核酸環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理及引物設(shè)計(jì)及實(shí)例

1、核酸環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理及引物設(shè)計(jì)與實(shí)例1LAMP引物的設(shè)計(jì)：LAMP引物的設(shè)計(jì)主要是針對(duì)靶基因的六個(gè)不同的區(qū)域，基于靶基因3 端的F3c、F2c和Flc區(qū)以及5 端的Bl、B2和B3區(qū)等6個(gè)不同的位點(diǎn)設(shè)計(jì)4種引物。FIP(Forward Inner Primer)：上游內(nèi)部引物，由F2區(qū)和F1C區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3端的F2c區(qū)域互補(bǔ)，F(xiàn)1C區(qū)與靶基因5端的Flc區(qū)域序列相同。F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補(bǔ)。BIP引物：下游內(nèi)部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2區(qū)域組成，B2

2、區(qū)與靶基因3 端的B2c區(qū)域互補(bǔ)，B1C域與靶基因5端的Blc區(qū)域序列相同。B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補(bǔ)。如圖所示：2擴(kuò)增原理 6065是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度，DNA在65左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。因此，DNA在此溫度下合成是可能的。利用4種特異引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶。使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。擴(kuò)增分兩個(gè)階段。第1階段為起始階段，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈。上游內(nèi)部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結(jié)合（如圖B所示），在鏈置

3、換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動(dòng)鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結(jié)合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補(bǔ)單鏈（如圖C所示）。FIP上的F1c與此單鏈上的Fl為互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。自我堿基配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)（如圖C所示）。以此鏈為模板。下游引物BIP與B3先后啟動(dòng)類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈。迅速以3末端的Fl區(qū)段為起點(diǎn)以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是LAMP基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。第2階段是擴(kuò)增循環(huán)階段。以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結(jié)合。開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。迅速以3末端的B1區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板。進(jìn)行DNA

4、合成延伸及鏈置換形成長(zhǎng)短不一的2條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，BIP引物上的B2與其雜交。啟動(dòng)新一輪擴(kuò)增。且產(chǎn)物DNA長(zhǎng)度增加一倍。在反應(yīng)體系中添加2條環(huán)狀引物L(fēng)F和LB，它們也分別與莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動(dòng)鏈置換合成，周而復(fù)始。擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度DNA的混合物。且產(chǎn)物DNA為擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列。3 LAMP的特點(diǎn)LAMP與以往的核酸擴(kuò)增方法相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)操作簡(jiǎn)單，LAMP核酸擴(kuò)增是在等溫條件下進(jìn)行，對(duì)于中小醫(yī)院只需要水浴鍋即可，產(chǎn)物檢測(cè)用肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)沉淀濁度即可判斷。對(duì)于RNA的擴(kuò)增只需要在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶就可同步進(jìn)行(RTLAMP)，不需要

5、特殊的試劑及儀器。(2)快速高效，因?yàn)椴恍枰A(yù)先的雙鏈DNA熱變性避免了溫度循環(huán)而造成的時(shí)間損失核酸擴(kuò)增在l h內(nèi)均可完成，添加環(huán)狀引物后時(shí)間可以節(jié)省12，多數(shù)情況在20。30 rain均可檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物。且產(chǎn)物可以擴(kuò)增至109倍，達(dá)0.5 mgmL應(yīng)用專門的濁度儀可以達(dá)到實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。(3)高特異性，由于是針對(duì)靶序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的4種特異性引物。6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增。故其特異性極高。(4)高靈敏度，對(duì)于病毒擴(kuò)增模板可達(dá)幾個(gè)拷貝，比PCR高出數(shù)量級(jí)的差異。缺點(diǎn)：由于LAMP擴(kuò)增是鏈置換合成，靶序列長(zhǎng)度最好在300 bp以內(nèi)。>500 bp則較難擴(kuò)增。故不能進(jìn)行長(zhǎng)鏈DNA的擴(kuò)增。由于靈敏度高。極易受到污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。故要特別注意嚴(yán)謹(jǐn)操作，以及在產(chǎn)物的回收鑒定、克隆、單鏈分離方面均遜色于傳統(tǒng)的PCR方法。4 引物設(shè)計(jì)實(shí)例LAMP引物設(shè)計(jì)的在線網(wǎng)站()，只要導(dǎo)入靶基因就能自動(dòng)生成成組引物。以某一微生物的鞭毛基因?yàn)槔v解一下LAMP相物設(shè)計(jì)的過(guò)程：首先單擊瀏覽按鈕選擇靶基因序列文件，靶序列默認(rèn)的是小于2 2 kbp。支持三個(gè)類型的文件，普通文本格式（僅含序列）, FASTA格式和GenBank 格式文件。第二，從下面三個(gè)選項(xiàng)中選擇定參數(shù)設(shè)定（引物設(shè)計(jì)條件）條件。基于GC含量的自動(dòng)判斷, 起始的參數(shù)是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，則選取AT