蛋白酶活性的測定

1、精品資料實(shí)驗(yàn)四 蛋白酶活力的測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 、了解蛋白酶活力測定的原理；2 、掌握蛋白酶活力測定的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白酶在一定條件下不僅能夠水解蛋白質(zhì)中的肽鍵， 也能夠水解酰胺鍵和酯鍵， 因此可用蛋白質(zhì)或人工合成的酰胺及酯類化合物作為底物來測定蛋白酶的活力。本實(shí)驗(yàn)選用酪蛋白為底物， 測定微生物蛋白酶水解肽鍵的活力。 酪蛋白經(jīng)蛋白酶作用后， 降解成相對分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸， 在反應(yīng)混合物中加入三氯醋酸溶液， 相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)和肽就沉淀下來， 相對分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸仍留在溶液中， 溶解于三氯醋酸溶液中的肽的數(shù)量正比于酶的數(shù)量和反應(yīng)時(shí)間。在280nm 波長下測定溶液吸光度的增

2、加，就可計(jì)算酶的活力。三、實(shí)驗(yàn)試劑 微生物蛋白酶萃取液（ 0.01g/ml ） ：稱取 1.0g 酶制劑，加100ml 蒸餾水?dāng)嚢?30min ，在4 下離心分離后，將上層清夜置于冰箱中保存，使用前稀釋一定倍數(shù)； 0.02mol/L 磷酸鹽緩沖液（ pH7.5 ） ； 1% 酪蛋白溶液：取1.0g 酪蛋白，加100ml 0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液（ PH7.5 ） ，加熱并攪拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存； 5% 三氯醋酸（ TCA ）溶液。四、實(shí)驗(yàn)步驟1 、將 5%TCA 溶液和 1%酪蛋白溶液在37 下保溫。2 、取四支 15ml 具塞試管，分別標(biāo)上記號A1 、 A0 、 B1 和

3、 B0 。在 A1 和 A0試管中各吸入 0.20ml 酶液，在 B1 和 B0 試管中各吸入0.40ml 酶液，分別用0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液定容至2.00ml。在A0和B0試管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支試管都置于 37 水浴中保溫。3 、 在各試管中吸入2.00ml 1% 酪蛋白溶液， 在 37 下保溫 10min （準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）后，再向 A1 和 B1 試管中吸入 6.00ml5% 三氯醋酸溶液。4、將試管從水浴中取出，在室溫下放置1h ，用少量上清液潤濕濾紙后過濾，保留濾出液。5 、在 280nm 波長下，分別以 A0 和 B0 濾液為空白，測定A1 和 B1

4、濾液的吸光度。五、計(jì)算1 、在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下，以每分鐘增加 0.001 吸光度定義為一個(gè)酶單位。2 、每克酶制劑中酶活力的計(jì)算：?A X 1000 / （t X w）酶活力單位/克酶制劑式中，？ A樣品與空白吸光度差值（即 A1和B1的吸光值）；t 酶作用時(shí)間（本實(shí)驗(yàn)為 10min ） ； w 反應(yīng)中酶的用量， g六、說明1、微生物蛋白酶粗提取液在較寬廣的 PH范圍表現(xiàn)出活力，但是在接近中性條 件下最有最高活力。2、微生物蛋白酶在45 c以下可保持較長時(shí)間的穩(wěn)定性。七、思考題1、蛋白酶有哪幾類？2、影響酶活力的因素有哪些？3、使用紫外分光光度計(jì)時(shí)應(yīng)注意哪些問題？六、數(shù)據(jù)記錄與處理A1 = 0

5、.279 B1 = 0.573酶含量為 0.001g/ml酶活力 1 = ?A X 1000 / (t X w)=0.279 X 1000/10/0.001/0.20=1.395 乂 1麗活力單位 / 克酶制劑酶活力 2= ?A X 1000 / (t X w)=0.573 x 1000/10/0.001/0.40=1.4325 乂 10酶活力單位 / 克 酶制劑平均值二(1.395 X 1C5 + 1.4325 X 10) =141375酶活力單位/克酶制劑平均相對相差=(143250 - 139500) /141375 乂 100%=2.65%七、思考題1、蛋白酶有哪幾類？答：按蛋白酶水解

6、蛋白質(zhì)的方式：A內(nèi)肽酶：切開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵，生成相對分子質(zhì)量較小的多肽類；B外肽酶：切開蛋白質(zhì)或多肽分子氨基或竣基 末端的肽鍵，而游離出氨基酸的酶類；C水解蛋白質(zhì)或多肽的酯鍵；D水解蛋白 質(zhì)或多肽的酰胺鍵。按酶的來源可分為：動物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋 白酶微生物蛋白酶又可分為：細(xì)菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放線菌蛋白 酶按蛋白酶作用的最適PH可以分為（A） PH2.55.0的酸性蛋白酶，（B） PH9.510.5 的堿性蛋白酶，（C） PH78的中性蛋白酶2、影響酶活力的因素有哪些？答：酶活力是酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速率來表示的。酶活力的大小即酶含量 的多少，可以用每克酶制劑或每

7、毫升酶制劑含有多少酶單位來表示， 酶活力的測 定也就是測定酶促反應(yīng)的速率。酶濃度對酶活力的影響：酶促反應(yīng)速率與酶分子的濃度呈正比， 在一定范 圍內(nèi)，當(dāng)?shù)孜锓肿訚舛茸銐驎r(shí)，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度越快。底物濃度對酶活力的影響：若酶的濃度為定值，底物的起始濃度越低時(shí)， 酶促反應(yīng)速度與底物濃度呈正比，即隨底物濃度的增加而增加。當(dāng)所有的酶與底 物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后，即使再增加底物濃度，中間產(chǎn)物濃度也不會增加，酶促 反應(yīng)速度也不會增加。溫度對酶活力的影響：在適宜的溫度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而 增加，超過最適反應(yīng)溫度，酶活力將會下降。PH對酶活力的影響：酶在最適 PH范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，大于或小于最適 PH,都會降低酶活性。激活劑對酶活力的影響：某些無機(jī)陽離子、陰離子、有機(jī)化合物可作為激 活劑，能夠激活酶，使其表現(xiàn)出催化活性或強(qiáng)化其催化活性。抑制劑對酶活力的影響：酶的抑制劑能夠減弱、抑制甚至破壞酶的活力， 它可降低酶促反應(yīng)速度。3、使用紫外分光光度計(jì)時(shí)應(yīng)注意哪些問題？答：使用的比色皿必須潔凈，并注意配對使用。手指應(yīng)拿毛玻璃面的兩側(cè)， 裝盛樣品