第七章遺傳育種

1、l幾個概念：l（1） 遺傳型（遺傳型（Genotype）又稱基因型）又稱基因型它是指某一生物個體所含有的全部遺傳因子的總和。遺傳物質(zhì)起決定性作用，而外界環(huán)境可以影響其表型，即： 遺傳型+環(huán)境條件=表型l（2）表型：表型：指肉眼可以觀察到的某一生物所有具有的一切外部特征。 （3）變異：）變異：指生物體在內(nèi)因或外因的作用下引起的遺傳物質(zhì)的改變。 （4）飾變飾變（modification）：是指外表的修飾性改變，意即一種不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表現(xiàn)變化。它是不遺傳的，是一種外表現(xiàn)象。 l一、三個經(jīng)典試驗一、三個經(jīng)典試驗l（一）（一） 轉(zhuǎn)化實驗：轉(zhuǎn)化實驗：1928年英國的細(xì)菌

2、學(xué)家格里菲斯（Griffith）首先發(fā)現(xiàn)肺炎球菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。肺炎球菌是一種病原菌，存在兩種類型：光滑型（S）和粗糙型（R，Rough）S型有莢膜，菌落光滑，能使人和動物得病死亡。R型無莢膜，粗糙，不能使人和動物得病。 實驗說明，加熱殺死的S型細(xì)菌，在其細(xì)胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進(jìn)入R型細(xì)胞，并使R型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀。 離體條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)化實驗：（1） （1）從活的S菌中抽提各種細(xì)胞成分（DNA、蛋白質(zhì)、莢膜多糖等） （2） 對各組分進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗。從上述結(jié)果中可知，只有S型細(xì)菌的DNA才能將S的R型轉(zhuǎn)化為S型，而且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高，直到只取用純度為6*10-

3、6g的DNA時，仍有轉(zhuǎn)化能力，這就說明，S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株時，決不是某一遺傳性狀（在這里是莢膜多糖）的本身，而是以DNA為物質(zhì)基礎(chǔ)的遺傳因子。 l首先將Ecoli培養(yǎng)在放射性32PO43或 35SO42作為P或S源的培養(yǎng)基中，結(jié)果35S 存在于蛋白質(zhì)，而32P只存在于核酸，然后讓T2噬菌體侵染，從而使T2被標(biāo)記上S和P，接著讓具放射性的T2感染不含放射性元素的大腸桿菌，并在噬菌體復(fù)制前進(jìn)行攪動并離心，得上清液和沉淀物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S位于上清液而P位于底部，這說明蛋白質(zhì)外殼沒有進(jìn)入Ecoli，由于攪動而脫落，且較輕，故位于上部，而DNA進(jìn)入菌體，且較重，被沉淀下來。對沉淀液進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)有大量完整

4、的T2噬菌體出現(xiàn)，因此證實了DNA是遺傳信息的載體。l1965年美國學(xué)者法朗克-康勒特（H、FraenrelConrat）用含RNA的煙草花葉病毒進(jìn)行了植物病毒重建實驗。他將TMV（煙草花葉病毒）放在一定濃度的苯酚溶液中振蕩，將它的蛋白質(zhì)外殼與RNA核心分離，RNA在沒有蛋白質(zhì)包裹的情況下，也能感染煙草，且能分離出正常的病毒離子，證明RNA是遺傳物質(zhì)，另外，他還選用了另一株與TMV近似的霍氏車前花葉病毒（HRV）進(jìn)行實驗。 從圖中可以看出，用TMV的RNA和HRV的蛋白質(zhì)外殼重建的雜合病毒去感染煙草時，煙葉上出現(xiàn)的是典型的TMV病斑。再從分離出來的新病毒中分析發(fā)現(xiàn)，它是未帶有任何HRV痕跡的典

5、型TMV病毒，反之亦然。這充分地證明了核酸決定蛋白質(zhì)，是遺傳物質(zhì)。l1、細(xì)胞水平、細(xì)胞水平 2、細(xì)胞核水平 3、染色體水平（1）染色體數(shù)：（2）染色體倍數(shù)l4核酸水平（1）核酸種類）核酸種類（2）核酸結(jié)構(gòu)）核酸結(jié)構(gòu)（3）DNA長度長度 l 5、基因水平、基因水平 6、密碼子水平、密碼子水平 7、核苷酸水平、核苷酸水平l1定義和特點定義和特點凡游離于原核生物核基因組以外，具有獨立復(fù)制能力的小型共價閉會環(huán)狀的dSDNA分子，即 cccDNA，就是典型的質(zhì)粒質(zhì)粒。l嚴(yán)緊型復(fù)制控制嚴(yán)緊型復(fù)制控制：l松弛型復(fù)制控制：松弛型復(fù)制控制：l質(zhì)粒消除：質(zhì)粒消除：l附加體：附加體：l整合：整合：l操作的優(yōu)點：l體

