組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)二

1、實(shí)驗(yàn)二ms培養(yǎng)基母液配制與保存一、目的要求學(xué)習(xí)培養(yǎng)基母液的配制，為培養(yǎng)基的配制做準(zhǔn)備。二、基本原理培養(yǎng)基是石物離體培養(yǎng)賴以生存的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，是為離體培養(yǎng)材料提供近似活體生 存的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，主耍包括水、大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)復(fù)合物、糖、凝 固劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。在配制培養(yǎng)基前，為了使用方便和用量準(zhǔn)確，常將培 養(yǎng)基成分首先配制成比實(shí)際培養(yǎng)基濃度大若干倍的母液，然后在配制培養(yǎng)基時(shí)， 再根據(jù)所需濃度按比例稀釋。木實(shí)驗(yàn)以ms培養(yǎng)基為例，學(xué)習(xí)培養(yǎng)基母液的配制。三、試劑與主要用具1、儀器、用具分析天平(感量o.olg和o.ooolg)、藥匙、玻棒、稱量紙、吸水紙、滴管、洗 瓶、標(biāo)簽紙、燒杯(50ml、

2、100ml> 200ml)、容量瓶(100ml、200ml、500ml> 1000ml)、試劑瓶(100ml、200ml> 500ml、1000ml)、量杯、量筒、移液管、 洗耳球、電爐等。2、試劑(1) 95%乙醇、lmol/l naoh、lmol/l hc1o(2) ms培養(yǎng)基各成分試劑。(3) 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑:2, 4-d、6-ba、iaa、naa等。(4) 洗滌劑。四、方法步驟1、大量元素母液的配制按照培養(yǎng)基配方的用量，把各種化合物擴(kuò)大10倍，按照表屮的次序分別準(zhǔn)確稱 量后，分別用50ml燒杯，加入蒸館水30 ml溶解(可以加熱至60°c70°c,

3、促 其溶解)。溶解后，按順序倒入-大燒杯屮(燒杯屮事先加入約50ml的蒸憎水, 廿的避免由于鹽濃度過高使鈣離子與磷酸根離子、硫酸根離子形成不溶于水的沉 淀)，注意最后加入氯化鈣溶液，混勻，用250ml容量瓶定容。將配制好的母液 倒入試劑瓶屮，貼好標(biāo)簽，保存于4°c冰箱屮待用。ms培養(yǎng)基大量元素母液(10倍)的配制劑量母液化合物名稱培養(yǎng)基用量 (mg/l)擴(kuò)大 倍數(shù)稱取量(mg)母液體積 (ml)1l培詐基吸 取母液量 (ml)大 量11*kno319004750nhaos16504125mgso4 7h20370109252501007l素kh2po4170425cacl2 2h,0

4、44011002、微量元素母液的配制按照培養(yǎng)基配方的用量，將微量元素各種化合物擴(kuò)大100倍，用萬分z天平 分別準(zhǔn)確稱取，可以混合溶解，最后定容。將配制好的母液倒入試劑瓶中，貼 好標(biāo)簽，于4°c保存。ms培養(yǎng)基微量元素母液(100倍)的配制劑量母液化合物名稱培養(yǎng)基用量 (mg/l)s稱取量(mg)母液體 積(ml)il培養(yǎng)基吸 取母液量 (ml)mnsoi 4h2022.3223微 量 元 素znso4 7h.08.686h3bo36.262ki0. 831008. 310010na.moo, 21l00. 252.5cusor 5ii200. 02510ml*cocl2 6h200.

5、 02510ml*、因天平存在誤差，為減少誤差帶來的影響，建議稱取2. 5g,溶解并 定容至100ml容量瓶中，然后移取10ml,加入混合液中。3、鐵鹽母液的配制常用的鐵鹽是fes04 7h20和na2-edta的螯合物，必須單獨(dú)配成母液。配制時(shí)， 按照擴(kuò)大后的用量,分別稱取feso4 - 7h20和脳-edta,分別溶解后,將fcs0“ 溶液緩緩倒入na2-edta溶液(需加熱溶解)，攪拌均勻使其充分螯合，定容后貯 放于棕色玻璃瓶中，并保存于冰箱中。ms培養(yǎng)基鐵鹽母液(100倍)的配制劑量母液化合物名稱培養(yǎng)基用 量(mg/l)擴(kuò)大 倍數(shù)稱取量(mg)母液 體積 (ml)1l培養(yǎng)基吸 取母液量

