微生物遺傳及分子生物學(xué)思考題

1、第五章1.16S rRNA的功能機(jī)制是什么？ 舉例說(shuō)明16S rRNA序列分析在現(xiàn)代微生物學(xué)領(lǐng)域有哪些應(yīng)用（1）16S核糖體RNA（16S ribosomal RNA），簡(jiǎn)稱16S rRNA,是原核生物的核糖體中30S 亞基的組成部分。（2）16S rRNA具有與原核生物核糖體大亞基中的23S rRNA相似的結(jié)構(gòu)決定功能，可作為核糖體蛋白質(zhì)結(jié)合的架構(gòu)；16S rRNA的3'端含有能與mRNA上游AUG起始密碼子通過(guò)氫鍵結(jié)合的反夏因-達(dá)爾加諾序列；16S rRNA能通過(guò)氫鍵與23S rRNA結(jié)合，增強(qiáng)原核生物70S 核糖體一大一小兩個(gè)亞基（50S 亞基與30S 亞基）結(jié)合時(shí)的穩(wěn)定性；16

2、S rRNA能通過(guò)其1,492及1,493的腺嘌呤殘基的N1原子與mRNA骨架上的2'OH基團(tuán)之間產(chǎn)生氫鍵，使核糖體A位密碼子反密碼子的堿基互補(bǔ)配對(duì)穩(wěn)定化；在眾多的生物大分子中，最適合于提示各類生物親緣關(guān)系的是rRNA,尤其是16S rRNA被普遍認(rèn)為是一把好的譜系的“分子尺”這是因?yàn)椋?. rRNA參與生物蛋白質(zhì)的合成過(guò)程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進(jìn)化的漫長(zhǎng)經(jīng)歷中其可能保持不變。2. 在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進(jìn)化距離不同的各類生物。3. 16S rRNA相對(duì)分子質(zhì)量大小適中，便于分析。在5S rR

3、NA、23S rRNA和16S rRNA三種分子中，5S rRNA包含120個(gè)核苷酸，雖然它也可以作為一種信息分子加以利用，但由于其信息量小應(yīng)用上受到限制。23S rRNA蘊(yùn)含著大量的信息，但序列測(cè)量和分析比較的工作量較大。而16S rRNA相對(duì)分子質(zhì)量大小適中（約含1540個(gè)核苷酸）含有比較廣泛的的生物信息量，加上rRNA在細(xì)胞中含量大（約占細(xì)胞中RNA的90%）也易于提取。4. 16S rRNA普遍存著于真核生物和原核生物中，真核生物中其同源分子是18S rRNA。（3） 細(xì)菌分類16S rRNA基因序列分析法鑒定常見(jiàn)的病原細(xì)菌：朱飛舟等人利用16S rRNA 基因序列分析法鑒定了14 種

4、臨床上常見(jiàn)的細(xì)菌，且該方法較生化分析法更加穩(wěn)定，重復(fù)性更好，16S rRNA基因序列分析法可以作為臨床鑒定病原細(xì)菌的一種更有效方法。鑒別難于區(qū)別的細(xì)菌，在細(xì)菌鑒定中, 16 S rRNA 基因序列分析技術(shù)能夠精確到種的水平, 可以用來(lái)鑒定用其他方法難于區(qū)別的細(xì)菌，眾所周知, 草綠色鏈球菌能夠?qū)е滦膬?nèi)膜炎, 但該菌包括了變異鏈球菌、血鏈球菌、唾液鏈球菌、輕型鏈球菌和米勒鏈球, 它們的致病能力差別很大, 因此如果能夠早期鑒定血液中分離細(xì)菌的種類, 對(duì)臨床診斷和預(yù)測(cè)病情均有重要的作用。然而, 這5 種鏈球菌通過(guò)表型分析難于區(qū)分,采用16S rRNA 基因序列分析, 就能快速地鑒定出標(biāo)本中的細(xì)菌種類。

5、鑒定分枝桿菌 分枝桿菌分為人類病原菌、動(dòng)物寄生致病菌和腐物寄生菌3 大類, 形態(tài)、結(jié)構(gòu)類似, 種類繁多, 區(qū)分起來(lái)有一定的困難;同時(shí)致病分枝桿菌大多生長(zhǎng)緩慢、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng), 有的甚至不能培養(yǎng)。因此, 16SrRNA 基因序列分析技術(shù)很快被應(yīng)用于臨床分枝桿菌的鑒定。鑒定微環(huán)境中存在的多種細(xì)菌。在實(shí)際生活中, 很多條件下存在的細(xì)菌都由復(fù)雜群體組成。醫(yī)學(xué)臨床取樣標(biāo)本, 比如口腔菌群或者體內(nèi)插管形成的生物膜上往往有多種細(xì)菌混合生長(zhǎng), 其中包括一些目前還無(wú)法培養(yǎng)的細(xì)菌, 因此很難全面了解特定環(huán)境中細(xì)菌的種類和作用。近年來(lái),人們采用不依賴細(xì)菌培養(yǎng)的方法, 對(duì)生長(zhǎng)在特定微環(huán)境的細(xì)菌進(jìn)行研究, 取得了一定突破。

6、我們可以根據(jù)16S rRNA 序列比較推測(cè)細(xì)菌間的進(jìn)化關(guān)系,研究某一特定環(huán)境中微生物的區(qū)系組成，進(jìn)而了解其種群動(dòng)態(tài)，研究微生物的多樣性。陳澤祥等選取3株不同血清型的鴨疫里氏桿菌廣西分離株GX RA01、GXRA07和GX RA09進(jìn)行16SrRNA 基因序列分析，基于其同源性，表明這3株菌株應(yīng)為鴨疫里氏桿菌。2. 哪些分子生物學(xué)特性使極端嗜熱古菌成為地球上最耐熱的生命形式？（1）基因組：高G+C (60-70% ), 結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，特殊形式的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，DNA反解旋酶，促進(jìn)DNA分子形成正向超螺旋，增強(qiáng)DNA分子的熱穩(wěn)定性；多復(fù)制子及多復(fù)制起始位點(diǎn)，基因組復(fù)制穩(wěn)定性，每個(gè)復(fù)制子多拷貝，生理

7、調(diào)節(jié)及抗損傷的適應(yīng)性；細(xì)胞內(nèi)特殊因子如多胺類物質(zhì)可以促進(jìn)嗜熱菌蛋白質(zhì)與核酸的合成能力，提高核酸的穩(wěn)定性，并對(duì)某些酶具有激活作用。（2）蛋白組：典型的呈酸性的蛋白組，蛋白表面富含酸性氨基酸，可以幫助蛋白周圍形成水化層，增加其可溶性、減少其聚集鹽析的可能，在高K+ 條件下行使正常功能；蛋白亞基之間的相互作用和多聚化，離子對(duì)、疏水相互作用以及鹽橋也可起到穩(wěn)定蛋白的作用。（3）細(xì)胞膜：穩(wěn)定的醚鍵結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量降低，飽和脂肪酸的含量 增加，提高細(xì)胞膜的抗熱能力。（4）特殊代謝途徑，通過(guò)快速合成或替換熱穩(wěn)定性較差的代謝產(chǎn)物（或輔酶）來(lái)提高酶分子的催化效率以及一些特殊的保護(hù)機(jī)制（如微環(huán)境等）