6、積小，便于DNA的分離和操作；l呈環(huán)狀，使其在化學(xué)分離過程中能保持性能穩(wěn)定；l有不受核基因組控制的獨立復(fù)制起始點；l拷貝數(shù)多，使外源DNA可很快擴增；存在抗藥性基因等選擇性標(biāo)記，便于含質(zhì)?？寺〉臋z出和選擇。l其優(yōu)點是：l體積小l高拷貝數(shù)（ 2030個細(xì)胞）；l可擴增到含10003000個質(zhì)粒；l分離容易；l可插入較多的外源DNA（不超過10kb）；l結(jié)構(gòu)完全清楚l有兩個選擇性抗藥標(biāo)記（l可方便地通過轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入宿主細(xì)胞。 l3質(zhì)粒的分離與鑒定質(zhì)粒的分離與鑒定 4質(zhì)粒的種類質(zhì)粒的種類l大致可分5類，接合質(zhì)粒；抗藥性質(zhì)粒；產(chǎn)細(xì)菌素和抗生素質(zhì)粒；具生理功能的質(zhì)粒；產(chǎn)毒質(zhì)粒等。見P199表7-4l （

7、1）F質(zhì)粒質(zhì)粒 l（2）R質(zhì)粒質(zhì)粒l（3）Col質(zhì)粒質(zhì)粒l（4）Ti質(zhì)拉質(zhì)拉l（5）Ri質(zhì)粒質(zhì)粒l（6）mega質(zhì)粒質(zhì)粒l （7）降解性質(zhì)粒）降解性質(zhì)粒l一、一、 基因突變：基因突變：簡稱突變，是指生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)突然發(fā)生的可遺傳的變化。突變機率一般在10-6-10-9。l（一）（一） 突變類型：突變類型：突變的類型很多，我們按突變后極少數(shù)變株的表型是否能在選擇培養(yǎng)基上加以鑒別區(qū)分，分為選擇性突變株選擇性突變株（Selection Mutont）：）：凡能用選擇性培養(yǎng)快速選擇出來的突變株。反之稱為非選擇性突變株。非選擇性突變株。l選擇性突變株有選擇性突變株有：營養(yǎng)缺陷型、抗性突變型、

8、條件致死突變型。l非選擇性突變株有：非選擇性突變株有：形態(tài)突變型、抗原突變型和產(chǎn)量突變型。 l某野生型菌株（Wild Tyain Strain）由于發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子的能力。因而無法在基本培養(yǎng)基上正常生長繁殖的變異類型稱-。加上某生長因子可生長。 （2） 抗性突變型：（抗性突變型：（Resist Mutant）l由于基因突變而使原始菌株產(chǎn)生了對某種化學(xué)藥物或致死物理因子抗性的變異類型。 l（3） 條件致死突變型（條件致死突變型（Condtimal Lethal Mutant）：）：l某菌株或病毒經(jīng)基因突變后，在某種條件下可正常地生長、繁殖并實現(xiàn)基表型，而在另一種條件下卻無

9、法生長繁殖的突變類型稱為-。 l指由于突變而產(chǎn)生的個體或菌落形態(tài)所發(fā)生的非選擇性變異。 l（5） 抗原突變型（抗原突變型（Contigenic Mutant）：）：l 由于基因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生突變的變異類型。如細(xì)胞壁缺陷變異（L型細(xì)菌）、莢膜變異或鞭毛變異等。l（6） 產(chǎn)量突變：產(chǎn)量突變：l由于基因突變而獲得的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上高于或低于原始菌株的突變株，稱為-。前者為正突變，后者為負(fù)突變。 l每一個細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率稱突變率。l突變是獨立發(fā)生的，一個基因突變不會影響其它基因的突變率，這一點也說明一個細(xì)胞同時發(fā)生兩個基因突變的幾率是極低的，為每個基因突變率的乘積。 l（

10、1） 不對稱性：不對稱性：l指突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對應(yīng)關(guān)系。這一說法乍聽似乎很矛盾，如：細(xì)菌在含青霉素的環(huán)境下，出現(xiàn)了抗青霉素突變體；在紫外線作用下產(chǎn)生了抗紫外線突變體等。從表面看他們似乎有直接的關(guān)系，是誘因，其實不然，原因是原群體中本來就有抗霉素突變株，只是在青霉素作用下把它選擇了出來。（2）自發(fā)性：）自發(fā)性：各種突變可以在沒有誘因的情況下發(fā)生，即自然界中時時存在突變。（3）稀有性）稀有性：自發(fā)突變隨時發(fā)生，但對某一特定基因其發(fā)生率極低10-610-9。（4）獨立性：）獨立性：即每一個基因發(fā)生突變是獨立的，沒有相互關(guān)聯(lián)。（5）誘變性：）誘變性：即通過誘變劑可提高突變率。一般可