6、(ml)鐵鹽na2-edta37. 310037310010feso, - 7h2027.82784、有機(jī)物母液的配制按照表中各成分濃度擴(kuò)大后的用量，用感量o.ooolg天平分別稱量各有機(jī)物?；?合溶解定容，製入試劑瓶小，寫好標(biāo)簽，放入冰箱小保存。ms培養(yǎng)基有機(jī)物母液(100倍)的配制劑量母液有機(jī)物 名稱培養(yǎng)基 用量(mg/l)擴(kuò)大 倍數(shù)稱取量(mg)母液體 積(ml)1l培養(yǎng)基吸 取母液量 (mb)有機(jī)物甘氨酸 鹽酸硫鞍 素vbi 鹽酸毗哆 醇 煙酸 肌醇1oo02o0554010020455100010010一般有機(jī)物都溶于水,但葉酸(vbc)先用lmol/l naoii溶液溶解;vh (

7、生物素) 先用1 mol/l naoh溶液溶解；* vi)3比亡應(yīng)先用95%乙醇溶解，然后再用蒸纟留水 定容。5、激素母液的配制激索母液必須分別配制，濃度根據(jù)培養(yǎng)基配方的需要量靈活確定，一般是0.1 2 mg/nil,根據(jù)需要確定配制的濃度。稱量激素要用感量萬分z大平。配制激 素母液時(shí)應(yīng)注意，各激素的溶劑不同，具體見下表。植物組織培養(yǎng)中常用植物激素、牛氏調(diào)節(jié)物質(zhì)的溶劑中文名縮寫溶劑2, 4-二氯苯氧乙酸2, 4-dnaoh/乙醇卩引味乙酸iaanaoii/乙醇卩引味丁酸1banaoh/乙醇a-蔡乙酸naanaoh/乙醇6-節(jié)基氨基腺喋吟6-banaoh/hcl激動(dòng)索ktnaoh/hcl脫落酸a

8、banaoii玉米素ztnaoh赤宙素ga3乙醇腺喋吟adeh20注：稱取lomgnaa溶解后定容至100ml,即得到0. lmg/ml naa貯備液。 稱取100mg6-ba溶解后定容至100ml,即得到lmg/ml 6-ba貯備液。6、在配制母液時(shí)應(yīng)注意（1）培養(yǎng)基各試劑應(yīng)使用分析純。（2）在稱量時(shí)應(yīng)防止藥品間的污染，藥匙、稱量紙不能混用，每種試劑使用一 把藥匙，多出的試劑原則上不能再倒回原試劑瓶。（3）母液配制好后，貼上標(biāo)簽，寫清母液名稱、擴(kuò)大倍數(shù)、配制日期，并存放 在4°c冰箱中。使用前，要進(jìn)行檢查，若發(fā)現(xiàn)試劑中有絮狀沉淀或長(zhǎng)菌或鐵鹽母 液的顏色變?yōu)樽睾稚?，都不?yīng)再使用。五、

9、結(jié)果與分析記錄木小組配制的培養(yǎng)基母液種類、擴(kuò)大倍數(shù)、母液配制體積、母液中各成分的 稱取量。ms大量元素母液的配制：按照ms培養(yǎng)基配方的用量擴(kuò)大20倍，將大量元素配制成20倍的母液。配制時(shí) 先用量筒量取蒸謂水800ml,放入1000ml的燒杯屮，依次分別稱取kno3 38g;nh4n03 33g, mgso.- 7h20 7. 4g, kh2p04 3. 4g, cacl2 2h20 8 . 8g,按順序先后倒 入燒杯中，用玻璃棒攪動(dòng)，待第一種化合物溶解后再加入第二種化合物，當(dāng)最后 一種化合物完全溶解后，將溶液倒入1000ml的容量瓶，用蒸鐳水定容至1000ml, 然后，倒入細(xì)口磨砂試劑瓶屮，貼

10、上標(biāo)簽，注明配制日期、擴(kuò)大倍數(shù)、配制人姓 名、置于4°c冰箱保存?zhèn)溆?。配制培養(yǎng)基時(shí)每升ms培養(yǎng)基吸取該母液量為50ml o ms微量元素母液的配制：將ms培養(yǎng)基配方中微量元索的無機(jī)鹽用量分別擴(kuò)大1000倍，用電子天平分別依 次稱取 mnsot -4il0 22. 3g, zns04 -7h20 8. 6g , il3b036 . 2g, ki 0. 83g, na2mo04 -2il0 0. 25g, cusot - 5h20 0. 025g, cocl2 6h20 0 . 02 5g,并用重蒸水逐個(gè)溶解,待全 部溶解用容量瓶定容后，裝入1000ml倒入細(xì)口磨砂試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注