8、來(lái)維持其在高溫條件下的正常代謝活動(dòng)。3 嗜堿微生物通常也嗜鹽，試分析可能的原因 在嗜堿微生物中，主動(dòng)離子運(yùn)輸機(jī)制是PH值穩(wěn)態(tài)機(jī)制的中心，而pH穩(wěn)態(tài)機(jī)制限制了生長(zhǎng)的pH值的上限。有大量的證據(jù)表明，嗜堿菌在堿性pH下生長(zhǎng)時(shí)，胞質(zhì)酸化的獲得是與Na+/H+有關(guān)，對(duì)于嗜堿菌和pH穩(wěn)態(tài)缺乏的非嗜堿突變株的對(duì)比研究表明Na+/H+泵是胞質(zhì)酸化的關(guān)鍵。許多非嗜堿性的突變株都缺乏胞質(zhì)pH的能力。也缺乏Na+/H+泵活性，Na+/H+泵催化胞質(zhì)內(nèi)的Na+排出，同時(shí)外部環(huán)境中的H+進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)。在這個(gè)過(guò)程中胞質(zhì)能被酸化，為了支持pH穩(wěn)態(tài)的連續(xù)性，必須有Na+的重新進(jìn)入作為Na+/H+泵的底物，而Na+的主要來(lái)源是N

9、ACl，因此嗜堿細(xì)菌通常也嗜鹽。4 通過(guò)文獻(xiàn)閱讀，了解古菌復(fù)制過(guò)程中不同階段是如何偶聯(lián)的（文獻(xiàn)） （1） 復(fù)制的起始；復(fù)制起始蛋白識(shí)別復(fù)制原點(diǎn),復(fù)制原點(diǎn)處DNA雙螺旋的解開(kāi)及其它蛋白與OBP(原點(diǎn)結(jié)合蛋白)一DNA復(fù)合物相互作用,參與解旋酶的裝配;2)復(fù)制的延伸:解開(kāi)的DNA單鏈的穩(wěn)定,引物合成,DNA鏈延伸;3)岡崎片段的成熟及復(fù)制的終止:包括去除RNA引物,填充缺口,滯后鏈上岡崎片段的連接"復(fù)制由起始步驟控 制,一旦復(fù)制開(kāi)始,它就會(huì)繼續(xù)下去,直到整個(gè)基因組都被復(fù)制"同時(shí),DNA復(fù)制又是一個(gè)由多種酶參與的代謝過(guò)程,由30種以上的酶和蛋白質(zhì)協(xié)同合作"（2） 復(fù)制起

10、始 在古菌中發(fā)現(xiàn)了許多與真核生物Orcl和Cdc6同源的Cdc6蛋白家族,該類蛋白具有原點(diǎn)識(shí)別、結(jié)合和MCM征募的三重功能，古菌的Orcl/Cdc6蛋白和細(xì)菌的DnaA、真核生物ORC的3個(gè)亞基(Orel、4和5)以及真核生物Cdc6蛋白一樣都屬于AAA+ATPase超家族的一員。除了3個(gè)Methanogeni"古菌外,目前所有基因組測(cè)序的古菌包含1一9個(gè)Orcl/Cdc6蛋白，嗜熱古菌S.solfataricus染色體中鑒定了三個(gè)DNA復(fù)制原點(diǎn)和對(duì)應(yīng)的三個(gè)Orcl/Cdc6同源蛋白:SsoCdc6一l,SsoCde6一2,SsoCde6一3"這三個(gè)Orcl/Cdc6同源蛋

11、白表現(xiàn)出不同的原點(diǎn)DNA結(jié)合活性,這表明它們?cè)趶?fù)制叉上行使不同的功能,同時(shí)它們有可能在延伸過(guò)程中也發(fā)揮一定的作用。（3） DNA復(fù)制的延伸 DNA雙鏈打開(kāi)后,單鏈結(jié)合蛋白SSB很快和暴露的DNA單鏈結(jié)合,從而避免DNA復(fù)制期間單鏈DNA被化學(xué)修飾或被核酸酶降解,防止單鏈DNA重新配對(duì)形成雙鏈DNA,起到保護(hù)單鏈的作用"所有的SSB都是通過(guò)一個(gè)共同的寡核營(yíng)酸/寡聚糖折疊與DNA結(jié)合，DNA聚合酶需要DNA引物酶在模板DNA上合成短的RNA引物后才能合成DNA,真核生物引物酶是四亞基的復(fù)合物引物酶活性需要p48和p58兩個(gè)亞基,其中P48是催化亞基。古菌基因組編碼P48和P58的同源蛋白

12、，似乎古菌的雙亞基引物酶組合了真核生物四亞基復(fù)合物的功能,但是引物酶的保真性差。 DNA復(fù)制是通過(guò)DNA聚合酶以ssDNA為模板合成互補(bǔ)鏈來(lái)完成的。古菌中含有B、D和Y型DNA聚合酶、，它們?cè)趤喕M成和催化特性(如持續(xù)性、保真性和鏈延伸速率等)等方面有區(qū)別,不同的聚合酶參與復(fù)制!修復(fù)和重組等過(guò)程。 生物的DNA聚合酶本身的持續(xù)性都較差,需要與一個(gè)滑夾結(jié)構(gòu)的環(huán)狀蛋白復(fù)合體(pCNA)相互作用從而獲得持續(xù)性。古菌基因組至少編碼一個(gè)PCNA同源蛋白,在S.tokodalii str.7中有3個(gè)PCNA同源蛋白。氨基酸序列、長(zhǎng)度、電荷分布和三聚體的三級(jí)結(jié)構(gòu)方面,古菌與真核生物的pCNA較為相似 在DN

13、A復(fù)制的時(shí)候,復(fù)制叉前后會(huì)分別產(chǎn)生正!負(fù)超螺旋,拓?fù)洚悩?gòu)酶通過(guò)改變DNA連環(huán)數(shù)來(lái)調(diào)節(jié)DNA超螺旋水平。根據(jù)作用機(jī)理,拓?fù)洚悩?gòu)酶可以分成I型和11型兩大類,每種類型又可以分成許多小類，兩大類拓?fù)洚悩?gòu)酶在古菌里都存在,它們不但參與DNA代謝還起到了穩(wěn)定DNA的作用。目5.tokodaiistr.7的拓?fù)洚悩?gòu)酶己經(jīng)得到了結(jié)構(gòu)解析。（4） 岡崎片段的成熟 在DNA復(fù)制的過(guò)程中,先導(dǎo)鏈的復(fù)制是連續(xù)的,而后隨鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的,會(huì)產(chǎn)生一系列的岡崎片斷,需要Flap Endonuclease、RNaseH和DNA連接酶的協(xié)同作用,將這些片斷連接起來(lái)才能產(chǎn)生成熟的雙鏈DNA。 Fen-1是DNA復(fù)制和修復(fù)中的重要蛋

14、白,具有5.側(cè)翼內(nèi)切核酸酶活性和5.-3.外切核酸酶活性"Fen一1的5.一3.外切核酸酶活性加上RNaseH的活性才能使岡崎片斷成熟。古菌的Fen一1在氨基酸序列和生化特性方面都類似于真核生物。 所有生物體內(nèi)都有RNaseH,能夠特異降解RNA一DNA雜交體中的RNA。RNaseH主要分為I型和11型兩大類，古菌里只含有11型RNaseH,其結(jié)構(gòu)和生化特性方面與細(xì)菌和真核生物的類似,因此,RNaseH的功能可能在所有生物中都很保守。5 比較古菌和真核生物遺傳的異同，了解古菌相關(guān)機(jī)制研究對(duì)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的意義（文獻(xiàn)）相同點(diǎn)：（1）復(fù)制過(guò)程 有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)；都需要轉(zhuǎn)率起始復(fù)合物；都會(huì)形成

