大鼠EAAT3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在Hella細(xì)胞中的表達(dá)

1、大鼠eaat3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在hella細(xì)胞中的表達(dá)作者：晁曉東，費(fèi)舟，張磊，李娟，仝武軍 【摘要】 目的：克隆大鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3的cdna， 構(gòu)建其真核表迗載體并轉(zhuǎn)染hella細(xì)胞.方法：從大鼠的腦 組織中提取rna，采用rtpcr技術(shù)擴(kuò)增eaat3的基因編碼區(qū)序列，將序列定向克隆至真核表達(dá)載體(+).經(jīng)酶切及測序 鑒定后用陽離子脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染到hella細(xì)胞中，通過免疫 印跡法鑒定其表達(dá).結(jié)果：經(jīng)雙酶切、測序鑒定證實(shí)eaat3基 因的真核表迗載體構(gòu)建成功.免疫印跡法證實(shí)e aat3基因的 表迗.結(jié)論：成功克隆了 eaat3編碼區(qū)序列，并構(gòu)建了其真核 表達(dá)載體，為以eaat3為基礎(chǔ)的

2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療奠 定了基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】載體蛋白質(zhì)類;谷氨酸;真核表迗載體0引言通常認(rèn)為，細(xì)胞外液中沒有使谷氨酸失活的水解酶系統(tǒng). 對從神經(jīng)末梢釋放出來的glu的清除和失活的唯一途徑是通 過位于突觸前膜和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn) 體(ea at)的攝取而實(shí)現(xiàn)1.目前，已克隆了 5種eaat2， 分別是eaat1，eaat2, eaat3, eaa t4和主要分布在中樞神 經(jīng)系統(tǒng)海馬結(jié)構(gòu)的ca1 ca4區(qū)的錐體細(xì)胞層、齒狀回、小 腦的顆粒細(xì)胞層及大腦皮質(zhì)的ii iv 3.最近研究證明eaat3與主要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如肌萎縮性側(cè)束硬化癥、阿 爾茲海默病、帕金森病、癲癇、腦缺血、外傷

3、性腦損傷和精 神分裂癥等有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚.我們通過對大鼠 eaat3基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆及序列分析，為研究和防治由于 eaat3功能紊亂而導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ).1材料和方法材料成年雄性sd大鼠1只，體質(zhì)量350g，由第四軍醫(yī) 大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；真核表迗載體(+);感受態(tài)大腸桿 菌top10，pgem teasy 試刻盒；trizol 及 1 ipofection2000； qua ntscriptrtkitcdna 第一鏈合成試劑盒、taqplusdna 聚 合酶、dna凝膠回收試劑盒及dna提取試劑盒；限制性內(nèi)切 酶xho i，ecori及t4dna連接酶；eaat 3抗

4、體；其它試劑 為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑.方法腦組織rna的提取用10 g/l戊巴比妥鈉按20mg/kg靜 脈麻醉大鼠，斷頭取全腦，_70°c保存.取-70°c凍存的腦組 織100mg,加入預(yù)冷至4°c的trizolreage ntlml裂解細(xì)胞， 用2ml勻漿器勻漿，靜置lomin后將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至微量離 心管中，加lml氯仿，振蕩15 s，室溫靜置23min，4°c, 12 000g離心15min.取上清液移入新的微量離心管，加異丙 醇ml，輕輕混勻，室溫靜置5lomin，4°c, 1 2000g離心 lomin.棄上清，加入750ml/l乙醇

5、lml,洗滌沉淀物，4°c,7500g離心5min.棄上清，將沉淀物在真空中干燥510m in. 用depc水15 pl溶解沉淀，-70°c保存.取待測樣品2nl, 紫外分光光度計(jì)比色法定量分析rna含量.rna實(shí)驗(yàn)過程中， 所有實(shí)驗(yàn)用品均經(jīng)depc處理，滅活rna酶.引物設(shè)計(jì)根據(jù)genbank中已報(bào)道的大鼠ea at3cdna (x94255)的基因序列設(shè)計(jì)合成大鼠eaat3引物，上游 引物：5 ' gaattcgccacca tggggaagcccacgagct 3 ，設(shè)有ecori酶切位點(diǎn)，下游引物5 ' ctcgagctagaactg cgaggtc

