色譜理論基礎(chǔ)

1、色譜概述和色譜理論基礎(chǔ)色譜法歷史色譜法分類(lèi)色譜有關(guān)術(shù)語(yǔ)色譜基本理論氣相色譜流程色譜法的歷史色譜法的歷史 1903年，tswett 發(fā)表了吸附色譜分離植物色素的論文，并于1906年正式提出色譜法。 1931年，ledeer的工作，色譜技術(shù)受到重視。 1938年,izomailov 和shraiber 薄層色譜， 同年，taylor和 uray用離子交換色譜分離了鋰和鉀同位素 1944年，美國(guó)橡樹(shù)嶺實(shí)驗(yàn)室和衣阿華州大學(xué)分離和鑒定了稀土元素。 1941年，martin和synge發(fā)展了分配色譜。色譜法的歷史 1944年，martin發(fā)展了紙色譜 1952年，martin和 james發(fā)展了氣-液分配

2、色譜，氣相色譜問(wèn)世。 1956年，van deemter等發(fā)表了速率理論。 1957年，制作了離子色譜交換氨基酸分析儀。 1959年，凝膠過(guò)濾色譜。 giddings 于1963年奠定色譜理論。1969年，現(xiàn)代液相色譜，1975年，離子色譜法。1981年，毛細(xì)管電泳。色譜法分類(lèi)按兩相狀態(tài)分類(lèi) 氣體為流動(dòng)相的色譜稱為氣相色譜（gc），根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物液體），又可分為氣固色譜（gs c）和氣液色譜（glc）液體為流動(dòng)相的色譜稱液相色譜（lc）。同理，液相色譜亦可分為液固色譜（lsc）和液液色譜（llc）超臨界流體為流動(dòng)相的色譜稱為超臨界流體色譜（

3、sfc）。色譜法分類(lèi)按分離機(jī)理分類(lèi)利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法稱為分配色譜法。利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法，稱為離子交換色譜法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法，稱為凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。色譜法分類(lèi)最近，又有一種新分離技術(shù)，利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專(zhuān)屬性親和力不同進(jìn)行分離的技術(shù)稱為親和色譜法，常用于蛋白質(zhì)的分離 按固定相的外形分類(lèi) 固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱為柱色譜。固定相呈平板狀的色譜法，稱為平板色譜，它又

4、可分為薄層色譜和紙色譜。色譜有關(guān)術(shù)語(yǔ)色譜有關(guān)術(shù)語(yǔ)基線 是柱中僅有流動(dòng)相通過(guò)時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)信號(hào)的記錄值，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。保留值1.保留時(shí)間保留時(shí)間tr 試樣從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為保留時(shí)間。 2.死時(shí)間死時(shí)間tm 不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間。 色譜有關(guān)術(shù)語(yǔ)3調(diào)整保留時(shí)間調(diào)整保留時(shí)間tr 某組份的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后稱為該組份的調(diào)整保留時(shí)間，即 tr = tr-tm組分在色譜柱中的保留時(shí)間tr包含了組分隨流動(dòng)相通過(guò)柱子所需的時(shí)間和組分在固定相中滯留所需的時(shí)間。保留時(shí)間可用時(shí)間單位（s）或距離單位（cm）表示

5、。色譜有關(guān)術(shù)語(yǔ)注意：但同一組分的保留時(shí)間常受到流動(dòng)相流速的影響，因此有時(shí)用保留體積等參數(shù)進(jìn)行定性。 4保留體積保留體積 vr 指從進(jìn)樣開(kāi)始到被測(cè)組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過(guò)的流動(dòng)相體積。保留體積與保留時(shí)間tr的關(guān)系如下： vr = trf0色譜有關(guān)術(shù)語(yǔ)5死體積死體積 vm 指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和當(dāng)后兩項(xiàng)很小而可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與流動(dòng)相體積流速f0（mlmin）計(jì)算： vm = tmf0 6調(diào)整保留體積調(diào)整保留體積vr 某組份的保留體積扣除死體積后，稱該組份的調(diào)整保留體積，即 vr = vr- vm色譜

