PCR擴(kuò)增和電泳檢測

1、PCR擴(kuò)增和電泳檢測實驗實驗13 DNA13 DNA片段的片段的PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增1 1、用、用PCRPCR技術(shù)對技術(shù)對DNADNA進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行擴(kuò)增2 2、用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對擴(kuò)增后的、用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對擴(kuò)增后的DNADNA進(jìn)行檢測進(jìn)行檢測 PCR擴(kuò)增和電泳檢測電電 泳泳觀察PCR反應(yīng)反應(yīng) 實驗步驟PCR擴(kuò)增和電泳檢測DNADNA在體內(nèi)復(fù)制的條件是什么？在體內(nèi)復(fù)制的條件是什么？模板：模板：酶：酶：原料、能量：原料、能量：解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶等。聚合酶等。DNADNA分子的每條鏈分子的每條鏈dATPdATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP引物：引物：溫

2、和的反應(yīng)條件溫和的反應(yīng)條件PCR擴(kuò)增和電泳檢測DNADNA分子的結(jié)構(gòu)分子的結(jié)構(gòu)PCR擴(kuò)增和電泳檢測合成合成DNADNA分子的原料分子的原料脫氧核苷三磷酸脫氧核苷三磷酸PCR擴(kuò)增和電泳檢測合成合成DNADNA分子的原料分子的原料脫氧核苷三磷酸脫氧核苷三磷酸dATP dGTP dCTP dTTPPCR擴(kuò)增和電泳檢測 聚合反應(yīng)機(jī)理聚合反應(yīng)機(jī)理：53OPGOPA模板鏈CTA35引物3355OHOPGOPAOOHTP模板鏈CTA35引物333555POOHTPP35PCR擴(kuò)增和電泳檢測DNA聚合酶聚合酶PCR擴(kuò)增和電泳檢測不同細(xì)胞的細(xì)胞周期不同細(xì)胞的細(xì)胞周期 不同生物細(xì)胞不同生物細(xì)胞 需要的時間需要的時

3、間細(xì)細(xì) 菌菌一般是一般是20203030分鐘分鐘蠶豆根尖細(xì)胞蠶豆根尖細(xì)胞17.317.3小時小時小鼠十二指腸細(xì)胞小鼠十二指腸細(xì)胞15.315.3小時小時人的肝細(xì)胞人的肝細(xì)胞2222小時小時人的宮頸癌細(xì)胞人的宮頸癌細(xì)胞22.522.5小時小時PCRPCR技術(shù)可在技術(shù)可在幾小時內(nèi)幾小時內(nèi)，將特定核酸序列擴(kuò)增將特定核酸序列擴(kuò)增百萬倍百萬倍! !PCR擴(kuò)增和電泳檢測PCR的概念的概念 PCRPCR（ P Polymerase olymerase C Chain hain R Reaction,eaction,聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)）是指在體外，通過特異是指在體外，通過特異DNADNA引物引物擴(kuò)增擴(kuò)增

4、核酸分子中核酸分子中某個某個特定區(qū)域特定區(qū)域的技術(shù)。的技術(shù)。PCR擴(kuò)增和電泳檢測 PCR的反應(yīng)體系的反應(yīng)體系DNA模板模板原料：原料： dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP) ； 酶：酶： Taq聚合酶聚合酶（嗜熱細(xì)菌中分離得到）（嗜熱細(xì)菌中分離得到）引物：引物：（單鏈（單鏈DNA片段）片段）MgMg2+2+（維持酶活性所必需）（維持酶活性所必需）PCRPCR緩沖液：緩沖液：維持維持pH，保護(hù)，保護(hù)Taq酶酶 PCR擴(kuò)增和電泳檢測PCR技術(shù)原理技術(shù)原理變變 性性退火退火 延伸延伸 PCR擴(kuò)增和電泳檢測PCR三步曲三步曲 預(yù)變性預(yù)變性保溫保溫 變變 性性9095延伸延伸 7075退火退

5、火 4060PCR擴(kuò)增和電泳檢測PCR儀儀PCR擴(kuò)增和電泳檢測用于用于PCR的預(yù)混液（的預(yù)混液（ 500 L 體系）：體系）： ddH2O 310 310 L L1010butter 5butter 50 0 L LMgClMgCl2 2 40 40 L LdNTPdNTP混合液混合液 2020 L L引物引物1 251 25 L L引物引物2 252 25 L L模板模板DNA 2525 L L Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 5 5 L L 標(biāo)記一個微量離心管，用取樣器取標(biāo)記一個微量離心管，用取樣器取20 L的預(yù)混液的預(yù)混液加入到該管中。加入到該管中。PCR擴(kuò)增和電泳檢測反應(yīng)試劑