11、提高10105倍。（6）穩(wěn)定性：）穩(wěn)定性：由于突變是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因而具有遺傳穩(wěn)定性。 （7）可逆性：）可逆性：原始野生型變?yōu)橥蛔冃蜑檎蛲蛔?。相反稱為回復(fù)突變或回變。 （四）四） 基因突變的自發(fā)性和不對應(yīng)性的證明：基因突變的自發(fā)性和不對應(yīng)性的證明： 1、變量試驗：（Fluctuation Test）：證明證明：抗性突變體是在接觸噬菌體前就出現(xiàn)了，出現(xiàn)突變的時間越早，產(chǎn)生的菌落就越多，說明抗性突變體的出現(xiàn)與是否接觸噬菌體無關(guān)。 2、 涂布實驗：（涂布實驗：（Newcombe Expetiment）結(jié)果：結(jié)果：發(fā)現(xiàn)，在涂布過的一組中，共長出抗性菌落353個，要比未經(jīng)涂布過的28個，多得多

12、。說明：說明：該抗性突變發(fā)生在未接觸噬菌體之前。噬菌體的加入只不過起甄別作用，而不是誘導(dǎo)突變的因素。 3、平板影印培養(yǎng)試驗（、平板影印培養(yǎng)試驗（Replica Plating） （五）五） 基因突變的機理：基因突變的機理：l（1） 堿基置換：堿基置換：l置換置換是染色體一點微小的損傷，也稱點突變。一般只涉及一對堿基，置換又可分成兩種情況，即轉(zhuǎn)換和顛轉(zhuǎn)換和顛換換。l轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換（Transition）即DNA鏈中的一個嘌呤被另一個嘌呤或一個嘧啶被另一個嘧啶置換。l顛換顛換（Transversion）即一個嘌呤被另一個嘧啶或一個嘧啶被另一個嘌呤所置換。l（2） 移碼突變（移碼突變（Frame-Shif

13、t Mutation）：）：l指誘變劑使DNA分子中的一個或少數(shù)幾個核苷酸增添（插入）或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的一類突變。l吖啶類染料：如原黃素、吖啶黃和-氨基吖啶等。都是能引起移碼突變。 缺失：缺失：染色體丟失了部分片段稱-重復(fù)：重復(fù)：在一對同源染色體的不同部位上各有一個斷裂點，一條染色體的斷片接到另一條染色體的相應(yīng)部位，結(jié)果使后者發(fā)生重復(fù)。易位：易位：兩條非同源染色體同時發(fā)生斷裂，斷片相互交換位置后重接，就形成易位。倒位：倒位：一條染色體兩處發(fā)生斷裂后，中間的片段轉(zhuǎn)動180后重接就叫-（1）IS 特點是分子量最?。▋H 0 .7 1.4kb），只能引起轉(zhuǎn)座（t

14、ransPOsition）效應(yīng)而不含其他任何基因。因Is在染色體組上插入的位置和方向的不同，其引起的突變效應(yīng)也不同。IS引起的突變可以回復(fù)，其原因可能是IS被切離，如果因切離部位有誤而帶走IS以外的一部分DNA序列，就會在插入部位造成缺失，從而發(fā)生新的突變。 與IS和Mu噬菌體相比，Tn的分子量是居中的（一般為225kb）。它含有幾個至十幾個基因，其中除了與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因外，還含有抗藥基因或乳糖發(fā)酵基因等其他基因。Tn雖能插到受體DNA分子的許多位點上，但這些位點似乎也不完全是隨機的，其中某些區(qū)域更易插入。（3）Mu 噬菌體 它是Ecoli的一種溫和噬菌體。與必須整合到宿主染色體特定位置上

15、的一般溫和噬菌體不同，Mu噬菌體并沒有一定的整合位置。與IS和Tn兩種轉(zhuǎn)座因子相比，Mu噬菌體的分子量最大（37kb），它含有20多個基因。Mu噬菌體引起的轉(zhuǎn)座可以引起插入突變，其中約有2是營養(yǎng)缺陷型突變。 l自發(fā)突變是指在沒有人工參與下生物體自然發(fā)生的突變。自發(fā)突變并不是沒有原因，而是人們認(rèn)識不到。下面介紹幾種自發(fā)突變的可能機制：l（1） 背景輻射和環(huán)境因素引起突變：背景輻射和環(huán)境因素引起突變：l如宇宙空間的各種短波或高溫現(xiàn)象等。自然界中普遍存在的一些低深度物質(zhì)等。l（2） 微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)：微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)：l如：H2o2，它是微生物體內(nèi)一種較普遍的代謝產(chǎn)物

16、，它對某些種類的微生物有誘變作用，如脈孢菌。l（3） 互變異構(gòu)效應(yīng)：互變異構(gòu)效應(yīng)：l是由于ATCG四種堿基在化學(xué)結(jié)構(gòu)上發(fā)生異構(gòu)現(xiàn)象而引起DNA復(fù)制合成時出現(xiàn)錯誤。 (4)環(huán)出效應(yīng)：環(huán)出效應(yīng)： 即環(huán)狀突出效應(yīng)，因為DNA是由兩條單鏈組成，如果其中一條單鏈在復(fù)制時出現(xiàn)一個小環(huán)，則小環(huán)上的基因就會在復(fù)制時被越過，從而發(fā)生突變。 l紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰相鄰嘧啶間嘧啶間形成共價結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體，它的出現(xiàn)會減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈間結(jié)構(gòu)扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對，從而有可能引起突變或死亡。 l但微生物具有一定對損傷后的但微生物具有一定對損傷后的DNA修復(fù)修復(fù)的能力。的能力。