6、有關(guān)術(shù)語(yǔ)7相對(duì)保留值相對(duì)保留值2.1 某組份2的調(diào)整保留值與組份1的調(diào)整保留值之比，稱為相對(duì)保留值：色譜有關(guān)術(shù)語(yǔ)注意：由于相對(duì)保留值只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，是氣相色譜中廣泛使用的定性數(shù)據(jù)。 相對(duì)保留值絕對(duì)不是兩個(gè)組份保留時(shí)間或保留體積之比。 分離度、柱效、理論塔板數(shù)、有效塔板數(shù)的概念在“色譜基本理論”介紹。色譜有關(guān)術(shù)語(yǔ)選擇因子 在定性中，通常固定一個(gè)色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)（s），然后再求其它峰（i）對(duì)這個(gè)峰的相對(duì)保留值。將它們的相對(duì)保留值作為重要參數(shù)，可用符號(hào)表示：12rrtttr2為后出峰的調(diào)整保留時(shí)間，所以這時(shí)總是大于1的色譜有關(guān)術(shù)語(yǔ)峰高 色譜峰頂點(diǎn)與

7、基線之間的垂直距離，以h表示。區(qū)域?qū)挾龋ǚ鍖挕敕鍖挘?色譜峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法:1. 標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差 即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半，如上圖中ef距離的一半。色譜有關(guān)術(shù)語(yǔ)2. 半峰寬半峰寬w1/2 即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬，如前圖中g(shù)h間的距離它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是： w1/2 = 2.3543.基線寬度基線寬度w 即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距，如前圖中ij的距離它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是： w = 4 峰面積：a=1.065xw1/2bxh色譜有關(guān)術(shù)語(yǔ)從色譜流出曲線上，可以得到許多重要信息： (l

8、）根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)。 （2）根據(jù)色譜峰的保留值，進(jìn)行定性分析。 (3) 根據(jù)色譜峰的峰面積或峰高，進(jìn)行定量分析。 （4）色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋ǚ甯摺⒎迕娣e），是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)。 （5）色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和流動(dòng)相)選擇是否合適的依據(jù)。色譜基本理論 概述分配系數(shù)k和分配比k 塔板理論 速率理論 分離度 基本色譜保留式色譜基本理論 概述 色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過(guò)程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬

9、，以致彼此重疊，還是不能分開(kāi)。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。色譜基本理論分配系數(shù)k和分配比k 分配系數(shù)是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之比值，即 分配比又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。即msnn量組分在流動(dòng)相中物質(zhì)的量組分在固定相中物質(zhì)的色譜基本理論它是衡量色譜柱對(duì)被分離組分保留能力的重要參數(shù)。k值也決定于組分及固定相熱力學(xué)性質(zhì)。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動(dòng)相及固定相的體積有關(guān)。分配系數(shù)k與分配比k的關(guān)系稱為相比率，它是反映各種

10、色譜柱型特點(diǎn)的又一個(gè)參數(shù)。色譜基本理論分配系數(shù)k及分配比k與選擇因子的關(guān)系通過(guò)選擇因子把實(shí)測(cè)值k與分配系數(shù)k直接聯(lián)系起來(lái)，對(duì)固定相的選擇具有實(shí)際意義。如果兩組分的k或k值相等，則=1，兩個(gè)組分的色譜峰必將重合，說(shuō)明分不開(kāi)。兩組分的k或k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。色譜基本理論 塔板理論 最早由martin等人提出塔板理論，在平衡色譜理論基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái),把色譜柱比作一個(gè)精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來(lái)描述組分在兩相間的分配行為，同時(shí)引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)。四點(diǎn)假設(shè): 1)、在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度h內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長(zhǎng)