6、tgagtgaac37 設(shè)有 xho i 酶切位點(diǎn).pcr擴(kuò)增大鼠eaat3cdna根據(jù)tiang en公司試劑盒說 明，用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄獲得eaat3cdna后進(jìn)行pcr擴(kuò)增.反 應(yīng)條件為預(yù)變性 94°c5min,94°c30s, 61°c30s, 72°c9 os, 30個循環(huán)，72°c延伸lomin.將pcr產(chǎn)物5 u l在含溴化乙錠 的10ml/l瓊脂糖凝膠電泳，用ima gemaster9. vds電泳成像 裝置觀察結(jié)果并拍照.目的基因克隆和酶切鑒定將pcr回收產(chǎn)物與pgem t載 體于16°c連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌t 0p

7、10感受態(tài)細(xì)胞，在 鋪有iptg及x p gal的氨芐青霉素瓊脂糖平板上進(jìn)行藍(lán) 白菌落篩選，挑取白色陽性菌落，37°c過夜培養(yǎng)菌體.取菌液 提取質(zhì)粒dna，用ecori,xho i雙酶切.觀察eaat3片段是否 已克隆到p gem t載體中.序列測定挑選酶切鑒定正確的重組菌pgem t/eaat3,以重組質(zhì)粒dna為測序模板，由上海捷瑞生物技術(shù)公司測序. 并用分析軟件對測序結(jié)果與genbank中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.大鼠eaat2真核表迗載體的構(gòu)建將帶有ecor 1和xho i 酶切位點(diǎn)的pgem t/eaat3雙酶切，純化回收酶切片段，同 樣對(+)載體進(jìn)行ecor i和xho i雙酶切

8、純化回收，完全酶切 后將(+)載體和eaat3片段用t4dna連接酶連接過夜，構(gòu)建大 鼠eaat3真核表達(dá)載體(+)/eaat3,將連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌t 0p10,用amp抗性篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒dna.用ecori，xho i雙酶切、pcr方法鑒定所篩選的陽性克隆.將所克隆片段的 序列在ncbi/genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對和分析.轉(zhuǎn)染hella細(xì)胞將he 11a細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含100ml/l小 牛血清的dmem中，于轉(zhuǎn)染前1日收集細(xì)胞并接種于鋪有蓋 玻片的六孔板中，細(xì)胞密度為6x105/孔.于37°c，50ml/lc02 培養(yǎng)24h,使每孔中細(xì)胞匯合達(dá)80%左右.按p

9、olyf ecttransfectionrea gent說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，重組質(zhì)粒各設(shè)3 個復(fù)孔，每孔操作如下：將重組質(zhì)粒1 ug溶于100ul不含 血清及抗生素的dmem培養(yǎng)基中，加入20ulpol yfect，旋渦 混勻.20°c25°c靜置5lomin后，加入ml含血清及抗生 素dmem培養(yǎng)基.吸出六孔板孔中的培養(yǎng)液，加入ml含血清 及抗生素新鮮dmem培養(yǎng)基，迅速加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物，輕輕搖 勻，37°c，50ml/lc0 2培養(yǎng)48h后檢測目的基因的表迖.轉(zhuǎn)染 同時另設(shè)空載體轉(zhuǎn)染對照和空白對照.免疫印跡法鑒定瞬時表達(dá)sdspage后，用半干轉(zhuǎn)移儀將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移

10、到硝酸纖維素濾膜(nc膜)上，用10m l50g/l的脫脂奶粉封閉.一抗為1 : 100兔抗鼠eaat3多克 隆抗血清，二抗為1 : 50用過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊igg. 用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光蛋白免疫印跡法進(jìn)行westernblot顯色分 析.2結(jié)果產(chǎn)物的克隆及酶切鑒定pcr結(jié)果通過rt pcr得到一條大小1571bp的單一 特異性條帶，與預(yù)期的eaat3片段大小相符.1： dnamarkeriv; 2: ea at3pcr 產(chǎn)物.1pcr產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析t/eaat3重組質(zhì)粒pcr及酶切鑒定對pgem t/eaat3 經(jīng)ecori,xho i雙酶切后，瓊脂糖電泳后顯現(xiàn)大小約1571 bp 的

11、基因片段.1： dnamark eriv ； 2: pgem t/eaat3 雙酶切.2重組pgem t/eaat3質(zhì)粒的ecori和xho i雙酶切鑒定(+)/eaat3真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcr及酶切鑒定挑選陽性克隆，擴(kuò)增并提取dna.經(jīng)ecori,xho i雙酶切鑒定，瓊脂糖 電泳后顯現(xiàn)大小約1571bp的基因片段.陽性克隆進(jìn)一步進(jìn)行pcr鑒定，經(jīng)瓊脂糖電泳后出現(xiàn)目的基因片段，表明插入片 段的存在.1： dnamarkeriv； 2： eaat3 雙酶切.3重組(+)/eaat3質(zhì)粒的ecori和xho i雙酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒的提取及質(zhì)粒測序?qū)⒊鹾Y的2個陽性重組 菌通過搖菌、質(zhì)粒提取并純化

