生化分析知識點總結

1、氨基酸1八種必須氨基酸的英文命名及縮寫。賴氨酸 Lysi ne Lys K甲硫氨酸 Methio nine Met M纈氨酸 vali ne Vai V異亮氨酸 isoleuc ine Ile I苯丙氨酸 phe nylanine Phe F亮氨酸 leuc ine Leu L色氨酸 tryptopha n Try W蘇氨酸 thre onine thr T2倆種氨基酸組成多肽時，有幾種成二肽，有四種成三肽時，有八種(僅供參考，不一定正確，有不同意見請指出來)。 二酶分析1酶活性的定義，國際常用的單位：酶活性(enzyme activity )也稱為酶活力，指酶促反應速率，即規(guī)定條件下在單位時

2、間內產物的生成量或底物的減少量。酶活性單位：表示酶的相對含量，指在一定條件下，單位時間內生成一定量的產物或消耗一定量的底物所催化的酶量。a .國際單位IU (卩mol/min )定義：在規(guī)定條件下(25C及其他最適條件)，每分鐘催化1卩mol底物轉變?yōu)楫a物的酶量，為 1IU或1U 1IU=1 mol/min。B. Katal 單位（mol/s ）定義：IKatal是在規(guī)定條件下，每秒鐘催化1mol底物轉變?yōu)楫a物的酶量。IKatal = 1mol/s。IU 與 Katal 單位的關系：Ikatal = 60 x 106IU,1IU =3酶促反應酶促反應的歷程：延滯期，線性期，非線性期a.酶促反應

3、式：kj婦心E + S * ES吃 + 沖酶 底物酶屆物復合物酶產物，B.米氏方程V =C. Km的含義與意義V maxv .Km的含義：當Km二S時，2 可見Km值等于反應速率達到最大反應速率Vma一半時的底物濃度。Km的意義：Km是酶的一個特征性常數(shù)（其他如等電點），Km的大小只與酶的性質有關反映酶對底物親和力的大小選擇酶的最適底物或天然底物計算不同底物濃度時的反應程度鑒別酶的種類判斷可逆反應的速率判斷酶偶聯(lián)反應的限速反應計算工具酶的用量3. 兩種測定酶活性的方法：a.定時法原理：定時法是固定時間法的簡稱，是指測定反應開始后一段時間（t1t2 ）產物的增加量或底物的減少量以測定酶活性的方法

4、。 該方 法一般需要在反應進行到一定時間后用強酸、 強堿、蛋白沉淀劑等終 止反應。優(yōu)點：簡單、不需要保溫設備、不用考慮酶的活性。缺點：如果不做預試驗則無法了解其酶促反應進程（t1-t2 ）是 否為零級反應，故難以確保測定結果的準確性。b.連續(xù)檢測法：原理：連續(xù)監(jiān)測法是指在多個時間點連續(xù)測定產物（或底物）在線性期內的生成量（或消耗量）即零級反應速率以測定酶活性的方法， 又稱速率法、零級反應速率法、斜率法。該方法是在一定的反應時間區(qū)段內（至少 9120s）每隔一定時 間（常為230s）讀取一次吸光度值，連續(xù)測定多點（至少 4點）， 然后對吸光度數(shù)據(jù)作最小二乘法處理，再用線性期內的數(shù)據(jù)計算單位 時間

5、內的反應速率 A/min，最后計算出酶活性。U/L AlVutul Vu連續(xù)監(jiān)測法的特點：屬于即時觀測，無需停止酶促反應、不需添 加其他呈色試劑，可將多點的測定結果繪圖連線，快速、直觀查看酶 促反應進程，很容易找到呈直線的線性期；連續(xù)監(jiān)測法要求不顯色而是直接測定底物 （或輔助底物即中間底 物）或產物量的變化，因此，可以選擇紫外吸收法或生色原顯色法； 能夠準確地控制溫度、pH值和底物濃度等，要求儀器具有恒溫 裝置及自動監(jiān)測功能，半自動及全自動生化分析儀都能滿足這些要 求；測定結果常較定時法高4. 固定化酶和游離酶的優(yōu)點和缺點：a. 固定化酶 優(yōu)點：增加了酶的活性和穩(wěn)定性可回收重復使用，降低了酶耗