11、稱為理論塔板高度h色譜基本理論 2）載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（vm）。 3）所有組分開(kāi)始時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略。 4）分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無(wú)關(guān)。 色譜基本理論由于死時(shí)間tm包括在tr中,而實(shí)際的tm不參與柱內(nèi)分配,所計(jì)算的n值盡管很大,h很小,但與實(shí)際柱效能相差甚遠(yuǎn)。采用有效理論塔板數(shù)neff和有效塔板高h(yuǎn)eff評(píng)價(jià)柱效能。 222/1)(16)(54. 5wtwtnrreffeffeffnlh色譜基本理論塔板理論形象地描述了溶質(zhì)在色譜柱中的分配平衡和分離過(guò)程，導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)模型，并成功地解

12、釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，還提出了計(jì)算和評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)。存在問(wèn)題： 1 不能解釋造成譜帶擴(kuò)張的原因和影響板高的各種因素； 2 不能說(shuō)明為什么在不同流速下可以測(cè)得不同的理論塔板數(shù)。色譜基本理論 速率理論 吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過(guò)程，從而在動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素色譜基本理論分子渦流項(xiàng)：在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動(dòng)相向柱出口遷移時(shí)，流動(dòng)相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動(dòng)方向，使組分分子在前進(jìn)中形成紊亂的類(lèi)似“渦流”的流動(dòng)，故稱渦流擴(kuò)散。 a2dp a與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子有關(guān)，與流動(dòng)相的性質(zhì)、線速度和

13、組分性質(zhì)無(wú)關(guān)。為了減少渦流擴(kuò)散，提高柱效，使用細(xì)而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對(duì)于空心毛細(xì)管，不存在渦流擴(kuò)散，因此a0。 色譜基本理論分子擴(kuò)散項(xiàng)b/u（縱向擴(kuò)散項(xiàng)） 縱向分子擴(kuò)散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)地向前和向后擴(kuò)散，造成譜帶展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)為 b2dg 式中是填充柱內(nèi)流動(dòng)相擴(kuò)散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對(duì)自由分子擴(kuò)散的阻礙情況。dg為組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)（cm2s-1）。 色譜基本理論傳質(zhì)阻力項(xiàng)cu 對(duì)于氣液色譜，傳質(zhì)阻力系數(shù)c包括氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)cg和液相傳質(zhì)阻力

14、系數(shù)cl兩項(xiàng)， 即 ccgcl 氣相傳質(zhì)過(guò)程是指試樣組分從氣相移動(dòng)到固定相表面的過(guò)程。這一過(guò)程中試樣組分將在兩相間進(jìn)行質(zhì)量交換，即進(jìn)行濃度分配。有的分子還來(lái)不及進(jìn)入兩相界面，就被氣相帶走；有的則進(jìn)入兩相界面又來(lái)不及返回氣相。這樣，使得試樣在兩相界面上不能瞬間達(dá)到分配平衡，引起滯后現(xiàn)象，從而使色譜峰變寬。對(duì)于填充柱，氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)cg為色譜基本理論 由上式看出，氣相傳質(zhì)阻力與填充物粒度的平方成正比、與組分在載氣流中的擴(kuò)散系數(shù)成反比。因此，采用粒度小的填充物和相對(duì)分子質(zhì)量小的氣體（如氫氣）做載氣，可使cg減小，提高柱效。 色譜基本理論固定相的液膜厚度df薄，組分在液相的擴(kuò)散系數(shù)dl大，則液相傳質(zhì)

15、阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值隨之變小，又會(huì)使c1增大。當(dāng)固定液含量一定時(shí)，液膜厚度隨載體的比表面積增加而降低，因此，一般采用比表面積較大的載體來(lái)降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分離。雖然提高柱溫可增大dl，但會(huì)使k值減小，為了保持適當(dāng)?shù)腸l值，應(yīng)控制適宜的柱溫。 色譜基本理論將上面式總結(jié)，即可得氣液色譜速率板高方程: 這一方程對(duì)選擇色譜分離條件具有實(shí)際指導(dǎo)意義，它指出了色譜柱填充的均勻程度，填料顆粒的大小，流動(dòng)相的種類(lèi)及流速，固定相的液膜厚度等對(duì)柱效的影響。 色譜基本理論色譜基本理論分離度(柱效和選擇性對(duì)分離的影響) 看下圖色譜基本理論 上圖說(shuō)明了