12、，進(jìn)行dna測序，將測序結(jié)果與 genbank中大鼠eaat 3基因(x94255)的標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致.blot鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果在轉(zhuǎn)染(+)/eaat3的hella細(xì)胞表達(dá) 的重組蛋白可以被抗eaat3抗體所特異性識別，其大小與預(yù) 期相同，同時空載體組與空白對照組無條帶，表明eaat3在 hella細(xì)胞中得到表迗(圖4).3討論glu是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì) 可激活離子型受體和代謝型受體，參與神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及病 理等生命過程4.釋放至突觸間隙的glu主要由位于神經(jīng) 元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的高親和力glu轉(zhuǎn)運(yùn)體重?cái)z取而失活 5，因此，eaat對保持突觸間隙內(nèi)glu濃度在正常水平起

13、重要作用，其主要功能是使g1 u從突觸間隙和細(xì)胞外液被迅 速轉(zhuǎn)運(yùn).它以跨細(xì)胞膜的na+，k+和h+濃度梯度作為驅(qū)動力， 轉(zhuǎn)運(yùn)2個na+和1個k+攜帶1個負(fù)電荷的glu進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)， 同時有1個k+和可能加上1個0h-/hc03-從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì) 胞外作為交換，并至少有一個陽離子產(chǎn)生靜電效應(yīng)，因此glu 轉(zhuǎn)運(yùn)伴隨有電流產(chǎn)生.正常生理?xiàng)l件下，eaat將glu攝入到神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，這種攝入依賴正常的電位差，尤其是細(xì) 胞內(nèi)外的鈉離子梯度，使glu在細(xì)胞內(nèi)外的濃度差在1x103 倍以上.然而在很多病理情況下，eaat抑制通過抑制反向轉(zhuǎn)運(yùn)而 減少glu的釋放.帕金森病與eaat3有很密切地相關(guān)性6 ; e

14、aat3表達(dá)水平在顳葉癲癇患者的病變組織中顯著升高7; 在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究中發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損 傷與eaat的下降明顯有關(guān)，但是在全腦缺血時eaat3表迗升 高8 ;次聲損傷后，eaat明顯下降9 .glu的濃度和 位置的改變對神經(jīng)系統(tǒng)的功能有著重要的意義，而它的攝取 是其清除的主要途徑，盡管現(xiàn)在研究已經(jīng)表明eaat3的功能 與蛋白激酶c等密切相關(guān)10，但具體機(jī)制尚不清楚.因此， 我們的eaat真核表迗載體的構(gòu)建為進(jìn)一步了解和治療以其 為誘因而導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定了基礎(chǔ).1 zhouf,xiang lteredexpressionpa icglutamaterecepto【參

15、考文獻(xiàn)】z,xiaofanj,etal. atternsofmetabotroprsindiffusebrainin juryj . neuroscile tt, xx, 380:280-283.2 danboltnc , chan dhryfa , dehnesy ， eta1. properiesandloca tionofglutamatetra nsporters j . progb rainres, 1998,116: 2 3-24.3 jefferydr ,thsteinjd,leem ， et al. localizationofneuronalandglialglutamate

16、transporters j .neuron,1994, 13 (2):713-725.4 費(fèi)舟，章翔，白紅民.缺血性二次腦損傷大鼠腦皮 層第iii組mglurs改變及意義j.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002, 23： 2117-2120.5 lu car,maurizior,giambattistab, etal. coexistenceandfunctionofdifferentneurotransmittertransportersintheplasmamembraneofcnsneurons j. progneurobiol, 2 002,68： 287-309.6 plaitakisa , shashi dharantransportandinetabolismindopam inergicneuronsofsu bstantianigra： imph cationsforthepathogenesisofparkonson sdisease j. jneur ol, 2000,247： 1125-3 5.7 李林繁，麥潔文，周邇.各種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型在 顳葉癲癇患者病變部位的表迗j.海南醫(yī)學(xué)，xx，1 6(6):51-53.8 邱永明，陸兆豐，田鑫，等.大鼠全腦缺血后谷氨