15、復(fù)制叉；轉(zhuǎn)率過(guò)程中都會(huì)有單鏈結(jié)合蛋白，DNA聚合酶，引發(fā)酶等因子，古菌與真核細(xì)胞的復(fù)制基本相同。（2）轉(zhuǎn)錄過(guò)程6 如果要人工合成1個(gè)單細(xì)胞生命的基因組，在基因組有效復(fù)制分配方面需要考慮哪些因素基因組復(fù)制是生命得以遺傳與繁衍的關(guān)鍵，而復(fù)制起始及其調(diào)節(jié)則是這一生命過(guò)程的關(guān)鍵。保證與復(fù)制有關(guān)的酶系的完整，例如引物酶催化RNA引物的合成，起始復(fù)合物促進(jìn)復(fù)制叉的形成、單鏈DNA結(jié)合蛋白維持DNA的單鏈狀態(tài)，RNA引物的切除和缺口的填補(bǔ)，后隨鏈上岡崎片段的連接，以及有效的終止子，為保證DNA擴(kuò)增的保真性，其DNA聚合酶還應(yīng)該有3-5外切酶活性等，真核細(xì)胞DNA復(fù)制過(guò)程較為復(fù)雜，可選擇古菌或者細(xì)菌的復(fù)制機(jī)器

16、，另外為了保證復(fù)制的效率可以在基因組中加入多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，有重組酶保證即使DNA在復(fù)制過(guò)程中即使發(fā)生重組也能分離成單個(gè)DNA分子；生物體遭受各種內(nèi)外因素的損傷是無(wú)法避免的，因此還必須存在DNA的損傷修復(fù)機(jī)制；DNA復(fù)制完成后要平均分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中，可以利用細(xì)菌的par系統(tǒng)和古菌的seg系統(tǒng)，要保證有類似著絲粒的DNA結(jié)構(gòu)存在，保證與分配有關(guān)的蛋白質(zhì)與DNA的特異性結(jié)合，有調(diào)控細(xì)胞分裂的基因并且保證分裂完成后分配系統(tǒng)能與基因組解離。7 查閱文獻(xiàn)，詳細(xì)描述一種古菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法，理解各個(gè)步驟的意義和注意事項(xiàng)（課件14 嗜鹽古菌遺傳轉(zhuǎn)化方法）8 如何設(shè)計(jì)基因敲除等相關(guān)實(shí)驗(yàn)分別證明一個(gè)基因是非必

17、需的，是重要的，或者是必不可少的 證明一個(gè)基因是非必需還是重要的還是必不可少的，首先就要構(gòu)建一個(gè)敲除載體，先把該目的基因敲除。就是說(shuō)，現(xiàn)擴(kuò)增出目的基因的上下游同源臂，構(gòu)建出一個(gè)質(zhì)粒敲除載體，然后將質(zhì)粒載體導(dǎo)入到野生型細(xì)胞中，誘導(dǎo)其發(fā)生同源重組，進(jìn)行一次交換，隨后進(jìn)行雙交換，從而成功的敲除目的基因，獲得突變株。若該基因敲除后，單獨(dú)敲除該目標(biāo)基因的突變株仍然能夠合成該物質(zhì)，那么可以說(shuō)明，該基因編碼的物質(zhì)可以由多種途徑合成或者有編碼該產(chǎn)物的同源基因，說(shuō)明該基因是非必需的，否則該基因可能是重要的或者必不可少的。若敲除該基因后，其編碼物質(zhì)不能合成，并且嚴(yán)重影響到突變株的生命活動(dòng)以及代謝，那么該基因是必不

18、可少的。但是若突變株只是該基因編碼的物質(zhì)減少，但不會(huì)過(guò)多影響其代謝及生命活動(dòng)，那么可以說(shuō)該基因是重要的。 Eg. 解析尋找嗜鹽古菌PHBV合成關(guān)鍵酶：-酮硫解酶PhaA/BktB 。生物信息分析表明, 地中海富鹽菌編碼8種-酮硫解酶同源蛋白；但單獨(dú)基因敲除后仍能合成PHA；推測(cè)存在功能冗余、PhaA和BktB由不同基因編碼。 通過(guò)組合基因敲除互補(bǔ)發(fā)現(xiàn)PHBV特異的-酮硫解酶 。通過(guò)組合基因敲除確定HFX1023和HFX6004功能； 通過(guò)對(duì)4基因敲除進(jìn)行互補(bǔ)，確定了HFX1022和HFX6003功能； 這是在所有生物中首次發(fā)現(xiàn)具大小亞基結(jié)構(gòu)的PHA合成特異的-酮硫解酶。9試述說(shuō)明甲烷古菌、嗜鹽

19、古菌、高溫古菌的特色及研究意義 相對(duì)于細(xì)菌，古菌在遺傳信息處理系統(tǒng)方面與真核生物同源，代表古菌-真核生物進(jìn)化分支的基本特性。極端古菌的極端適應(yīng)性和獨(dú)特代謝能力為生命機(jī)制及生物技術(shù)提供了新的途徑和策略。 （1）甲烷古菌：厭氧培養(yǎng)，遺傳轉(zhuǎn)化相對(duì)較困難，胞內(nèi)環(huán)境中性，可借用細(xì)菌一些基因元件，但復(fù)制子及抗生素選擇標(biāo)記等不同于細(xì)菌。 甲烷古菌的研究意義： 甲烷是重要的可再生能源： 天然氣:人類利用甲烷燃?xì)庥?000多年的歷史； “西氣東輸工程”重要?dú)庠磪^(qū)之一柴達(dá)木盆地天然氣資源儲(chǔ)量2.5萬(wàn)億M3 沼氣發(fā)酵：有機(jī)廢物資源化的可再生能源, 甲烷為分解代謝的末端產(chǎn)物。 甲烷古菌的發(fā)現(xiàn)對(duì)生命科學(xué)的貢獻(xiàn) ：190

20、6年Beijerinck實(shí)驗(yàn)室描述了第一個(gè)甲烷菌Methylomonas methanica; 1940年Barker分離到第一個(gè)甲烷菌； 1976年分析甲烷菌的SSU rRNA、發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜含醚鍵酯：Carl Woese提出第三生命域-古菌理論的基礎(chǔ)； 1970s，發(fā)現(xiàn)甲烷菌的獨(dú)特的酶和輔酶：甲基CoM還原酶，F(xiàn)420, F430, CoM,甲烷呋喃，四氫甲烷喋呤；及特殊的金屬離子：鈷、鎢、鎳、錳； 1996年第一個(gè)古菌基因組-甲烷古菌，確立第三生命域； 2000s發(fā)現(xiàn)甲烷古菌利用低限能量生長(zhǎng)、利用22種氨基酸合成蛋白質(zhì)（2）嗜鹽古菌：中溫培養(yǎng)，好氧，原生質(zhì)體較好制備，容易遺傳轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒豐富，

21、但胞內(nèi)高鹽，需研發(fā)自己的遺傳操作體系。嗜鹽古菌的研究特色和意義 1) 嗜鹽古菌作為古菌生物學(xué)研究的重要材料，一個(gè)突出的優(yōu)勢(shì)在于相對(duì)最容易培養(yǎng)，生長(zhǎng)較快，不容易污染和被污染，且具豐富的遺傳與代謝多樣性，并具有古菌域中最完善的遺傳操作系統(tǒng)。 2) 嗜鹽古菌具有獨(dú)特的鹽適應(yīng)機(jī)制和功能物質(zhì)，因其制備的方便性和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，為現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展和生物技術(shù)的進(jìn)步起到了重要的推動(dòng)作用。如死海鹽合菌（Haloarcula marismortui)核糖體的解析，催生了2009年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；而嗜鹽古菌膜蛋白的研究，不僅代表著跨膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究的最高水平，還正在促進(jìn)一系列光化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用；嗜鹽古菌PHA的研究