17、 l把經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下，可明顯降低其死亡率，這種現(xiàn)象就稱為-。l實驗：用Ecoli.將8*106個/ml的Ecoli用紫外線照射一定時間后，發(fā)現(xiàn)只有100個/ml的Ecoli存活；如果有照射后，立即放到可見光下30min,則存活量為2*106個/ml l原理原理：是在黑暗的條件下，光激活酶與胸腺嘧啶二聚體結(jié)合，當(dāng)有光的情況下，該酶發(fā)揮作用，使二聚體再分解成單體 l又稱切除修復(fù)，它是用來修復(fù)活細(xì)胞內(nèi)被損傷的DNA的一種機制。只是這種修復(fù)與光沒有關(guān)系。 l過程：過程：（1）內(nèi)切核酸E先在二聚體的5端切開一個缺口。（2）外切核酸E從5到3端將二聚體切除。（3）在DNA聚合酶的

18、作用下，以DNA的另一條互補鏈為模板，重新合成一段DNA鏈。（4）通過連接E的作用把新合成的一段DNA連接起來。即完成修復(fù)。 l（一）（一） 自發(fā)突變與育種：自發(fā)突變與育種：l1、 從生產(chǎn)中自然選種：從生產(chǎn)中自然選種：l在工業(yè)生產(chǎn)中，微生物總是以一定頻率發(fā)生著突變，一些有經(jīng)驗的微生物工作者，可以通過觀察，發(fā)現(xiàn)一些向正向突變株。然后進(jìn)行分離、純化、試驗等。即可找到一個好種。l2、 定向培育優(yōu)良品種：定向培育優(yōu)良品種：l定向培育定向培育是指用某一特定因素（如溫度、藥物）長期處理某微生物群體，并不斷移種傳代（目的是增加突變頻率），以達(dá)到累積并選擇相應(yīng)自發(fā)突變株的目的。是一種古老的育種方法。l但由于自

19、發(fā)突變頻率低，變異程度輕微，故速度緩慢，效果不明顯。 梯度平板篩選法 （篩選代謝物拮抗物的突變株 ） （二）誘變育種：（二）誘變育種：是指采用物理或化學(xué)的方法處理微生物細(xì)胞群，促使其顯著提高突變率，然后再篩選優(yōu)良突變株的方法，稱-。 1、誘變育種的基本環(huán)節(jié)：誘變育種的基本環(huán)節(jié)：l（1） 選擇簡便有效的誘變劑：選擇簡便有效的誘變劑：l原則：在選用理化因子作誘變劑時，在同樣效果下，應(yīng)選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇最高效的因素。有了合適的誘變劑，還要采用簡便有效的誘變方法 艾姆斯試驗艾姆斯試驗 用艾姆斯試驗測定潛在化學(xué)致癌物的基本原理是：鼠傷寒沙門氏菌即“S.t ”的的組氨酸缺陷型

20、（his）菌株在基本培養(yǎng)基平板上不能生長，如發(fā)生回復(fù)突變則能生長。 l這一點主要在生產(chǎn)中積累的經(jīng)驗。lA、 選擇生產(chǎn)中選育過的自發(fā)突變株。lB、 采用具有有利性的菌株（生長速度快，營養(yǎng)要求低等）lC、 選擇已發(fā)生過其它變異的菌株，可提高其它誘變因素的敏感性。lD、 選擇增變菌株，因為它對誘變劑的敏感性較高。lE、 選擇能產(chǎn)生所需代謝物的菌株。l（3） 最好處理單細(xì)胞懸液：最好處理單細(xì)胞懸液：單細(xì)胞懸液分散均勻，能普遍接觸誘變劑；且能長出純菌落。l（4） 選用合適的誘變劑量。選用合適的誘變劑量。l即選擇一個能顯著提高誘變率，又能增加變異幅度的劑量。l物理因素誘變劑量物理因素誘變劑量=強度強度*時

21、間時間l化學(xué)因素誘變劑量化學(xué)因素誘變劑量=濃度與處理時間來表示濃度與處理時間來表示l（5） 充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)：充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)：l如： A兩種或多種誘變劑的先后使用lB 同一種誘變劑重復(fù)使用。lC兩種或多種誘變劑的同時使用。l采用復(fù)合處理方法，可顯著提高誘變效果。l（6）利用形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)選擇：）利用形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)選擇： （7）設(shè)計高效的篩選方案和方法：）設(shè)計高效的篩選方案和方法：篩選方案：篩選方案：初篩以量為主，復(fù)篩以質(zhì)為主。步驟是： l一般也可采用初篩和復(fù)篩兩種方法對突變株進(jìn)行生產(chǎn)性能測定。l初篩：初篩：可在平板培養(yǎng)皿中進(jìn)行，亦可在搖瓶中進(jìn)行