6、反應(yīng)試劑 用量用量PCR SuperMix 10L引物（濃度10M） 1L引物（濃度10M） 1L模板DNA 5LddH2O 3L總體積 20LPCR擴(kuò)增和電泳檢測微量可調(diào)移液器（微量可調(diào)移液器（一檔吸、二檔排一檔吸、二檔排）PCR擴(kuò)增和電泳檢測 PCR反應(yīng)參數(shù)反應(yīng)參數(shù)： 變性變性 94 30 s退火退火 52 30 s延伸延伸 72 60 s 預(yù)變性預(yù)變性 94 300 s保溫保溫 72 600 s循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 35PCR擴(kuò)增和電泳檢測1、基本概念、基本概念 以瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)以瓊脂糖凝膠作為介質(zhì),DNA在外加電場的在外加電場的作用下泳動的技術(shù)。作用下泳動的技術(shù)。2、實驗原理、實驗原理

7、 瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。定于瓊脂糖的濃度。PCR擴(kuò)增和電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳基本原理瓊脂糖凝膠電泳基本原理PCR擴(kuò)增和電泳檢測PCR擴(kuò)增和電泳檢測使用使用電泳緩沖液在制膠器上配電泳緩沖液在制膠器上配制制1.0%的瓊脂糖凝膠。的瓊脂糖凝膠。2L載樣緩沖液、載樣緩沖液、 2L 核酸熒核酸熒光染料，光染料，10LPCR產(chǎn)物混勻。產(chǎn)物混勻。將上步混好的樣將上步混好的樣10 L加到凝膠加到凝膠孔中孔中。90V電壓下電泳電壓下電泳1020min。瓊脂糖凝膠電泳的過程瓊

8、脂糖凝膠電泳的過程PCR擴(kuò)增和電泳檢測將凝膠倒入制膠器的槽中將凝膠倒入制膠器的槽中（60oC）將瓊脂糖加入電泳緩沖液將瓊脂糖加入電泳緩沖液,在微波爐中在微波爐中加熱溶解至透明。加熱溶解至透明。PCR擴(kuò)增和電泳檢測將梳子從制膠槽中拔出將梳子從制膠槽中拔出 PCR擴(kuò)增和電泳檢測取出凝膠板放入電泳槽中取出凝膠板放入電泳槽中 向電泳槽中加入電泳緩沖液至沒過凝膠向電泳槽中加入電泳緩沖液至沒過凝膠 PCR擴(kuò)增和電泳檢測 瓊脂糖凝膠電泳中瓊脂糖凝膠電泳中緩沖液的作用緩沖液的作用1 1、增加電導(dǎo)率；、增加電導(dǎo)率；2 2、維持電泳過程中、維持電泳過程中的合適的的合適的pHpH。PCR擴(kuò)增和電泳檢測吸取吸取PCR

9、反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)物10L。注意吸頭。注意吸頭要插入到管底，才能取到要插入到管底，才能取到PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物。 將將PCR產(chǎn)物與加樣緩沖液充分混合產(chǎn)物與加樣緩沖液充分混合（吸排幾次吸排幾次） PCR擴(kuò)增和電泳檢測常用的上樣緩沖液配方及各成分的作用常用的上樣緩沖液配方及各成分的作用蔗糖蔗糖使樣品呈色，便于上樣，使樣品呈色，便于上樣，形成可見指示帶，預(yù)測電泳進(jìn)程。形成可見指示帶，預(yù)測電泳進(jìn)程。溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)增加樣品密度，保證增加樣品密度，保證DNADNA均勻沉均勻沉入加樣孔內(nèi)。入加樣孔內(nèi)。核酸熒光染料核酸熒光染料可嵌合入可嵌合入DNADNA分子，在特定激發(fā)分子，在特定激發(fā)光源的激發(fā)下可發(fā)出熒光，熒光源的激發(fā)下可發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與光強(qiáng)度與DNADNA含量成正比。含量成正比。（需要與加樣緩沖液混合）（需要與加樣緩沖液混合）PCR擴(kuò)增和電泳檢測PCR擴(kuò)增和電泳檢測進(jìn)行電泳10-20分鐘PCR擴(kuò)增和電泳檢測 實驗用的核酸熒光染料與實驗用的核酸熒光染料與DNA嵌合后，在嵌合后，在DNA發(fā)射發(fā)射黃綠色黃綠色熒光。熒光。電泳結(jié)果的觀察電泳結(jié)果的觀察在在DNADNA電泳圖譜觀察儀中觀察核酸條帶并拍照。電泳圖譜觀察儀中觀察核酸條帶并拍照。PCR擴(kuò)增和電泳檢測PCR的應(yīng)用的應(yīng)用 PCRPCR具有省時、操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏具有省時、操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高