22、則為生物塑料的生產(chǎn)提供了新的策略。 3) 嗜鹽古菌是地球上生命進(jìn)化的一個(gè)獨(dú)特分支，即所有極端嗜鹽古菌處于同一個(gè)綱，但同時(shí)基因組存在廣泛多樣性，是研究物種形成和演化的重要材料。 4) 嗜鹽古菌對(duì)飽和鹽濃度，輻射等的極端適應(yīng)能力，具體地外（如火星）生命的可能特質(zhì)，因此也是研究地外生命起源，傳播的重要材料。 （3）高溫古菌：易于生化分析，但平板培養(yǎng)及遺傳操作較困難，還需研發(fā)合適的抗生素標(biāo)記等。 高溫古菌研究意義：嗜熱古菌的研究對(duì)生命科學(xué)的貢獻(xiàn) ：嗜熱古菌具有特殊的機(jī)制（如正超螺旋）穩(wěn)定其基因組；同時(shí)具有熱穩(wěn)定蛋白，因此是耐熱蛋白和工具酶的很好的來(lái)源，如應(yīng)用于PCR的Pfu酶。 10 理解引發(fā)適應(yīng)機(jī)制

23、對(duì)CAISPR系統(tǒng)對(duì)抗病毒逃逸機(jī)制的重要意義適應(yīng)需要某一匹配病毒DNA 的spacer 。適應(yīng)過(guò)程需要被某一spacer引發(fā)至同源的外源DNA。因此CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)抗病毒逃逸方面有重要作用與意義。（1）回答了Nature (2012)關(guān)于CRISPR適應(yīng)的第一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，即為什么很難觀察到實(shí)驗(yàn)室菌株CRISPR對(duì)特定天然病毒的適應(yīng)過(guò)程（因通常缺乏引發(fā)spacer)。（2）同時(shí)也解釋了實(shí)驗(yàn)室觀察到的極個(gè)別高效適應(yīng)（通過(guò)引發(fā)可將適應(yīng)機(jī)器高效導(dǎo)向外源DNA）和在自然環(huán)境中的可能需要的廣泛的適應(yīng)性（引發(fā)spacer無(wú)需嚴(yán)格匹配，可導(dǎo)向一大類同源病毒，并可通過(guò)次生spacer級(jí)聯(lián)放大至更多其它

24、病毒)。（3）在一定程度上為回答CRISPR適應(yīng)過(guò)程如何區(qū)分異己DNA提供了線索。 干擾與適應(yīng)的異己識(shí)別工作的意義：（4）建立并統(tǒng)一了CRISPR適應(yīng)與干擾過(guò)程的異己識(shí)別模型。利用該機(jī)制，對(duì)發(fā)生突變的病毒也可迅速獲取新的spacer, 重啟干擾過(guò)程。 （5）利用該機(jī)制，宿主菌貯存一定數(shù)量的spacer, 即可通過(guò)級(jí)聯(lián)識(shí)別環(huán)境中病毒的同源序列，迅速適應(yīng)環(huán)境中的其它病毒。 （6）理解為什么不受控制原生適應(yīng)必需被沉默掉的客觀實(shí)事: 傷害宿主。 11 文獻(xiàn)閱讀：了解CAISPR-cas系統(tǒng)抗病毒與質(zhì)粒之外的其他生理功能，相關(guān)研究進(jìn)展及態(tài)勢(shì)（見(jiàn)文獻(xiàn)）12 CRISPR在現(xiàn)代微生物技術(shù)中的應(yīng)用（1）CRI

25、SPR/Cas9 系統(tǒng)在基因組DNA 片段編輯中的應(yīng)用：型CRISPR/Cas 系統(tǒng)只需要一個(gè)Cas9 蛋白核酸酶來(lái)切割DNA 雙鏈,即為現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)基因編輯的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在基因組DNA 片段靶向編輯方面的研究和應(yīng)用，主要包括DNA 片段的刪除、反轉(zhuǎn)、重復(fù)、插入和易位，這一有效的DNA 片段編輯方法為研究基因功能、調(diào)控元件、組織發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展提供了有力手段。DNA 片段靶向刪除：研究基因和調(diào)控元件的功能，可以通過(guò)刪除這一段DNA 片段來(lái)進(jìn)行探索。2013 年，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被應(yīng)用到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，張鋒團(tuán)隊(duì)和Church 團(tuán)

26、隊(duì)發(fā)現(xiàn)位于同一條染色體上的兩個(gè)sgRNAs 對(duì)DNA 雙鏈進(jìn)行操作時(shí)，在獲得定點(diǎn)突變的同時(shí)，也存在DNA 片段刪除的情況。張鋒團(tuán)隊(duì)在EMX1 位點(diǎn)設(shè)計(jì)的相距119 bp 的兩個(gè)靶向sgRNAs 對(duì)該119 bp DNA 片段進(jìn)行了刪除。DNA 片段靶向反轉(zhuǎn)：吳強(qiáng)團(tuán)隊(duì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和小鼠中對(duì)DNA 片段反轉(zhuǎn)進(jìn)行了詳盡的研究。他們?cè)诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中對(duì)709 bp1 Mb 的7 個(gè)不同長(zhǎng)度的DNA 片段進(jìn)行了有效地反轉(zhuǎn)(圖1B)；同時(shí)他們將Cas9 mRNA 和兩個(gè)靶向sgRNAs 注射到小鼠受精卵中，再將被注射后存活的受精卵移植到假孕鼠中獲得后代，篩選得到了反轉(zhuǎn)的嵌合小鼠，對(duì)960 bp30kb 的

27、不同長(zhǎng)度的3 個(gè)DNA 片段進(jìn)行了反轉(zhuǎn)，并且獲得了反轉(zhuǎn)事件的嵌合小鼠并實(shí)現(xiàn)DNA 片段反轉(zhuǎn)的種系傳代，成功獲得了F1 代反轉(zhuǎn)小鼠。DNA 片段靶向重復(fù)：在小鼠中能夠通過(guò)基因打靶和跨等位基因重組的方法獲得靶向DNA片段重復(fù)，但操作難度大，且效率偏低。Kraft等在小鼠ESCs 中，通過(guò)Cas9 和兩個(gè)靶向sgRNAs對(duì)從1.1 kb1.6 Mb 之間的6 個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行操作，在其中4 個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到DNA重復(fù)事件的存在，然后將具有DNA 片段重復(fù)事件的克隆進(jìn)行培育以獲得嵌合體小鼠。盡管利用CRISPR/cas9 系統(tǒng)進(jìn)行DNA 片段靶向重復(fù)研究才剛剛起步，效率還有待提高。DNA 片段靶向插入：麻省

28、理工學(xué)院張鋒團(tuán)隊(duì)在EMX1 位點(diǎn)利用Cas9 切口酶形成的DNA 切口或Cas9 形成的DNA雙鏈斷裂都可以有效地介導(dǎo)同源重組(HR)來(lái)插入包含兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的DNA 片段。染色體靶向易位：染色體易位常常與腫瘤發(fā)生有著密不可分的關(guān)系，因此染色體易位的研究對(duì)于人們認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)病機(jī)理尤為重要。例如，在慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)生發(fā)展中， 染色體易位造成了費(fèi)城染色體形成，它能夠編碼BCR-ABL 融合蛋白產(chǎn)生白血病。在不同的染色體上引入同時(shí)出現(xiàn)的DSBs 是引發(fā)染色體易位必不可少的環(huán)節(jié)之一。利用I-Sce I 或鋅指核酸酶(ZFN)在染色體的特定位點(diǎn)引入DSBs 從而引發(fā)染色體易位。自CRISPR 技術(shù)

29、出現(xiàn)以來(lái)，因其高效、便捷、易操作等特性，已有不少科研團(tuán)隊(duì)將其應(yīng)用于染色體易位的相關(guān)研究。（2） CRISPR-Cas9 在抗病毒工程菌中應(yīng)用：Barrangou 等將嗜熱鏈球菌與不同的噬菌體共培養(yǎng)，篩選具有噬菌體抗性的菌株，通過(guò)DNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn)CRISPR 座位中有了新的間隔序列，該間隔序列來(lái)自侵染的噬菌體，并且證實(shí)了CRISPR 和其相關(guān)的cas 基因賦予了細(xì)菌對(duì)噬菌體的抗性，通過(guò)插入或刪除靶向噬菌體的間隔序列可增強(qiáng)或者削弱細(xì)菌的噬菌體抗性。總之，CRISPRCas9是細(xì)菌的一種“獲得性免疫系統(tǒng)”。13 CRISPR-Cas9技術(shù)目前需解決的關(guān)鍵問(wèn)題是克服其脫靶現(xiàn)象，請(qǐng)了解相關(guān)研究進(jìn)展并提出