11、明 配制日期、擴(kuò)大倍數(shù)、配制人姓名、置于4°c冰箱保存?zhèn)溆?。配制培養(yǎng)基時(shí)每升 ms培養(yǎng)基吸取該母液量為lml o鐵鹽母液的配制：在電子天平上準(zhǔn)確稱量2. 78g硫酸亞鐵（feso勺 7也0）和3. 73g乙二胺四乙酸鈉 （na-edta）,分別倒入盛有400ml蒸徭水的燒杯中，微加熱并不斷攪拌使之全部溶 解。將兩種溶液倒入同一個(gè)1000ml的容量瓶屮，混合均勻后，用蒸憎水定容至 1000ml,并倒入棕色磨口試劑瓶中，經(jīng)室溫放置一段時(shí)間令其充分反應(yīng)后，貼上 標(biāo)簽，注明配制日期、擴(kuò)大倍數(shù)、配制人姓名、置于4°c冰箱保存?zhèn)溆?。如果?新配制的鐵鹽母液立即放入冰箱屮。則會(huì)容易形成沉

12、淀。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配制 looomlms培養(yǎng)基吸取此母液10mloms有機(jī)母液的配制：用電子天平依次稱?。杭〈迹ōh(huán)己六醇）5000mg,鹽酸硫胺索（維生索bl） 5mg, 煙酸25mg,甘氨酸loomg,鹽酸毗哆醇（維生素b6） 25mg,用蒸鐳水依次溶解 并定容后，裝入500ml的磨口瓶屮，貼上標(biāo)簽，注明配制日期、擴(kuò)大倍數(shù)、配制 人姓名，置于4°c冰箱保存?zhèn)溆?。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配制1lms培養(yǎng)基吸取該母 液 10mlo植物生長(zhǎng)物質(zhì)母液的配制：（1）2, 4-d母液:準(zhǔn)確稱量2,4-d 50mg,先用廣3ml90%乙醇完全溶解后,加蒸憾 水定容；也可以用少量堿（如lmol/氫氧化鉀

13、、氫氧化鈉）溶液，使z屮和成為 鈉鹽或鉀鹽，在水中溶解，再加水定容至100ml,即配成濃度為500ml/l的母液。 貼上標(biāo)簽，注明名稱、濃度和配制日期，放入4°c冰箱保存。naa母液的配制過 程與2, 4-d相同。（2）6-ba母液:準(zhǔn)確稱量50mg 6-ba,加入少量堿溶液（如lmol/氫氧化鉀、氫氧 化鈉）或稀堿液（lmol/l鹽酸）溶液使之完全溶解后，加蒸憎水定容至100ml, 即配制成濃度為500mg/l的6-ba的母液。轉(zhuǎn)入磨口試劑瓶中，并貼上標(biāo)簽，注 明母液名稱、濃度和配制口期，放入4°c冰箱保存?zhèn)溆谩?、大量元素母液的配制先用量筒稱量適當(dāng)蒸徭水放入500ml燒

14、杯中，按照配方表中用量依次分別稱?。?nilnoa, kn03 , kh2po4, mgsoj 7也0, cacl2 - 2h20,待第一種化合物完全溶解后再 加入第二種化合物，當(dāng)最后一種化合物完全溶解后，將溶液轉(zhuǎn)移至500ml容量瓶 中，用蒸幗水定容至500ml ,然后轉(zhuǎn)移至細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名 稱，放大倍數(shù)，配制口期，配制人，并置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、微量元素母液的配制按照配方表中用量用電子天平依次稱取mns04 4也0, zns04 7h20h3bo3, ki, na2mo04 2h20, cus04 5h20, cocl2 6h20,按制備母液 i 的方法逐個(gè)溶 解，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，然后定容至500ml,轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明 母液名稱，放大倍數(shù)，配制口期，配制人，并置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、鐵鹽母液的制備把fes04 7h20和na2 edta分別置于適量蒸鐳水中，加熱攪拌使之完全溶解，保 持加熱，把fes0,i倒入na2_edta溶液屮并攪拌，接近沸騰吋停止加熱，冷卻后調(diào) 卩11到5.5,將溶液轉(zhuǎn)移至500ml容量瓶中，用蒸餾水定容至500ml,轉(zhuǎn)入細(xì)口試 劑瓶中，用力振蕩12min,貼上標(biāo)簽，注明母液名稱，放大倍數(shù)，配制日期， 配制人，并置于冰箱屮保存?zhèn)溆谩?、有機(jī)化合物母液的制備