22、，特點是快速簡便，工作量小，直觀性強（可直接觀察到生長圈、變色圈、透明圈等現(xiàn)象）缺點是：與發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層條件差距較大。l復(fù)篩：復(fù)篩：對突變株的生產(chǎn)性能作比較精確的定量測定采用復(fù)篩的方法。一般是將微生物接種在三角瓶內(nèi)的液體培養(yǎng)基中作振蕩培養(yǎng)，然后對培養(yǎng)液進(jìn)行分析測定。其優(yōu)點是：培養(yǎng)液接近發(fā)酵罐的條件，能夠測定較精確的數(shù)據(jù)。 篩選方法舉例1、產(chǎn)量突變型的篩選（2）抗藥性突變株的篩選：）抗藥性突變株的篩選： l（3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選：）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選：l與營養(yǎng)缺陷株有關(guān)的三種培養(yǎng)基lA、基本培養(yǎng)基：（、基本培養(yǎng)基：（MM，Minimal Medium）：）：指僅能滿足某微生物的野

23、生型菌株生長需要的最低成分組合培養(yǎng)基，不同種類的微生物其MM是不一樣的。lB、完全培養(yǎng)基（、完全培養(yǎng)基（CM Complete Medium）：）：凡能滿足一切營養(yǎng)缺陷株營養(yǎng)需要的培養(yǎng)基稱-。一般可在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素和堿基之類的天然物質(zhì)（如蛋白胨、酵母膏等）。lC、補充培養(yǎng)基（、補充培養(yǎng)基（SM Supple Madium）：）：凡只能滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型生長需要的組合培養(yǎng)基，稱為-。它是由基本培養(yǎng)基再添加某種營養(yǎng)缺陷型菌株所不能合成的物質(zhì)構(gòu)成的。l與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個體：與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個體：lA、野生型：（、野生型：（Wild Type）：）

24、：l在自然界中分離的任何微生物在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變之前的原始菌株，稱該種微生物的野生型。 A+B+lB、營養(yǎng)缺陷型（、營養(yǎng)缺陷型（Auxo Troph）：）：l野生菌株經(jīng)誘變后，由于喪失了某種酶的合成能力，因而只能在添加了該E合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基上生長，這類菌株稱-。A-B+lC、原養(yǎng)型（、原養(yǎng)型（Prototroph）：）：l一般指營養(yǎng)缺陷型突變株經(jīng)回變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。A+B+l營養(yǎng)缺陷型的篩選方法：營養(yǎng)缺陷型的篩選方法：l 誘變處理同上：淘汰野生型：。l抗生素法：抗生素法：主要是利用抗生素對微生物具有抑制作用。如，用青霉素法，可以殺死生長繁殖著的細(xì)菌，但不能

25、殺死未萌發(fā)或休眠的細(xì)菌。在含青霉素的培養(yǎng)基中野生型細(xì)胞被抑制，而“濃縮”缺陷型。l菌絲過濾法：菌絲過濾法：適用于絲狀的真菌或放線菌，原理是在基本培養(yǎng)基上，野生型孢子可萌發(fā)成菌絲，而缺陷型可休眠。如用合適的濾紙，可將缺陷型孢子過濾出來，如此重復(fù)便可得缺陷型。 （1） 檢出缺陷型：檢出缺陷型： 夾層培養(yǎng)法：夾層培養(yǎng)法： l限量補充培養(yǎng)法：限量補充培養(yǎng)法：把誘變處理后的細(xì)胞接種在含微量（0.01%）蛋白胨的基本培養(yǎng)基上，野生型迅速生長，而生長較慢的多為缺陷型。也可在基本培養(yǎng)基上加入微量相應(yīng)物質(zhì)，從而得到某一特定營養(yǎng)缺陷型。l逐個檢出法：逐個檢出法：把經(jīng)過誘變的細(xì)胞涂布在平板上，待長出單個菌落后，用接

26、種針把單個菌落逐個地分別接種到基本培養(yǎng)基和另一完全培養(yǎng)基上，培養(yǎng)，如果在完全培養(yǎng)基的某一個部位長出菌落，而在基本培養(yǎng)基上相應(yīng)部位卻不長，說明是一營養(yǎng)缺陷型菌株。l影印接種法：影印接種法：將誘變處理后的細(xì)胞涂布在一完全培養(yǎng)基的表面上，經(jīng)培養(yǎng)長出許多菌落，用影印法將其接種到另一基本培養(yǎng)基平皿上，培養(yǎng)，比較兩平板的菌落，如果發(fā)現(xiàn)在完全培養(yǎng)基上生長，而在基本培養(yǎng)基上不生長的菌落就是一個營養(yǎng)缺陷型。 l（4）鑒定缺陷型：）鑒定缺陷型：l可用生長譜法生長譜法來進(jìn)行，步驟是：把營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞或試管斜面上的孢子洗下，經(jīng)清洗，配成10-10個/mol的懸液，與基本培養(yǎng)基混合，在皿背面劃上若干區(qū)域，加上微量試劑；