30、解決方案（1）雖然普通質(zhì)粒很多時(shí)候也能達(dá)到實(shí)驗(yàn)效果，但是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具有效率低，作用時(shí)間短暫性等缺點(diǎn)。病毒的出現(xiàn)解決了質(zhì)粒這些問(wèn)題，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用質(zhì)粒見(jiàn)addgene，慢病毒可以整合入宿主基因組中，長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)（漢恒生物提供CRISPR/cas9慢病毒包裝），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比較大（大于4kb），且長(zhǎng)期插入可能導(dǎo)致亂切，脫靶等，同時(shí)慢病毒包裝最終獲得的滴度不高等原因，腺病毒更有優(yōu)勢(shì)，腺病毒克隆能力強(qiáng)，獲得的病毒滴度也高。同時(shí)相對(duì)于普通質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，作用是時(shí)間也比較長(zhǎng)，可以達(dá)到更理想的敲除效果。（2）Cas9 存在一定的脫靶效應(yīng)：Ran 等在小

31、鼠受精卵中通過(guò)4 個(gè)靶向sgRNAs 在Cas9 切口酶作用下實(shí)現(xiàn)DNA 片段的刪除，他們?cè)贒YRK1A 位點(diǎn)處成功地嘗試了5006000 bp DNA 片段的刪除。這種方法需要設(shè)計(jì)多一倍的靶向sgRNAs，雖然會(huì)減少脫靶率，但是多個(gè)sgRNAs 也可能引起復(fù)雜的組合型DNA 片段編輯。總之，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)DNA 片段的靶向刪除(圖1A)，盡管這一技術(shù)還有待進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)展。第四章1 結(jié)合大腸桿菌（致病和非致?。┑募?xì)胞結(jié)構(gòu)特征及生物大分子的生物合成規(guī)律，簡(jiǎn)述若干種藥物研發(fā)的策略。 藥物研發(fā)策略：生產(chǎn)某種物質(zhì)，綜合策略： 拓展底物利用能力和范圍（“進(jìn)”） 加快產(chǎn)物轉(zhuǎn)到胞外

32、（“出”） 加強(qiáng)目標(biāo)合成酶活性（“加”） 減少分支合成途徑（“減”） 引入新的合成途徑，或延伸已有途徑（“增”） 改善細(xì)胞的耐受性定向遺傳修飾利用大腸桿菌合成相關(guān)藥物：（1）大腸桿菌產(chǎn)生蛋白類藥物 ：優(yōu)先選用的蛋白藥物表達(dá)宿主，即利用上述的策略來(lái)進(jìn)行定向遺傳改造而合成蛋白類藥物。首先，利用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源質(zhì)粒，構(gòu)建包含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒載體，也可以將其導(dǎo)入到大腸桿菌中通過(guò)同源重組過(guò)程整合到其染色體上進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。我們可以改進(jìn)大腸桿菌的分泌系統(tǒng)，從而加速其產(chǎn)生的生物大分子蛋白質(zhì)排除體外的效率。從而合成生物大分子蛋白質(zhì)類藥物。（2）大腸桿菌細(xì)胞高產(chǎn)抗癌藥物前體-紫杉醇(taxol)前體t

33、axadiene。Taxol是萜類化合物（三環(huán)二萜），含異戊二烯類單元。天然的大腸桿菌的MEP途徑可合成其中2個(gè)前體異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。因此，上游模塊：增加整個(gè)MEP途徑的拷貝數(shù)；在染色體中引入T7 RNA 聚合酶，并在限速酶前引入T7啟動(dòng)子；通過(guò)不同質(zhì)粒的引入和改變啟動(dòng)子強(qiáng)度來(lái)協(xié)調(diào)不同基因的拷貝數(shù)以及表達(dá)量；將合成酶基因整合到染色體上，減小代謝負(fù)擔(dān)。下游模塊：改變GGPS和TS兩個(gè)合成基因的順序；通過(guò)啟動(dòng)子更換以及改造，協(xié)調(diào)基因的表達(dá)量；去除代謝抑制子indole。多位點(diǎn)協(xié)調(diào)上下游兩個(gè)模塊，使前體生物大分子taxadiene的產(chǎn)量提高了約15000倍，達(dá)

34、到1.0 g/L 。（3）輔因子工程：降低細(xì)胞內(nèi)的能量水平能顯著提高酵解速度。ATP, NADH/NAD+, NADPH/NADP+等輔因子參與很多重要胞內(nèi)代謝過(guò)程，其水平及比例可導(dǎo)致微生物代謝及生理發(fā)生全局變化。與生物大分子的合成相關(guān)， NADPH/NADP+增加有利于生物大分子的合成。厭氧高產(chǎn)正丁醇 還原力驅(qū)動(dòng)：產(chǎn)生1*丁醇需要4*還原力改造方法：敲除3個(gè)消耗NADH的途徑，使NADH的含量為4； 敲除產(chǎn)生乙酸的途徑，節(jié)約了1分子前體乙酰輔酶A。綜合改造后生物大分子的產(chǎn)量提高了100多倍。作用于致病大腸桿菌的藥物的研發(fā)：（4）外排泵的抑制子作為潛在的藥物靶標(biāo)：TetR類抑制子控制本底水平的

35、外排泵AcrA和AcrB的表達(dá)； AraC類的激活子能解除TetR的抑制，使外排泵大量表達(dá)； MarR類的抑制子能夠抑制AraC的轉(zhuǎn)錄，間接影響外排泵表達(dá)?？股鼗蛐》肿优c抑制子結(jié)合，減弱其與靶標(biāo)DNA的結(jié)合，從而解除其對(duì)激活子抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)下游外排泵的高表達(dá)。從以上的外排泵的調(diào)控方式可以知道，抑制子能夠減弱外排泵的表達(dá)，從而降低菌株對(duì)藥物的耐受性，使其容易被殺死。例如，篩選能夠結(jié)合抑制子RamR的小分子（藥物），使其對(duì)激活子RamA的抑制作用加強(qiáng)，從而降低外排泵的表達(dá)而降低細(xì)菌的抗性。由RamR和小分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵殘基Phe155，從而有助于篩選與其結(jié)合的潛在藥物。（5）轉(zhuǎn)肽酶：這

36、些酶大多是藥物的潛在作用靶點(diǎn)，對(duì)其結(jié)構(gòu)-功能的研究是熱點(diǎn)。例如，青霉素可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合轉(zhuǎn)肽酶，導(dǎo)致肽橋不能形成而抑制 細(xì)胞生長(zhǎng)。從而可以篩選其他可以與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合的藥物來(lái)開(kāi)發(fā)新藥物。（6）抗生素作用的靶標(biāo)或抗性菌株突變的位點(diǎn)：例如，萬(wàn)古霉素作用位點(diǎn)為雙丙氨酰，抑制細(xì)胞壁的合成 而其對(duì)應(yīng)的耐藥菌株末尾的丙氨酸突變?yōu)槿樗帷?2 Bacillus cereus group的概念，包括哪些種？簡(jiǎn)述種內(nèi)間的聯(lián)系與區(qū)別。(1)Bacillus cereus group均為能夠形成孢子的菌株，基因及基因組序列數(shù)據(jù)顯示其種間密切相關(guān)，即染色體具有很高的的相似性和共線性，甚至被認(rèn)為屬于相同的種，其包含6個(gè)不同的種：(

