm edta, 2 mm dtt, 10% glycerol），同時(shí)加入蛋白酶抑制劑和終

18、濃度為1%的triton x-100，上下劇烈震蕩幾次后高速離心（15000rpm，4），得到的上清用ssdna-celllulose柱子進(jìn)行純化。1） 層析柱先用te清洗5-10個(gè)柱床體積以去除未偶聯(lián)的dna，后用buffer1平衡5-10個(gè)柱床體積。2） 用注射器或蠕動(dòng)泵加入已處理好的樣品，為了獲得最好的結(jié)果，上樣時(shí)可以調(diào)低流速或者重復(fù)上樣。3） 用buffer1至少洗滌5-10個(gè)柱床體積，直到吸收達(dá)到平穩(wěn)的基線或在流出物中沒(méi)有物質(zhì)流出。4） 通過(guò)逐漸增加buffer1中的鹽離子濃度達(dá)到純化ssb-cds1的目的.純化結(jié)果如圖所示，我們得到了可以考染可見(jiàn)的ssb-cds1樣品，且純度在70%以上。figure 4：the purification of ssb-cds1 expressed in yeast cell extract with ssdna-cellulose affinity chromatography. 九、 純化方法的問(wèn)題解決 表三：純化方法的問(wèn)題解決問(wèn)題可能原因解決方法ssb標(biāo)簽蛋白不結(jié)合柱子或者結(jié)合非常弱目的蛋白可能改變了ssb的構(gòu)象或影響了ssb與ssdna的結(jié)合，因此降低了ssb標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力。 當(dāng)目的蛋白是非常大的時(shí)候，可能會(huì)碰到這個(gè)情況。降低樣品上柱時(shí)的鹽濃度或改變ssb融