27、培養(yǎng)；觀察后。l(5)營養(yǎng)缺陷型的應(yīng)用：營養(yǎng)缺陷型的應(yīng)用：l作為研究代謝途徑和雜交、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子等遺傳規(guī)律所不可缺少的標(biāo)記菌種；作為氨基酸、維生素、堿基等物質(zhì)生物測定的實驗菌種；在生產(chǎn)中，可直接用作發(fā)酵生產(chǎn)核苷酸、氨基酸等代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)菌株；也可作為菌種雜交、重組育種和利用基因工程進(jìn)行育種時所不可缺少的帶有特定基因標(biāo)記的親本菌株。 l概念：概念：凡把兩個不同性狀的個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新型遺傳個體的方式稱-或遺傳重組。l一、一、 原核微生物的基因重組：原核微生物的基因重組：l原核微生物基因重組的主要方式主要方式有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和

28、原生質(zhì)體融合等幾種形式。l受體菌直接接受供體菌的DNA片段而獲得部分新的遺傳性狀的現(xiàn)象就稱轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用。l感受態(tài)（感受態(tài)（competence）：指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。不同細(xì)胞感受態(tài)出現(xiàn)的時期不同，現(xiàn)已知感受態(tài)因子是一種胞外蛋白質(zhì)，它可以催化外來DNA片段的吸收或降解細(xì)胞表面某種成分，以讓細(xì)胞表面的DNA受體顯露出來，便于接合。l轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是DNA，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化所需的DNA濃度是極低的。l轉(zhuǎn)化現(xiàn)象在原核生物中較為普遍；在放線菌和蘭細(xì)菌以及少數(shù)真核微生物中也有報道，但較少。 轉(zhuǎn)化步驟：轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染： 如果把噬菌體或其他病毒的DNA（或RNA）抽提出來，讓它去

29、感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并進(jìn)而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒后代，這種現(xiàn)象稱轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染（transfection）。l它與轉(zhuǎn)化不同之處是病毒或噬菌體并非遺傳基因的供體菌，中間也不發(fā)生任何遺傳因子的交換或整合，最后也不產(chǎn)生具有雜種性質(zhì)的轉(zhuǎn)化子。 l以噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的DNA小片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)。獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞就稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子轉(zhuǎn)導(dǎo)子。（Transductant）l或（遺傳物質(zhì)通過噬菌體的攜帶而轉(zhuǎn)移的基因重組現(xiàn)象稱為-） l1、 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（Generalized Transeuction）l噬菌體在侵染寄主細(xì)胞后在寄主

30、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，在其裝配階段，正常情況下，是將自身的DNA包裝在衣殼里，異常情況下，將寄主細(xì)胞的一段DNA包裹進(jìn)去，而自身的DNA卻沒有包進(jìn)去，這種包裹寄主DNA片段的噬菌體，當(dāng)侵染新的寄主時，由于沒有自己的DNA，或自己的DNA不完整，不能在新的寄主細(xì)胞里進(jìn)行復(fù)制，因此不能使新寄主裂解，但卻能將所包裹的DNA片段帶入寄主并與寄主細(xì)胞的DNA進(jìn)行基因重組，從而使寄主細(xì)胞發(fā)生變異。l普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)這一名詞的來源是由于通過這種轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以把供體菌的任何一段DNA片段帶給受體細(xì)菌。 （1）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)：）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)： l在普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，進(jìn)入到受體菌的供體細(xì)菌DNA片段不與受體細(xì)菌DNA整合，也不進(jìn)行復(fù)制

31、，但隨著受體細(xì)菌的分裂，在兩個子細(xì)胞中只能有一個能得到這種來自供體細(xì)菌的DNA片段，這種轉(zhuǎn)導(dǎo)稱為-（Abortive Trsnsduction） l指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。l特點特點是：只局限于傳遞供體菌核染色體上的個別特定基因，一般為噬菌體整合位點兩側(cè)的基因；該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶；缺陷噬菌體的形成方式是由于它在脫離宿主核染色體過程中，發(fā)生低頻率的誤切或由于雙重溶源菌的裂解而形成；局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的產(chǎn)生要通過UV等因素對溶源菌的誘導(dǎo)并引起裂解后才產(chǎn)生。 （1）低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：指通過一般溶源菌

32、釋放的噬菌體所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因其只能形成極少數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)子（10-410-6），故稱。舉例說明：大腸桿菌噬菌體參與局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。 l（2）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)子（）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)子（HFT）在局限轉(zhuǎn)導(dǎo)中，若對雙重溶源菌進(jìn)行誘導(dǎo)，就會產(chǎn)生含50左右的局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物，用這種裂解物去轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌，就可獲得高達(dá)50左右的轉(zhuǎn)導(dǎo)子，故稱 l（3）溶源轉(zhuǎn)變）溶源轉(zhuǎn)變當(dāng)正常的溫和噬菌體感染其宿主而使其發(fā)生溶源化時，因噬菌體基因整合到宿主的核基因組上，而使宿主獲得了除免疫性外的新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱溶源轉(zhuǎn)變。l1、定義：、定義：l供體菌（雄）通過直接接觸（其性菌毛）受體菌（雌），而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程叫接合接合。前者