37、2)B. cereus sensu stricto: 狹義的蠟狀芽孢桿菌，廣泛存在于土壤中，能引起食品污染，導(dǎo)致人類嘔吐和腹瀉，并且有些菌株能引起軟組織感染的機(jī)會(huì)致病菌。B. anthracis: 可引起炭疽熱，被用于生物武器； B. thuringiensis: 能產(chǎn)生殺蟲(chóng)晶體蛋白，被用作重要的微生物殺蟲(chóng)劑； B. mycoides: 腐生細(xì)菌，能夠形成根狀菌落； B. pseudomycoides與B. weihenstephanensis: 放射狀的菌落形態(tài)，脂肪酸的組成與群中其他菌不同； B. cytotoxicus: 最新從蠟狀芽孢桿菌中分離出來(lái)，主要與食物中毒有關(guān)，在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上

38、與蠟狀芽孢桿菌群里其他成員較遠(yuǎn)。(3)Bacillus cereus group種間聯(lián)系與區(qū)分： 雖然Bacillus cereus group種間染色體具有很高的相似性和共線性，但是其包含幾百個(gè)菌株，也顯示了很高的基因異質(zhì)性及菌株特異的基因組適應(yīng)性，比如有些蠟狀芽胞桿菌具有跟炭疽芽胞桿菌類似的特征，包括其致病性，但是并不含有與后者完全一樣的質(zhì)粒。 蠟狀芽孢桿菌群種間的區(qū)分依據(jù)： 一般蠟狀芽胞桿菌群不同種之間的主要區(qū)分標(biāo)志是其表型，特別是對(duì)于B. cereus sensu stricto，B. anthracis，B. thuringiensis，這些表型的差異往往由位于質(zhì)粒上的遺傳物質(zhì)所決定

39、： 炭疽芽孢桿菌引起炭疽熱的毒力因子基因主要位于兩個(gè)大質(zhì)粒上，pXO1和pXO2，這兩個(gè)質(zhì)粒對(duì)于炭疽芽胞桿菌的致病至關(guān)重要,也是其區(qū)別于其他成員的主要特征。蘇云金芽胞桿菌主要特征是在芽胞形成的同時(shí)產(chǎn)生伴胞晶體即-內(nèi)毒素,而編碼這些晶體蛋白的基因主要位于質(zhì)粒上。蠟狀芽胞桿菌合成嘔吐毒素的基因位于一個(gè)大質(zhì)粒上。 B. cereus group中的質(zhì)粒是非常重要的形態(tài)因子，如B. thuringiensis的晶體毒蛋白基因與B. anthracis的炭疽毒素基因均位于質(zhì)粒元件上。B. cereus group中，質(zhì)粒普遍存在，單個(gè)菌種可能含有6個(gè)不同的質(zhì)粒。質(zhì)粒大小變化也很大，從2kb到大于600k

40、b，且不同菌株的質(zhì)粒譜型并不總與其系統(tǒng)發(fā)育相匹配。在B. cereus群的進(jìn)化過(guò)程中，質(zhì)粒是染色體的延伸，質(zhì)粒和染色體之間基因交換頻繁，有利于菌株得以生存于不同的多變的環(huán)境之中。3 簡(jiǎn)述芽孢桿菌孢子形成過(guò)程中主要的調(diào)控因子SPOOA的激活過(guò)程，以及各階段基因是如何實(shí)現(xiàn)時(shí)空特異性表達(dá)的。（見(jiàn)文獻(xiàn)）DNA 結(jié)合蛋白Spo0A 是細(xì)胞從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期進(jìn)入芽孢形成時(shí)期的關(guān)鍵應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白。當(dāng)形成芽孢的條件適宜, 一定量的Spo0A 通過(guò)磷酸傳遞過(guò)程被磷酸化。然后, 逐漸增多的Spo0A-PO4和H 一起, 起始芽胞的形成 。該磷酸傳遞過(guò)程涉及5 種激酶:KinA 、KinB 、KinC、KinD 和KinE

41、, 當(dāng)受到某種刺激因素作用時(shí), 它們會(huì)自磷酸化, 然后把它們的磷酸基團(tuán)傳遞給調(diào)控蛋白Spo0F, 磷酸轉(zhuǎn)移酶Spo0B 再將Spo0F-PO4 的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給Spo0A。磷酸傳遞也會(huì)受到負(fù)調(diào)控, 如磷酸酯酶Spo0E、YisI 和YnzD 能使Spo0A 去磷酸化, RapA、RapB 和RapE 能使Spo0F 去磷酸化。4簡(jiǎn)述芽孢桿菌感受態(tài)形成過(guò)程中關(guān)鍵調(diào)控子ComK的作用（降解及釋放的過(guò)程） 感受態(tài)的形成主要包括三個(gè)過(guò)程：群感效應(yīng)系統(tǒng)，主要調(diào)控子ComK的激活，ComK激活下游感受態(tài)相關(guān)基因。 在B. subtilis感受態(tài)形成過(guò)程中DNA結(jié)合、攝取及重組相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄都是受到感受態(tài)調(diào)

42、控子ComK的調(diào)控，ComK直接或間接調(diào)控的基因多達(dá)100個(gè)。1 ComK的自激活循環(huán)ComK的自激活循環(huán)是形成感受態(tài)的關(guān)鍵步驟，ComK以二聚體組成的四聚物形式結(jié)合于各啟動(dòng)子上，激活下游基因轉(zhuǎn)錄，包括自身基因。2 ComK的抑制： ComK在自激活循環(huán)后，轉(zhuǎn)錄被激活并翻譯ComK，但是合成的ComK與MecA結(jié)合， MecA募集ComK結(jié)合到蛋白酶ClpCP，使ComK被降解，從而無(wú)法調(diào)控感受態(tài)的形成。3 ComK的釋放： 群感效應(yīng)信號(hào)分子ComX及CSF可以促使ComAP的水平升高， ComAP能夠促進(jìn)表面活性素surfactin基因簇的轉(zhuǎn)錄，而位于此基因簇上的comS同時(shí)被轉(zhuǎn)錄。ComS

43、是46個(gè)氨基酸的小肽，可以與MecA結(jié)合使ComK從ComK / MecA /ClpC復(fù)合物上釋放，而ComS及MecA被ClpCP降解。 4 ComK激活下游基因：當(dāng)ComK濃度足夠高，ComK可激活DNA攝取基因（comC,-E,-G,-F)、DNA整合基因（recA，addAB）及自身基因comk的表達(dá)。綜上所述，ComK在感受態(tài)的形成過(guò)程中起到了承上啟下的作用。5簡(jiǎn)述乳酸菌的益生機(jī)制（見(jiàn)課件）6 簡(jiǎn)述細(xì)菌素生物合成的調(diào)控方式1. 合成調(diào)控因子不在相關(guān)生物合成基因簇上。如Lacticin的合成調(diào)控。2. 單組分調(diào)控因子。如單組分調(diào)控因子參與細(xì)菌素的合成調(diào)控，雙組份羊毛硫細(xì)菌素Lactic

44、in3147的生物合成受單組分調(diào)控因子LtnR控制，LtnR是表達(dá)抑制因子，它在細(xì)胞中表達(dá)抑制了免疫基因啟動(dòng)子下游報(bào)告基因的表達(dá)。3. 多組分調(diào)控系統(tǒng)。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的ppGpp低水平誘導(dǎo)mibR表達(dá)，MibR激活mibABCDTUV的低水平轉(zhuǎn)錄，形成非成熟或低活性的lantibiotic.lantibiotic分泌至胞外與MibW結(jié)合，釋放MibX誘導(dǎo)mibR高表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)mibABCDTUV的高水平轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生成熟的lantibiotic。4. 雙組份調(diào)控系統(tǒng)。雙組份系統(tǒng)是微生物感知并相應(yīng)環(huán)境信號(hào)的主要調(diào)控方式之一，通常由組氨酸激酶和相應(yīng)的調(diào)控因子-應(yīng)答調(diào)節(jié)物組成。如Bovici