16、柱效和選擇性對(duì)分離的影響。圖中（a）兩色譜峰距離近并且峰形寬。兩峰嚴(yán)重相疊，這表示選擇性和柱效都很差。圖中（b）雖然兩峰距離拉開(kāi)了，但峰形仍很寬，說(shuō)明選擇性好，但柱效低。圖中（c）分離最理想，說(shuō)明選擇性好，柱效也高。 單獨(dú)用柱效或選擇性不能真實(shí)反映組分在色譜柱中分離情況，故需引入一個(gè)綜合性指標(biāo)分離度r。色譜基本理論分離度又叫分辨率，它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即2121)(2)(211212wwttwwttrrrrr氣相色譜色譜流程氣相色譜色譜流程一、概述 gc是martin 等人在研究液液分配色譜的基礎(chǔ)上，于1952 年創(chuàng)立的一種極有效的分離方法，它可

17、分析和分離復(fù)雜的多組分混合物。目前由于使用了高效能的色譜柱，高靈敏度的檢測(cè)器及化學(xué)工作站，使得氣相色譜法成為一種分析速度快、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣的分析方法。氣相色譜色譜流程氣相色譜法又可分為氣固色譜（gsc）和氣液色譜（glc）：前者是用多孔性固體為固定相，分離的對(duì)象主要是一些永久性的氣體和低沸點(diǎn)的化合物；而后者的固定相是用高沸點(diǎn)的有機(jī)物涂漬在惰性載體上或?qū)⒐潭ㄒ翰捎猛糠蠡蚪宦?lián)的方法涂于毛細(xì)管壁上，由于可供選擇的固定液種類(lèi)多，故選擇性較好，應(yīng)用亦廣泛。下圖為氣相色譜儀系統(tǒng)流程圖氣相色譜色譜流程氣源進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)溫度和流量控制系統(tǒng)溫度和流量控制系統(tǒng)溫度控制系統(tǒng)氣相色譜色譜流

18、程二、氣源 常用的載氣和燃燒氣、載氣純度的分類(lèi)、氣體中污染物、氣體凈化器。 最常用的載氣是氦氣和氫氣。有時(shí)也用氮?dú)?、氬氣。作用是攜帶樣品進(jìn)入色譜柱進(jìn)行分離，然后進(jìn)入檢測(cè)器對(duì)各組分進(jìn)行定量。 來(lái)源：鋼瓶、氣體發(fā)生器載氣的純度是至關(guān)重要的。 了解氣體純度的分類(lèi)（低純度、高純度、超純度、研究級(jí)）。氣相色譜色譜流程氣體中常見(jiàn)的污染物 烴類(lèi)化合物、鹵代烴; 水分; 氧 注：氣體純度越高，成本越高，在既不干擾分析，又不損害儀器的情況下，使用最低純度的氣體可以最大程度地降低成本。氣相色譜色譜流程具體到實(shí)際工作中，一般選用適當(dāng)?shù)膬艋鳎ㄓ纸胁都澹?需對(duì)凈化器進(jìn)行正確的安裝和維護(hù)，一個(gè)不一個(gè)不進(jìn)行維護(hù)的凈化器會(huì)失效，并成為一個(gè)污染進(jìn)行維護(hù)的凈化器會(huì)失效，并成為一個(gè)污染源。源。水分捕集阱： 一般為13x分子篩氧捕集阱： 為一含金屬插件的支持反應(yīng)試劑烴類(lèi)捕集阱： 活性炭吸附氣相色