實驗二 GSTZ基因的PCR擴增

1、實驗二實驗二 gstz基因的基因的pcr擴增擴增amplifying gstz gene by polymerase chain reaction核酸的體外擴增v真核細胞內dna的復制v聚合酶鏈反應（ polymerase chain reaction，pcr）the nobel prize in chemistry 1993for contributions to the developments of methods within dna-based chemistry for his invention of the polymerase chain reaction (pcr) met

2、hod kary b. mullisla jolla, ca, usa b:1944 一、一、pcr的基本原理：的基本原理：一種模擬天然dna復制的體外擴增法pcr反應三部曲：變性(denature)：加熱使雙鏈dna解開螺旋退火(annealing) 在退火溫度條件下引物同模板雜交延伸(extend)在taq dna聚合酶，dntps，mg2+和合適ph緩沖液存在條件下延伸引物 dna模板模板 template 引物引物 primers dntps 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 taq dna polymerase 反應緩沖液反應緩沖液 reaction buffer mgcl2 試劑原液濃度工作濃

3、度50l體系pcr緩沖液 1015l上游引物10mol/l0.5mol/l2.5l下游引物10mol/l0.5mol/l2.5ldntps2.5mmol/l 200mol/l4lmgcl225mmol/l1.5mmol/l3ldna模板 0.110ngddh2o補足47.5ltaq酶1u/l2.5u/50l體系2. 5lpcr parametervpre-denature: 94 5minvpcr cycles:denature 94 40secannealing 58 35secextend72 1min30secvtotally 3540 cyclesvpost-extend: 72 7m

4、in dna模板模板 template 引物引物 primers dntps 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 taq dna polymerase 反應緩沖液反應緩沖液 reaction buffer mgcl2 dna模板模板 template 引物引物 primers dntps 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 taq dna polymerase 反應緩沖液反應緩沖液 reaction buffer mgcl2 引物-人工合成的寡核苷酸v一般pcr反應中引物的終濃度為0.1-1mol/l，在此范圍內產(chǎn)物量基本相同。引物濃度低于0.1mol/l時，產(chǎn)物量降低；引物濃度過高會引導非特異產(chǎn)物擴增，還會增加引物二聚

5、體的形成。引物設計原則：軟件+經(jīng)驗v引物長度以15-30個堿基為宜；v引物堿基盡可能隨機分布，g+c含量宜在4555%左右；v引物內部、引物之間不應形成二級結構；v避免重復多聚堿基；v引物與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其他序列無明顯同源性；v兩個引物的tm值要盡可能接近； 重組時引物設計的其它幾個問題：1.移碼突變 2.酶切位點3.保護堿基引物引物aattggatccatggcgaattccggcgaaga (bamh i)引物引物baccaagcttgatggtggaagaaggagc (hind iii) dna模板模板 template 引物引物 primers dntps 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 t

6、aq dna polymerase 反應緩沖液反應緩沖液 reaction buffer mgcl2 三磷酸脫氧核苷（dntps）v四種三磷酸脫氧核苷（datp、dctp、dgtp、dttp）是dna合成的基本原料，工作濃度應為20200mmol/l。所用的四種dntp的濃度應相等，以使錯誤摻入率降至最低。dntps濃度過低則反應速度下降， dntps濃度過高則擴增特異性降低，而且當dntp濃度高于50mm時也會抑制taq dna聚合酶的活性。 dna模板模板 template 引物引物 primers dntps 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 taq dna polymerase 反應緩沖液反應緩沖

7、液 reaction buffer mgcl2 耐熱dna聚合酶 vtaq聚合酶是從耐熱菌（thermus aquatious）中提取出來的耐熱酶，95仍有活性。該酶的應用濃度一般為12.5u/50l反應體系，然而，酶的用量可依據(jù)不同的模板分子或引物而變化。酶濃度過高時，會出現(xiàn)非特異性擴增；過低時擴增產(chǎn)物量很低。 反應緩沖液反應緩沖液vtris-hclvkclv酶的穩(wěn)定劑a typical reaction buffer for pcr would something like: 10mm tris, ph 8.3 50mm kcl 0.01% gelatin dna模板模板 template

8、 引物引物 primers dntps 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 taq dna polymerase 反應緩沖液反應緩沖液 reaction buffer mgcl2 mg2+ vmg2+ 是taq dna聚合酶活性所必需的。mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性、產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等等。generally, low mg2+ leads to low yields (or no yield)high mg2+ leads to accumulation of nonspecific products (mispriming).the mgcl2 concentration in

9、the final reaction mixture is usually between 0.5 to 5.0mm, 試劑原液濃度工作濃度50l體系pcr緩沖液 1015l上游引物10mol/l0.5mol/l2.5l下游引物10mol/l0.5mol/l2.5ldntps2.5mmol/l 200mol/l4lmgcl225mmol/l1.5mmol/l3ldna模板 0.110ngddh2o補足47.5ltaq酶1u/l2.5u/50l體系2. 5l循環(huán)參數(shù) v變性溫度和時間變性溫度和時間 v復性溫度和時間復性溫度和時間 v延伸溫度和時間延伸溫度和時間 v循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù) 變性溫度與時間變性

10、溫度低，解鏈不完全是導致pcr失敗的最主要原因。一般情況下，93941min足以使模板dna變性，若低于93則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或pcr產(chǎn)物完全變性，就會導致pcr失敗。 退火 (復性)溫度與時間v退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：tm值(解鏈溫度)=4(g+c)2(a+t)復性溫度=tm值-(210)v在tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高pcr反應的特異性。v復性時間一般為3060sec，足以使引物與