6、 酶反應過程便于控制 適用于連續(xù)反應易于反應體系分離 對環(huán)境的耐受性增強 缺點：對酶的物理化學性質產生一定的影響。b. 游離酶優(yōu)點：易溶于水于底物的作用面積大，反應充分活性接近生理狀態(tài)缺點：難與底物分離反應條件控制嚴格不能反復利用，易失活三.蛋白質分析1. 蛋白質的鹽析，變性及二者的區(qū)別鹽析：在蛋白質溶液中加入某些無機鹽的濃溶液，使蛋白質的 溶解度下降而從溶液中析出來的現(xiàn)象。變性：在熱、重金屬、酸、堿、某些有機物等作用下，蛋白質的物理性質和生理功能發(fā)生改變的現(xiàn)象，稱為蛋白質的變性。蛋白質鹽析和變性的區(qū)別與對比AHHi日疋件ttH 円疋麻 一 §-疋絆下,iSMStlSi Mtttt2

7、1Ott 曲礎Mtt贈,MW械ho m住ma2. 蛋白質的序列分析：測得的是蛋白質的一級結構。蛋白質的結構：一級結構：蛋白質的氨基酸殘基的序列，一級結構的作用力：肽鍵，S-S鍵。二級結構：a -螺旋，B -折疊，B -轉角，無規(guī)卷曲二級結構形成的力量：氫鍵超二級結構：若干相鄰的二級結構中的構象單元彼此相互作用,形成有規(guī)則的、在空間上能辨認的二級結構組合體是球狀蛋白質的折疊單位，在空間上彼此分隔，各自具有部分生 物功能的結構含100200個氨基酸殘基，1條長的多肽鏈首先折疊成幾個相對獨立的結構域再締合成三級 結構。三級結構：由若干二級結構單位，完全折疊后可組成一個完整的 蛋白質分子，即為三級結構

8、，可具有活性。三級結構形成的力量：氫鍵，離子鍵，疏水鍵，雙硫鍵3. 蛋白質分子量的測定方法：十二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠電泳 法（SDS-PAG法）和凝膠過濾層析法。a .十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠色譜法：基本原理：SDS可以破壞蛋白質中的疏水鍵和氫鍵， 并按一定比例（1g蛋 白質結合SDS）和蛋白質組成復合物，使蛋白質帶的負電荷的量遠遠 超過其本身的電荷量，并與蛋白質的分子量成正比。2-巰基乙醇破壞了蛋白質二硫鍵，使蛋白質呈橢圓棒形，其軸 長與分子量成正比。卩=q/f = q/6 r ，所有蛋白質的遷移率都相同。b.凝膠過濾層析法：原理：蛋白質在凝膠過濾層析柱中的洗脫體積Ve,與其分

9、子量的關系如下式所示：lg Mr = K1 K2 Ve在實驗中，只要測得幾種蛋白質分子量標準物的 Ve,并以它們 的lg Mr對Ve作圖得一直線，再測出樣品的 Ve,即可從圖中得到樣 品的分子量。倆者的聯(lián)系與關系： 凝膠過濾法測得的是蛋白質四級結構 （如果它有 的話）的分子量；SDS-PAG測得的是蛋白質亞基的分子量； 在有2-巰基乙醇（或DTT存在時，SDS-PAG可測得蛋白質每 條多肽鏈的分子量。綜合應用這兩種方法,可得到待測蛋白質結構的許多信息。 SDS-PAG與凝膠過濾法是互補的4. 兩種測定蛋白質的方法：a. 凱氏定氮法：蛋白質+硫酸t(yī) CO2+H2O+NH硫酸銨+強堿t氨 優(yōu)點：適

10、用樣品廣泛,結果可靠 缺點：樣品中非蛋白態(tài)氨影響測定值； 蛋白質氨基酸有偏差時（大 量堿性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）誤差較大；操作繁瑣。b. 紫外光譜吸收法：原理：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。大多數(shù)蛋 白質含有這兩種氨基酸殘基,在一定濃度范圍內,蛋白質的 A280 與 其濃度呈正比,據(jù)此可進行蛋白質定量測定。是一種快速簡便分析溶液中蛋白質含量的的方法。計算方法：標準曲線法：蛋白質濃度(mg/ml) =xx A260注意事項：石英比色杯調零所用溶液光密度范圍四抗原抗體，全抗原和半抗原的關系1. 抗原抗原是能夠引起免疫反應的分子?？乖哂幸韵聝煞N特性： 免疫原性(immu