45、n HJ50合成相關(guān)的雙組分調(diào)控系統(tǒng)7 簡(jiǎn)述新型細(xì)菌素的挖掘方法1. 依賴細(xì)菌培養(yǎng)的方法1）傳統(tǒng)的抑菌圈法。發(fā)酵液離心過(guò)濾，上清液點(diǎn)圈，在指示菌平板上篩選新型細(xì)菌素。2）高通量的篩選方法。發(fā)酵液離心過(guò)濾，上清液加入指示菌的96或64孔板中，指示菌培養(yǎng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)菌的濃度，篩選新型細(xì)菌素2. 通過(guò)將已知的細(xì)菌素進(jìn)行突變，篩選活性升高或抑菌譜增加的突變體?；蚪M數(shù)據(jù)搜索的方法：基因組對(duì)比篩選。如Bovicin HJ50-like 前肽的基因組挖掘。 抑菌圈法：即水平擴(kuò)散法基本原理是在已接種供試菌的瓊脂培養(yǎng)基上施以少量抗菌性物質(zhì)或殺菌劑，使之接觸培養(yǎng)基和病菌，經(jīng)定溫培養(yǎng)一定時(shí)間后，因藥劑的滲透擴(kuò)散作

46、用，施藥部位周圍因殺死了病菌而抑制了其在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)，從而產(chǎn)生了抑菌圈。在一定范圍內(nèi)，抑菌圈直徑的平方或面積與藥劑濃度的對(duì)數(shù)呈直線函數(shù)關(guān)系，從而可比較供試樣品殺菌活性大小。其最大優(yōu)點(diǎn)是精確度高，操作簡(jiǎn)單，能較快得出結(jié)果。但測(cè)定結(jié)果受藥劑溶解性和擴(kuò)散能力影響很大，具一定局限性。根據(jù)藥劑施加在瓊脂培養(yǎng)基表面方式不同，又分為管碟法（牛津杯法）、濾紙片法、孔碟法、滴下法等，其中以管碟法和濾紙片法應(yīng)用最廣。第3章1調(diào)控基因在抗生素生物合成中有何主要功能 抗生素生物合成基因簇一般由調(diào)控基因、結(jié)構(gòu)基因和相關(guān)抗性基因組成，而且這些基因總是成簇排列。在抗生素生物合成中調(diào)控基因起到了一個(gè)開(kāi)關(guān)的作用, 它可決定一

47、種抗生素能否被合成、什么時(shí)候合成和什么時(shí)候被終止的精細(xì)調(diào)控作用。（1）抗生素生物合成的途徑特異性調(diào)控：鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇通常成簇排列，包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)控基因，一般只負(fù)責(zé)調(diào)控所在基因簇基因表達(dá)的調(diào)控稱之為途徑特異性調(diào)控。途徑特異性調(diào)控蛋白如SARP蛋白，SARP蛋白都含有OmpR類的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，通過(guò)招募RNA聚合酶到靶基因的啟動(dòng)子上游激活基因的轉(zhuǎn)錄。大多數(shù)SARP蛋白都是途徑特異性調(diào)控子，一般只調(diào)控與其相鄰的基因。（2）全局性調(diào)控：相對(duì)于鏈霉菌次級(jí)代謝中的其他調(diào)控模式而言，全局調(diào)控是一種更為多樣、普遍、復(fù)雜的調(diào)控模式。全局調(diào)控基因可以調(diào)控多條次級(jí)代謝途徑。全

48、局性調(diào)控蛋白對(duì)抗生素生物合成的調(diào)控通常是通過(guò)直接或間接地調(diào)控途徑特異性調(diào)控蛋白實(shí)施的。而除了調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成外，很多全局調(diào)控蛋白還控制著鏈霉菌的形態(tài)分化，還有一些能夠調(diào)控初級(jí)代謝，并成為初級(jí)代謝向次級(jí)代謝轉(zhuǎn)換的媒介。Eg. 雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、AdpA（3）抗生素生物合成的自調(diào)控-反饋調(diào)控和前饋調(diào)饋：（抗生素介導(dǎo)的自調(diào)控）反饋調(diào)控: 指一種微生物代謝反應(yīng)的終產(chǎn)物在代謝合成過(guò)程中對(duì)合成基因簇中調(diào)控基因或生化反應(yīng)關(guān)鍵酶基因的調(diào)控 (如抗生素)。前饋調(diào)控：指一種微生物代謝反應(yīng)的底物或中間物在代謝合成過(guò)程中對(duì)合成基因簇中調(diào)控基因或生化反應(yīng)關(guān)鍵酶基因的調(diào)控。 抗生素作為終產(chǎn)物介導(dǎo)的自調(diào)控系統(tǒng)可

49、取代雙組分系統(tǒng)中通過(guò)磷酸化作用的應(yīng)答調(diào)控機(jī)制，并證明這種新調(diào)控機(jī)制在微生物次級(jí)代謝生物合成中是廣泛存在的。2 鏈霉菌信號(hào)分子有哪幾種類型, GBL類型的信號(hào)分子在抗生素生物合成中如何發(fā)揮其功能? 菌群群體反應(yīng)感應(yīng)信號(hào)分子-當(dāng)信號(hào)分子達(dá)到閾值-啟動(dòng)特定基因表達(dá)-改變和協(xié)調(diào)細(xì)胞間行為使群體呈現(xiàn)某種生理特征。（1）鏈霉菌信號(hào)分子的類型： 高絲氨酸內(nèi)酯(HSL)、自誘導(dǎo)肽(AIP)、AI-2、-丁酸內(nèi)酯(GBL)、DSF、PQS、法尼醇等。目前研究得最多的群體感應(yīng)系統(tǒng)有以下四種：革蘭氏陰性菌中的?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)、革蘭氏陽(yáng)性菌中的自誘導(dǎo)肽(AIP)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)、呋喃硼酸

50、二酯結(jié)構(gòu)的AI-2介導(dǎo)的種間群體感應(yīng)系統(tǒng)和-丁酸內(nèi)酯(GBL)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)。（2）GBL類型的信號(hào)分子在抗生素生物合成中發(fā)揮功能： 鏈霉菌廣泛使用-丁酸內(nèi)酯（GBL）類化合物作為自調(diào)控因子。GBL在胞內(nèi)合成并分泌到胞外，當(dāng)達(dá)到一定閾值濃度時(shí)，能夠被胞內(nèi)的受體蛋白所感知，從而引起群體反應(yīng)(抗生素合成或產(chǎn)孢)。 信號(hào)分子（A因子GBL）的受體蛋白ArpA與多效調(diào)空基因adpA的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合, 阻遏了adpA的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)A因子（GBL）積累到閾值時(shí)，它與ArpA結(jié)合，使ArpA從adpA上解離，導(dǎo)致adpA有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。翻譯后的AdpA控制鏈霉素生物合成基因簇中調(diào)控基因strR的轉(zhuǎn)錄, Str

51、R激活strB1開(kāi)始的這個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的基因轉(zhuǎn)錄, 從而調(diào)控鏈霉素的生物合成。3有哪些方法或策略可以得到新型抗生素?（1） 更多鏈霉菌基因組的測(cè)序及挖掘：隨著更多鏈霉菌基因組的不斷完成和信息積累, 為抗生素生物合成基因簇的研究，發(fā)現(xiàn)新型抗生素提供了重要的條件。大量的鏈霉菌尚未測(cè)序，這極大地影響了新型抗生素的發(fā)現(xiàn)。每個(gè)基因組平均含有20-30個(gè)左右次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，大多數(shù)是未知的，這將是發(fā)現(xiàn)新型抗生素的龐大資源。（2） 培養(yǎng)條件的優(yōu)化：微生物只能在適合的條件下生長(zhǎng)和繁殖。不同的營(yíng)養(yǎng)（如不同的碳源和氮源等）條件導(dǎo)致不同的生理代謝。次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成是與前體的提供和相關(guān)因子的誘導(dǎo)密切相關(guān)的

