細(xì)胞的換液與傳代學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1第一頁，共27頁。第1頁/共27頁第二頁，共27頁。第2頁/共27頁第三頁，共27頁。n 8）分散酶（）分散酶（0.1mg/ml)或蛋白酶或蛋白酶(0.1-1.0 1mg/ml)第3頁/共27頁第四頁，共27頁。倒出舊液倒出舊液PBS洗滌洗滌(xd)胰蛋白酶胰蛋白酶(y dn bi mi)消化消化吸出消化液吸出消化液加入培養(yǎng)液加入培養(yǎng)液吹散細(xì)胞吹散細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)稀釋稀釋培養(yǎng)培養(yǎng)第4頁/共27頁第五頁，共27頁。離心離心(lxn)法：離心法：離心(lxn)后去上清，加培養(yǎng)液，吹后去上清，加培養(yǎng)液，吹 打，傳代。打，傳代。直接傳代法：將細(xì)胞慢慢沉淀，將上清吸去直接傳代法：將細(xì)胞慢慢沉淀，將上

2、清吸去1/2-2/3，加培養(yǎng)基，傳代。，加培養(yǎng)基，傳代。3、懸浮、懸浮(xunf)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)第5頁/共27頁第六頁，共27頁。(二二) 傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)第6頁/共27頁第七頁，共27頁。二、細(xì)胞系的建立(jinl)正常正常(zhngchng)細(xì)胞系建立的程序包括：細(xì)胞系建立的程序包括：原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 第一次傳代第一次傳代 常規(guī)傳代和凍存、常規(guī)傳代和凍存、 復(fù)蘇等階段。復(fù)蘇等階段。 第7頁/共27頁第八頁，共27頁。細(xì)胞系的維持細(xì)胞系的維持(wich)細(xì)胞系檔案要記錄好：組織來源、培養(yǎng)基要求、傳代時(shí)間等細(xì)胞系檔案要記錄好：組織來源、培養(yǎng)基要求、傳代時(shí)間等；

3、傳代換液有規(guī)律，否則會(huì)引起生物學(xué)特性改變；傳代換液有規(guī)律，否則會(huì)引起生物學(xué)特性改變；多種細(xì)胞維持傳代，要防止交叉多種細(xì)胞維持傳代，要防止交叉(jioch)(jioch)污染；污染；要有充足的凍存儲(chǔ)備，防止因污染造成絕種；另外，細(xì)胞暫要有充足的凍存儲(chǔ)備，防止因污染造成絕種；另外，細(xì)胞暫時(shí)不用，最好凍存，以免老化或性狀改變。時(shí)不用，最好凍存，以免老化或性狀改變。第8頁/共27頁第九頁，共27頁。鑒定(jindng)細(xì)胞系的內(nèi)容：第9頁/共27頁第十頁，共27頁。三三 、細(xì)胞、細(xì)胞(xbo)克隆克隆第10頁/共27頁第十一頁，共27頁。稀釋鋪板法稀釋鋪板法飼養(yǎng)飼養(yǎng)(syng)層克隆法層克隆法膠原膜板

4、膠原膜板瓊脂克隆法等瓊脂克隆法等分類(fn li)：第11頁/共27頁第十二頁，共27頁。第12頁/共27頁第十三頁，共27頁。1.稀釋鋪板法：最常用稀釋鋪板法：最常用消化消化低密度細(xì)胞懸液制備低密度細(xì)胞懸液制備接種接種標(biāo)記與標(biāo)記與培養(yǎng)培養(yǎng)分離擴(kuò)大分離擴(kuò)大(kud)培養(yǎng)培養(yǎng)觀察觀察移植瓶移植瓶或皿內(nèi)培養(yǎng)或皿內(nèi)培養(yǎng)稀釋(xsh)鋪板法圖解第13頁/共27頁第十四頁，共27頁。第14頁/共27頁第十五頁，共27頁。第15頁/共27頁第十六頁，共27頁。飼養(yǎng)層克隆飼養(yǎng)層克隆(k ln)圖解圖解第16頁/共27頁第十七頁，共27頁。3、膠原膜板或血纖維蛋白膜板克隆法： 1）膠原膜板或血纖維蛋白膜板的制

5、備 2）消化、稀釋、接種和培養(yǎng)(piyng)待克隆細(xì)胞血纖維蛋白膜板制備A液：0.2g凝血酶,100ml培養(yǎng)(piyng)液B液:250mg 牛血纖維蛋白原、800mg NaCl、25mg 檸檬酸鈉、1000毫升雙蒸水A：B=4：1第17頁/共27頁第十八頁，共27頁。4、瓊脂(qingzh)克隆法： 用于病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞、惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 2%瓊脂(qingzh)母液-45水浴-混合成0.33%瓊脂(qingzh)培養(yǎng)液加入試管內(nèi) 2.5ml- 45水浴第18頁/共27頁第十九頁，共27頁。瓊脂瓊脂(qingzh)克克隆法圖解隆法圖解第19頁/共27頁第二十頁，共27頁。第20頁/共27頁第二十一

6、頁，共27頁。在瓊脂在瓊脂(qingzh)基底上用甲基纖維素克基底上用甲基纖維素克隆化圖解隆化圖解第21頁/共27頁第二十二頁，共27頁。v影響因素：影響因素：v1、細(xì)胞、細(xì)胞(xbo)密度。密度。10個(gè)個(gè)/mlv2、培養(yǎng)液。、培養(yǎng)液。HamF12kv3、血清、血清v4、飼養(yǎng)細(xì)胞、飼養(yǎng)細(xì)胞(xbo)v5、激素和生長因子：胰島素，地塞米松，、激素和生長因子：胰島素，地塞米松，EGF，BFGF。v6、CO27、適應(yīng)性生長基質(zhì)：膠原層，血漿纖維蛋白層，多聚右旋賴、適應(yīng)性生長基質(zhì)：膠原層，血漿纖維蛋白層，多聚右旋賴氨酸，纖維連接蛋白，瓊脂氨酸，纖維連接蛋白，瓊脂第22頁/共27頁第二十三頁，共27頁?？寺】寺?