11、nogenicity ),即誘導刺激免疫系統(tǒng)產生抗體或者激活淋巴細胞產生免疫應答的能力， 具有這種特性的物質稱為免疫原( immunogen)； 抗原性( antigenicity ) ，指能與相應抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結合，引起免疫反應的性能。全抗原：具有上述兩種特性的物質稱為完全抗原。包括：蛋白質，多糖，核酸，合成多肽，低分子物質。 半抗原：不能誘導產生抗體，但能和適當抗體起反應，即有免疫反應 性的簡單分子稱為半抗原。只具有抗原性。全抗原能引起機體的免疫反應，半抗原不能引起機體的免疫反應。2. 親和常數(shù)：免疫反應： Ag+AbAg-Ab該免疫反應遵循可逆生物大分子相互作用的熱動力學基

12、本原理， 其反應式為Ab -Ag&kAbAgk2式中：Ab為游離的抗體結合位點的濃度；Ag為游離的抗原結合位 點的濃度；Ab-Ag為抗原-抗體復合物的濃度；k1為正反應速率常 數(shù)；k2為負反應速率常數(shù)；K為反應平衡常數(shù)（親和常數(shù)）?？乖涂贵w在體內進行的反應稱為免疫反應， 在體外進行的反 應稱為血清學反應。3.酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）。酶聯(lián)免疫吸附分析法（ en zyme-l in ked immuno sorbe nt assay ，ELISA）原理 使抗原或抗體結合到某種固相載體表面； 抗原或抗體與某種酶聯(lián)結成酶標抗原或抗體； 在測定時，使受檢標本和酶標抗原或抗體按不同的步驟與

13、固相抗原或固相抗體起反應； 用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例； 加入酶反應底物，底物被酶催化為有色產物，產物量與標本中受檢 物的量相關，用分光光度法進行定量。酶聯(lián)免疫分析法的流程力抗力叭底物磁體狽儷 J§TLI；的OD值以檢測氯胺酮為例4.時間分辨熒光分析法TRFIA所用的標記物是鑭系元素螯合物，利用這類熒光物質熒 光壽命長及Stokes位移大的特點，通過波長和時間兩種分辨技術， 有效排除了非特異本底熒光的干擾，具有靈敏度高，標記物制備簡單, 穩(wěn)定性好，標準曲線線性范圍寬，操作方便的優(yōu)點。TRFIA5.

14、 單克隆抗體和多克隆抗體的比較:比較頊目事克隆抗悴(PtAb)單克隆杭律tMAb>免疫原要求免疫嗥純.度高.就偉 純度才能高不純的免疫原可以庶得高純藝抗體產生細胞峯克降性單克睦性均質性高度異質高度純質特異性較高、與抗原上爭種決 定擁詰臺髙，與抗原上特定決定簇結合穩(wěn)定性招對我雀時理化條件敏常標準化較難，不同批冼的抗體質 量差異大易于標虛化，毗決間羌異小玄叉反應很常見.難避兎非倚異性 反應平常見.可遷免非特異反應沉淀反應W實用的血淸學試驗大零敷血清學試驗一種戟爭種，需適當選擇供應量有限無IK育效抗體含雖0 1 -0.2 mgAnl屮魏拽啦20*30 mg/ml無效弗量10 0-150 mg

15、ml體外培養(yǎng)一般沒有，屮鼠腹水 0 ?-5.0 mg ml其它血清蛋白存在侔外培養(yǎng)可能肓少量小牛血淸 蛋白，小鼠腹水有少量呆蛋白6. 設計合適的方案檢測生活中的小分子有機物。五，核酸（DNA和RNA1. DNA是雙螺旋結構，RNA是單鏈的!DNA:A-TGCRNA: AUG-C2. PCR的意義和簡單操作流程意義： PCR（Polymerase chain reaction） 是用一對寡聚 DNA 作為引物，通過加溫變性-退火-DNA合成這一周期的多次循環(huán)， 使目的DNA片段得到擴增。由于這種擴增產物是以指數(shù)形式積累 的，經 2530個循環(huán)后，擴增倍數(shù)可達 106.流程：（一）原理雙鏈DNAS