33、傳遞不同長度的單鏈DNA給后者，并在后者細(xì)胞中進(jìn)行雙鏈化或進(jìn)一步與核染色體發(fā)生交換、整合，從而使后者獲得供體菌的遺傳性狀。把通過接合而獲得新性狀的受體細(xì)胞就稱為接合子接合子。 2、E.coli的的4種接合型菌株：種接合型菌株： （1）F+菌株：菌株：（雄，F(xiàn)因子在細(xì)胞內(nèi)游離）。當(dāng)F+菌株與F-菌株接觸時，通過性菌毛將復(fù)制的F質(zhì)粒傳給F-使其變成F+ （2）F-菌株：菌株：雌株，無F因子和性菌毛，它可通過與F+和F，接合使其成為雄株，也可接受來自Hfr菌株的一部分或整套核基因組DNA，但這種情況較少。（3）Hfr菌株：（高頻重菌株：（高頻重組菌株）組菌株）在Hfr菌株細(xì)胞中，因F質(zhì)粒已從游離態(tài)轉(zhuǎn)

34、變成在核染色體組特定位點上的整合態(tài)，故Hfr菌株與F-菌株相接合后，發(fā)生基因重組的頻率要比單純用F+與F-接合后的頻率高出數(shù)百倍，故名。 l（4）F菌株菌株當(dāng)Hfr菌株細(xì)胞內(nèi)的F質(zhì)粒因不正常切離而脫離核染色體組時，可重新形成游離的、但攜帶整合位點鄰近一小段核染色體基因的特殊F質(zhì)粒，稱F質(zhì)?；騀因子。凡攜帶F質(zhì)粒的菌株，稱為初生F菌株，其遺傳性狀介于F+與F-菌株之間；通過F菌株與F一菌株的接合，可使后者也成為 F菌株，這就是次生 F菌株，它既獲得了 F質(zhì)粒，同時又獲得了來自初生F菌株的若干原屬 Hfr菌株的遺傳性狀，故它是一個部分雙倍體（圖 7-30）。以F質(zhì)粒來傳遞供體基因的方式，稱為F質(zhì)粒

35、轉(zhuǎn)導(dǎo)或F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、性導(dǎo)或F質(zhì)粒媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)。與上述構(gòu)建不同Hfr相似的是，因為F質(zhì)?？烧显贓.coli核染色體組的不同位置上，故可分離到一系列不同的F質(zhì)粒，從而可用于繪制細(xì)菌的染色體圖 以上三種雄性菌株通過性纖毛與雌性菌株接合，可產(chǎn)生以下結(jié)果： 1、F+和F-接合產(chǎn)生二個F+菌株 2、 F、菌株和F-菌株接合產(chǎn)生二個F、菌株 3、Hfr和F-接合情況較為復(fù)雜 通過人為的方法，使遺傳性不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀的、遺傳性穩(wěn)定的融合子的過程，稱為原生質(zhì)體融合。 ( 四）原生質(zhì)體融合（四）原生質(zhì)體融合（protoplast fusion） 步驟步驟 原核

36、細(xì)胞與真核細(xì)胞都能進(jìn)行融合。l在真核微生物中，基因重組的基本方式有：有性雜交、準(zhǔn)性雜交、原生質(zhì)體融合和轉(zhuǎn)化等形式。我們只介紹有性雜交和準(zhǔn)性雜交。 l（一）（一） 有性雜交：有性雜交：l是發(fā)生在細(xì)胞水平上的一種遺傳重組方式。 凡能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌和霉菌，原則上都可采用有性雜交的方法進(jìn)行育種。 l甲菌、乙菌分別接種產(chǎn)生子囊減分產(chǎn)生4個子囊孢子/子囊分別將子囊沖洗下來破壞子囊使孢子釋放（E法研磨）分別離心得孢子（n）將孢子涂布平板得菌落（n）將菌落細(xì)胞混合離心，使接觸新組合雙倍體出現(xiàn)篩選良種 l準(zhǔn)性生殖準(zhǔn)性生殖是一種類似于有性生殖，但更原始的一種生殖方式，它可使同種生物兩個不同菌株的體細(xì)胞發(fā)生融

37、合，且不以減數(shù)分裂的方式導(dǎo)致低頻率的基因重組的一種育種方式。l準(zhǔn)性雜交常見于真菌、尤其是半知菌中。l過程：過程：l同種不同菌株的菌絲相互靠攏并接觸-質(zhì)配、核配異核體（偶爾）核融合形成雜合二倍體有絲分裂雜合雙倍體分離篩選育種 準(zhǔn)性雜交舉例 灰黃霉素生產(chǎn)菌蕁麻青霉的準(zhǔn)性育種 選擇親本：即選擇來自不同菌株的合適的營養(yǎng)缺陷型作為準(zhǔn)性雜交的親本。選擇親本：即選擇來自不同菌株的合適的營養(yǎng)缺陷型作為準(zhǔn)性雜交的親本。 強制異合：即用人為的方法強制兩菌株形成異核體。強制異合：即用人為的方法強制兩菌株形成異核體。 移單菌落：將培養(yǎng)皿上長出的這種單菌落移種到基本培養(yǎng)基移單菌落：將培養(yǎng)皿上長出的這種單菌落移種到基本培