11、模板之間完全結合。 延伸溫度與時間vtaq dna聚合酶的生物學活性：7080 150核苷酸/s/酶分子70 60核苷酸/s/酶分子55 24核苷酸/s/酶分子vpcr反應的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。vpcr延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1kb以內的dna片段，延伸時間1min是足夠的。34kb的靶序列需34min；擴增10kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定pcr擴增程度。pcr循環(huán)次數(shù)主要取決于模板dna的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選

12、在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840cyclernthreshold104103102pcr parametervpre-denature: 94 3minvpcr cycles:denature 94 30sec1minannealing tm-(210) 30sec1minextension72 based on the length of ampliconvtotally 30-40 cyclesvpost-extension:72 7min 無擴增產(chǎn)

13、物 非特異性擴增 拖尾 假陽性 無擴增產(chǎn)物1.1. 模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2. bufferbuffer對樣品不合適對樣品不合適3.3. 引物設計不當或者發(fā)生降引物設計不當或者發(fā)生降解解4.4. 反應條件：反應條件：退火溫度太高，延退火溫度太高，延伸時間太短伸時間太短 原原因因對對策策1.1. 純化模板或者使用試劑盒提取純化模板或者使用試劑盒提取模板模板dnadna或加大模板的用量或加大模板的用量2.2. 更換更換bufferbuffer或調整濃度或調整濃度3.3. 重新設計引物（避免鏈間二聚重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一體和鏈內二級結構）

14、或者換一管新引物管新引物4.4. 降低退火溫度、延長延伸時間降低退火溫度、延長延伸時間現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無正對照有條帶，而樣品則無； 非特異性擴增 現(xiàn)象：現(xiàn)象：pcrpcr擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶?；蛐?，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。1.1.引物特異性差引物特異性差2.2.模板或引物濃度過高模板或引物濃度過高3.3.酶量過多酶量過多4.4.mgmg2+2+濃度偏高濃度偏高5.5.退火溫度偏低退火溫度偏低6.6.循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原原因因對對策策1.1.重新設計引物

15、或者使用巢重新設計引物或者使用巢式式pcrpcr2.2.適當降低模板或引物濃度適當降低模板或引物濃度3.3.適當減少酶量適當減少酶量4.4.降低鎂離子濃度降低鎂離子濃度5.5.適當提高退火溫度或使用適當提高退火溫度或使用二階段溫度法二階段溫度法6.6.減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 非特異性擴增 拖尾 現(xiàn)象：現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈產(chǎn)物在凝膠上呈smear狀態(tài)狀態(tài)。 m 1 21.1.模板不純模板不純2.2.bufferbuffer不合適不合適3.3.退火溫度偏低退火溫度偏低4.4.酶量過多酶量過多5.5.dntpdntp、mgmg2+2+濃度偏高濃度偏高6.6.循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原原因因對對策

16、策1.1.純化模板純化模板2.2.更換更換bufferbuffer3.3.適當提高退火溫度適當提高退火溫度4.4.適量用酶適量用酶5.5.適當降低適當降低dntpdntp和鎂離子的和鎂離子的濃度濃度6.6.減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 拖尾 假陽性（篩選轉基因、檢測基因表達情況（篩選轉基因、檢測基因表達情況) )原因：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物 對策：1. 1.操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；2.2.除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑

17、或器材均應高壓消毒。所用離心管除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。及加樣槍頭等均應一次性使用。3.3.各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。 pcr的應用v高特異性v高靈敏度 防止污染v簡便快速v用途廣泛：dna測序測序各對病毒特異性引物各對病毒特異性引物pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果bsendai；chpiv 1；dhpiv 2；esv 5；fhpiv 3；ghpiv 4；hinf a；iinf b；a為分子量為分子量marker（2kbp,1kbp,750bp,500bp,25

18、0bp,100bp）abcdefghi病原體檢測病原體檢測定量定量pcrpcrpcr phasestraditional pcr detectiony=x 2n轉染轉染p15質粒及質粒及sirna后后p15基因表達情況基因表達情況a：轉染p15質粒及sirna后p15基因的表達情況m: 分子marker dl 2,000; 1 control; 2 轉空載體; 3 轉入p15質粒; 4 轉入p15質粒+ p15 sirna; 5.轉入p15質粒+ 無意義sirna半定量半定量pcr “semi-qpcr”實時定量實時定量pcr “real-time qpcr” cap pcr vesselth

19、ermal block samplelens0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.900510152025303540pcr cycle numberbaseline regionthresholdctno template control samplenormalised reporter fluorescence (rn)geometric phasepcr efficiency1ct: threshold cyclethe calculated fractional cycle number at which the fluorescence pas

20、ses the fixed thresholdct值極具重現(xiàn)性pe公司在同一臺pcr儀上對相同模板進行96次擴增的擴增曲線圖ct與初始模板的關系初始dna量越多, 熒光達到閾值時所需要的循環(huán)數(shù)(ct 值)越少起始模板的對數(shù)濃度與ct呈線性關系，根據(jù)樣品的ct值就可計算出樣品中所含的模板量0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840cyclernthreshold104103102常用的熒光定量常用的熒光定量pcrpcr試劑試劑taqman probehybridises with the target ampliconis 3

21、 terminally blocked (cannot be extended by the polymerase) has two fluorescent dyes attached:1. reporter (r)2. quencher (q) 35fluorogenic 5 nuclease assay(taqman chemistry)rqforward primerreverse primer33553551. polymerisationproberq33553552. strand displacementq33553553. cleavager3553554. polymerisation completedqrr = reporterq = quencher3v隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，taqman探針釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關系vtaqman探針應用基因檢測、病毒定量、細胞因子基因定量、癌細胞基因微突變檢測等v其結果都具有高特異性與高敏