16、過高溫變性解離成互補單鏈 DNA變性與一對寡核苷酸引物（ 5'，3'）降低溫度退火DNA加熱變性+引物慢慢冷卻使其結合，形象地稱為退火適溫延伸 5'/3'引物形成新鏈變成 4條鏈 DNA 延第二輪：變性一退火一延伸呈指數(shù)增長理論值:輪倍103輪 10 =1000倍20輪10 630輪10 9理論模板擴增30輪1ng-1g實際模板擴增30輪1ng-10g 模板DNA經加熱至93C左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或經 PCRT增形成的雙鏈DNA軍離，使之成為單鏈，以便它與引物結合， 為下輪反應作準備； 模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至 55C左右，引物與模

17、板DNA單鏈的互補序列配對結合； DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一一 條新的與模板DNA鏈.每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴 增放大幾百萬倍.3. DNA測序的倆種方法基本原理:a. sanger雙脫氧鏈終止法：引入了雙脫氧核苷三磷酸（2' ,3 ' -ddNTP作為鏈終止劑； 2' ,3 ' -ddNTP與普通的dNTF不同之處在于前者的脫氧核糖的 3'位 又少了個羥基。它可以在 DNA聚合酶的作用下和多核苷酸鏈的 3'羥 基形成磷酸

18、二酯鍵， 但卻不能再與下一個核苷酸縮合， 結果使得多核 苷酸鏈的延伸終止；在DNA的合成反應中，除了加入4種正常的dNTF#，再加入一種 少量的ddNTP反應產物是一系列的長短不一的核苷酸鏈。在 4組獨 立的DNA合成反應中，分別加入4種不同的ddNTP結果將生成4組 核苷酸鏈，它們將分別終止于每一個 A,每一個G,每一個C,每一 個T的位置上。對這4組核苷酸鏈進行聚丙烯酰胺凝膠電泳， 就可讀 出序列 .b Gillbert 化學裂解法：將DNA片段的5 端磷酸基作放射性標記，再分別采用不同的化 學方法修飾和裂解特定堿基， 從而產生一系列長度不一而 5' 端被標 記的 DNA 片段，這

19、些以特定堿基結尾的片段群通過凝膠電泳分離， 再經放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的 DNA 的堿 基序列 .4. 分子印記的原理和流程：（一） Southern Blot原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或 RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結合，游離探針 洗滌后用自顯影或其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的 片段及其相對大小.DNA脂糖電泳印跡轉移 十 預雜交k雜交（變性探針）

20、洗膜 放射自顯影或顯色 用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài)，如是 否有點突變、擴增重排等.（二） Northern Blot原理：在變性條件下將待檢的rnA羊品進行瓊脂糖凝膠電泳, 繼而按照同Southern Blot相同的原理進行轉膜和用探針進行雜交檢 測.操作過程mRNA 提取 甲醛變性電泳 k 印跡轉移 k 預雜交 一"雜交（變性探針）一'洗膜一"放射自顯影或化學 發(fā)光。用途：檢測樣品中是否含有基因的轉錄產物（mRN）及其含量（ 六生物大分子。1倆種分離純化蛋白質的方法:a。反向高效液相色譜蛋白質分子中既有親水性基團（-OH -NH -COOH

21、SH等），也有疏水性基團（如苯環(huán)、-CH3 -CH2和-CH等）. 不同的蛋白質在相同流動相中由于疏水基團多少、種類以及表 面分布情況不同，與填料的親合力也不同，從而得到分離 . 結果：疏水性強的蛋白質親合力大 ,出峰遲;疏水性小的蛋白質 就容易被洗脫 .其分離蛋白質和酶等生物大分子具有速度快、分離性能好，重復 性好，溶劑和流動相易除去等優(yōu)點 . 在所有的液相色譜法中反相 色譜的分離性能 .缺點是很多蛋白質或酶在分離過程中失活，而且回收的樣 品中總含有有機溶劑 .b. 凝膠過濾層析亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠 把分子大小不同的物質分離開的一種方法 .其機理是分子篩效應。在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進入凝膠顆粒內部的多孔網狀結構，路徑長、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合樣品如同“過篩”一樣，因分子大小的不同得 以彼此分開.它具有分離條件溫和，產品收率高，生物活性好，分離面寬等