38、養(yǎng)基的斜面上。的斜面上。 驗穩(wěn)定性：就是檢驗新菌株究竟是不穩(wěn)定的異核體，還是穩(wěn)定的雜合二倍體驗穩(wěn)定性：就是檢驗新菌株究竟是不穩(wěn)定的異核體，還是穩(wěn)定的雜合二倍體。 促進(jìn)變異：促進(jìn)變異： l又叫遺傳工程或重組遺傳工程或重組DNA技術(shù)技術(shù)。是用人為方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)（DNA大分子）提取出來，在離體情況下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，再一起導(dǎo)入某一更容易生長、繁殖的受體細(xì)胞中，讓外源DNA進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)。l基因工程是一種在離體情況下，人為可以設(shè)計的可超遠(yuǎn)緣雜交的一種定向育種方式。我們把獲得新功能的微生物稱為“工程菌工程菌”，動植物稱為“工程動植物

39、或轉(zhuǎn)基因動植物工程動植物或轉(zhuǎn)基因動植物”。 l1、 取得目的基因：取得目的基因：方法：A：可用密度梯度超離心方法，從供體生物中得到；B；通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用由mRNA合成DNA。C：由化學(xué)方法合成特定功能的基因。2、選擇適當(dāng)?shù)妮d體：、選擇適當(dāng)?shù)妮d體：載體必須符合以下條件：(1)具有自我復(fù)制能力；（2）能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖；（3）載體上最好只有一個限制性內(nèi)切酶的切口，使目的基因能融合到載體的固定位置上；（4）載體上必須有一種選擇性遺傳標(biāo)記，以便及時把極少數(shù)“工程菌”或“工程細(xì)胞”選擇出來。3、目的基因與載體、目的基因與載體DNA的體外重組的體外重組4、將重組載體引入受體細(xì)胞：、將重組載體引入受體

40、細(xì)胞：（一）工業(yè)上：（一）工業(yè)上：（二）農(nóng)業(yè)上：（二）農(nóng)業(yè)上：（三）醫(yī)療事業(yè)：（三）醫(yī)療事業(yè)：（四）環(huán)保事業(yè)：（四）環(huán)保事業(yè)：（五）促進(jìn)生物學(xué)基本理論的研究。（五）促進(jìn)生物學(xué)基本理論的研究。 l在基因工程中，外源DNA片段進(jìn)行克隆，需要一個合適的載體，將其運送到細(xì)胞中并進(jìn)行復(fù)制與擴增，這種以擴增外源DNA為目的的載體，稱為克隆載體（cloning vector）.l目前基因工程中使用的載體均來自微生物，主要包括六大類：質(zhì)粒載體、入噬菌體載體、柯斯質(zhì)粒載體、M13噬菌體載體、真核細(xì)胞的克隆載體、人工染色體等。l我們來了解一下：l 特性：（1）具有獨立復(fù)制起點，這是必須的（2）具有較小的相對分子量

41、。有利于DNA的分離操作，但攜帶的DNA也小（3）具有較高的拷貝數(shù)。每個細(xì)胞中要含有數(shù)千個拷貝（4）具有便于選擇的標(biāo)記。（5）易于導(dǎo)入細(xì)胞（6）具有安全性。此質(zhì)粒不具轉(zhuǎn)移功能，可防止攜帶外源DNA的重組質(zhì)粒擴散到實驗室外，造成危害。l種類：PBR322（最常用最具代表性）、PUC系列、PGEM系列等。（都是人工構(gòu)建的） l是一類很有價值的載體。具有很多優(yōu)點：（1）遺傳背景清楚（2）容量大（可23KB外源DNA）（3）具有較高的感染率l（三）（三） 柯斯質(zhì)粒：柯斯質(zhì)粒：l柯斯質(zhì)粒（cosmid vector）即粘性載體，是由入噬菌體的粘性末端和質(zhì)粒構(gòu)成。它含有來自質(zhì)粒的一個復(fù)制起點、抗藥性標(biāo)記、一個或多個限制酶位點，以及來自噬菌體粘性末端的DNA片段，即COS位點。l優(yōu)點：（1）具高感染率（2）具質(zhì)粒DNA的復(fù)制方式（3）可克隆大片段外源DNA。 lM13是大腸桿菌絲狀噬菌體，其基因組為環(huán)狀SSDNA，感染雄性（F+或Hfr）大腸桿菌并進(jìn)入細(xì)胞后，可變成復(fù)制型（RF）DSDNA，然后以滾環(huán)方式復(fù)制出SSDNA。野生型M13不能作為載體，經(jīng)