52、。同時(shí)，相關(guān)菌株的共同培養(yǎng)可以提供互補(bǔ)的重要物質(zhì)和信息交流，這為隱性次級(jí)代謝基因簇的激活提供了可能的條件。（3） 調(diào)控子的遺傳操作：隱性次級(jí)代謝基因簇在受阻遏和缺乏激活因子的情況下不能得到表達(dá)，去除負(fù)調(diào)控基因的阻遏和構(gòu)建正調(diào)控基因的有效表達(dá)是激活隱性次級(jí)代謝基因簇表達(dá)的策略之一。此外，對(duì)轉(zhuǎn)錄單元中啟動(dòng)子的替換和定向改造也是隱性次級(jí)代謝基因簇激活的有效方法。（4） 基因簇的異源表達(dá)：為了消除菌株本身的一些限制因素，進(jìn)行隱性次級(jí)代謝基因簇的異源表達(dá)也是值得嘗試的方法。 （5） 信號(hào)分子介導(dǎo)的激活：-丁酸內(nèi)酯（GBL）作為放線菌的信號(hào)分子，通過(guò)與相應(yīng)的受體蛋白相互作用，進(jìn)而激活多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物

53、合成。除GBL外, 在抗生素生物合成中信號(hào)分子具有多樣性和多效性, 如抗生素本身可作為信號(hào)分子, ATP和肌醇等可作為信號(hào)分子參與抗生素的生物合成和形態(tài)分化的分子調(diào)控。發(fā)現(xiàn)新信號(hào)分子，研究其在抗生素產(chǎn)生和種間交流中的作用機(jī)制；同時(shí)可用于激活隱性基因簇；探索抗生素作為信號(hào)分子在自然生境中的生物學(xué)功能。 （6） 核糖體工程：在鏈霉菌中，核糖體蛋白S12的突變同樣可以影響抗生素的產(chǎn)量。（7） 其他新方法和策略 未來(lái)可能的突破：以鏈霉菌為模式，進(jìn)一步闡明抗生素生物合成與調(diào)控機(jī)制，為提高重要抗生素的產(chǎn)量乃至激活隱基因簇，挖掘新型活性次級(jí)代謝產(chǎn)物方面做出創(chuàng)新性的研究成果 ；深入開(kāi)展抗生素的組合生物合成和合

54、成生物學(xué)的研究，突破天然產(chǎn)物合成過(guò)程中的瓶頸，獲得在結(jié)構(gòu)和功能上具有突出特點(diǎn)的新型活性化合物。第2章1應(yīng)用于鏈霉菌基因組編輯與大片段DNA克隆的技術(shù)都有哪些？能否用在你們今后的實(shí)驗(yàn)中？ 基因組編輯是指在基因組水平上對(duì)DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。原理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到改造基因組的目的。1鏈霉菌基因組編輯有：（1）I-SecI endonuclease介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng)：敲除質(zhì)粒上含有一串聯(lián)的與靶片段左右臂同源的兩個(gè)DNA片段以及I-SecI識(shí)別的18個(gè)堿基的位點(diǎn)（sceS）。將該質(zhì)粒導(dǎo)入鏈

55、霉菌細(xì)胞，并通過(guò)抗性篩選質(zhì)粒插入到基因組上的克隆。如果發(fā)生同源單交換，該質(zhì)粒將被完整導(dǎo)入基因組靶位點(diǎn)。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)SecI，SecI在18個(gè)堿基的位點(diǎn)（sceS）切斷基因組DNA，菌體不能夠存活。如果發(fā)生同源雙交換， sceS被刪除，即使誘導(dǎo)表達(dá)SecI也不會(huì)造成基因組DNA的斷裂，菌體仍然存活，并表現(xiàn)出抗性敏感。（2）CRISPR-Cas9介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng)：首先優(yōu)化cas9的密碼子，將其放置在強(qiáng)啟動(dòng)子之后并克隆到敲除質(zhì)粒上，敲除質(zhì)粒上含有sgRNA并置于組成型啟動(dòng)子之后， sgRNA中的引導(dǎo)序列為靶位點(diǎn)的同源序列，敲除質(zhì)粒必須包括靶基因兩側(cè)的同源臂。將該質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌，CRISPR/Cas

56、9系統(tǒng)將靶位點(diǎn)切斷，同時(shí)質(zhì)粒上的同源臂與基因組上的同源臂發(fā)生雙交換，將斷裂的靶基因區(qū)刪除，基因組重新連接。（CRISPR/Cas9系統(tǒng)先切斷靶序列后直接發(fā)生雙交換，最后斷裂的靶基因直接被敲除）（3）位點(diǎn)特異性整合酶介導(dǎo)的基因組編輯：（cre/lox系統(tǒng)）利用兩次同源單交換分別將兩個(gè)loxP位點(diǎn)整合到目的基因片段的上下游，再將Cre蛋白表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌，在Cre蛋白的作用下，兩個(gè)loxP位點(diǎn)發(fā)生位點(diǎn)特異性重組，完成目的基因片段的敲除。而環(huán)化的DNA由于不能在鏈霉菌中復(fù)制，隨著傳代而丟失。2大片段DNA克隆的技術(shù)：（1）依賴于酵母菌的轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的大片段DNA重組克?。═AR）（2）基于FBT1 a

57、ttp-attB-int整合系統(tǒng)的鏈霉菌基因組DNA大片段克隆技術(shù)：通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒pSV:attB6Up導(dǎo)入鏈霉菌，卡那霉素篩選獲得pSV:attB6Up同源整合到目的位置的菌株S-attB6。再將pKC1139:attP6Dn導(dǎo)入S-attB6，在40度培養(yǎng)， pKC1139:attP6Dn通過(guò)同源單交換整合到目的位置獲得S-attB6P6。通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移將含有FBT1整合酶的pIJ10500導(dǎo)入S-attB6P6中，利用整合酶將目的基因簇環(huán)出，并克隆到載體pKC1139上。3在今后的實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)用到： 我們實(shí)驗(yàn)室是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，這些技術(shù)方法對(duì)于我今后的研究室有助益的。我們平時(shí)多采用基

58、本的遺傳操作，構(gòu)建敲除質(zhì)粒載體，然后導(dǎo)入受體菌株進(jìn)行同源重組進(jìn)行單交換，利用抗生素進(jìn)行篩選，隨后還需要進(jìn)行雙交換。我們可以考慮使用基因編輯技術(shù)來(lái)進(jìn)行遺傳操做。比如應(yīng)用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的同源重組基因編輯技術(shù)來(lái)使之直接發(fā)生雙交換而直接敲除靶標(biāo)基因，這樣操作起來(lái)并不繁瑣，也省去了些過(guò)程，并且對(duì)是否發(fā)生雙交換也比較好判斷2作為絲狀細(xì)菌的鏈霉菌經(jīng)歷一個(gè)怎樣的分化過(guò)程？對(duì)其自身有何意義？（劉鋼老師）（1）作為絲狀細(xì)菌鏈霉菌的分化過(guò)程為： 1，孢子萌發(fā)形成基質(zhì)菌絲； 2，基質(zhì)菌絲延伸、分枝；（光禿表型） 3，向空氣中生長(zhǎng)形成氣生菌絲； 4，氣生菌絲產(chǎn)生螺旋和分隔；（白表型） 5，分隔加深形成孢子鏈； 6，孢子鏈變灰，成熟；（灰表型） 7，釋放游離孢子。 鏈霉菌的發(fā)育分化過(guò)程中有部分的基質(zhì)菌絲和