食品酶學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書匯總

1、食品酶學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書陸劍鋒、陳寒青2011 年 05 月果膠酶的特性及其應(yīng)用實(shí)驗(yàn)一一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握果膠酶活性的檢測方法；2. 了解與掌握果膠酶的特性；3. 了解果膠酶在果汁澄清中的作用；二、實(shí)驗(yàn)原理果膠質(zhì)是指植物中呈膠狀的聚合碳水化合物，是植物細(xì)胞間層和細(xì)胞壁的重要組分。果膠質(zhì)由三種化學(xué)成分：-l ， 4- 聚-D- 半乳糖醛酸、阿拉伯聚糖和-1 ， 4-D- 半乳聚糖。果膠質(zhì)按其分子中 D-半乳糖醛酸上羧基酯化程度不同，可分為原果膠、果膠酸和果膠酯酸。果膠是多縮半乳糖醛酸甲酯，為白色或黃褐色的粉末，溶于 20 倍的水則成粘稠狀液體，與三倍或三倍以上的砂糖混合，更易溶于水，對酸性溶液較對堿

2、性溶液穩(wěn)定，不溶于乙醇及其它有機(jī)溶劑。果膠酶 (EC.3.2.1.15)是分解植物主要成分果膠質(zhì)的酶類，與纖維酶相似，是一群酶，至少有8種酶分別作用于果膠分子的不同位點(diǎn)，基本上分為解聚酶和果膠酯酶兩大類。前者能催化果膠解聚，后者能催化果膠分子中的酯水解。果膠水解酶澄清果汁分兩步完成。首先由果膠酯酶切斷果膠的甲酯基， 生成果膠酸和甲醇，緊接著液化型的果膠酸酶使果膠質(zhì)低分子化，生成帶羧基的產(chǎn)物。多數(shù)羧基會與金屬離子或其他成分結(jié)合而凝聚。這是可能發(fā)生二次沉淀的原因。果膠酶廣泛地分布于高等植物( 胡蘿卜、番茄、草莓、香蕉、桔子等) 和微生物中。果膠裂解酶的生產(chǎn)局限于霉菌。其高產(chǎn)菌株多為曲霉和青霉屬。解

3、聚酶來自于霉菌、細(xì)菌等微生物和胡蘿卜等植物中。果膠酯酶除在水果和蔬菜中存在外，在細(xì)菌相霉菌亦有發(fā)現(xiàn)。能引起橙、梨、蘋果和香蕉腐敗的微生物基本上都能產(chǎn)果膠酶，因?yàn)檫@些水果中果膠含量高。有利于分解果膠的微生物的生長和發(fā)育。 雖然有不少微生物都能產(chǎn)果膠酶，但在工業(yè)生產(chǎn)中常采用真菌，例如產(chǎn)酶活力高的曲霉、青霉、核盤霉等。果膠酶主要應(yīng)用于食品工業(yè)，特別是水果加工。由于果汁粘度高，致使過濾困難和產(chǎn)率低。果實(shí)經(jīng)破碎后榨汁，果膠溶出在果汁內(nèi)，造成果汁渾濁，在儲存中又會發(fā)生沉淀。利用果膠酶分解果汁中的果膠，是果汁和果酒澄清的最好方法，已廣泛應(yīng)用于蘋果汁、葡萄汁、草莓汁和柑桔汁等的生產(chǎn)。果膠酶的加量按成品酶活力而

4、定，一般為0.003 -0.1 ，在 pH 值為 3-5,35 55條件下作用2-12h 。用前以果汁或水將酶稀釋10-20 倍。果漿用酶和果汁用酶均不能與酶同時(shí)使用膨潤土、多酚物質(zhì)和 SO（濃度要小于 500mg/L ）。為了檢查澄清效果， 可將一份果汁與二份 （ 95%乙醇 99 濃鹽酸 1） 2 混合液混合均勻， 15 分鐘后觀察，果膠分解完全則無絮狀物出現(xiàn)。貯存：本品最佳貯藏條件為4-10 ，一般為室溫貯藏，避免陽光直射。三、實(shí)驗(yàn)材料與儀器橘子等，果膠酶，95%乙醇。721 分光光度計(jì)；恒溫水??；離心機(jī)；移液管0.5 、 5 毫升；離心管；溫度計(jì)；試管；試管架；玻璃燒杯；比色管。四、操

5、作步驟（一）溫度對果膠酶活力的影響1取 9 支比色管，分別放入約10 毫升橘汁，再分別加入1%濃度的果膠酶（0、 0.1 、 1）毫升，再補(bǔ)加蒸餾水至總體積22 毫升。充分搖勻，置恒溫水浴中于35、 45、 55溫度下反應(yīng) 2 h 。2反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液放入離心管中進(jìn)行離心分離（3000rpm ， 5min ）。3取上清液用蒸餾水稀釋5 倍后于 721 分光光度計(jì)于600nm處測吸光值。4計(jì)算果汁澄清度（ %） =（ OD-OD）÷ OD× 100對照對照式中：OD對照的吸光值（用蒸餾水代替酶液，與反應(yīng)液同樣操作）；對照OD酶反應(yīng)液的吸光值。5根據(jù)在三個(gè)溫度下果汁的澄清度

6、的比較，取澄清度最高的溫度為最適溫度（見表1-1 ）。表 1-1 溫度對果膠酶活力的影響實(shí)驗(yàn)序溫度（果汁澄清度12353454567 5589（二） pH 值對果膠酶活力的影響1取 9 支比色管，分別放入約10 毫升橘汁，再分別加入1%濃度的果膠酶（0、 0.1 、 1）毫升，每 3 個(gè)比色管分別補(bǔ)加pH 為 3、 4 和 5 的檸檬酸 - 檸檬酸鈉緩沖液至總體積22 毫升。充分搖勻，置恒溫水浴中于 45溫度下反應(yīng)2 小時(shí)。2反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液放入離心管中進(jìn)行離心分離（3000rpm ， 5min ）。3取上清液用蒸餾水稀釋5 倍后于 721 分光光度計(jì)于600nm處測吸光值。4計(jì)算果汁澄清

7、度（ %） =（ OD-OD）÷ OD× 100對照對照 式中：OD對照的吸光值（用蒸餾水代替酶液，與反應(yīng)液同樣操作）； 對照 OD酶反應(yīng)液的吸光值。5根據(jù)在三個(gè) pH 下果汁的澄清度的比較，取澄清度最高的pH 為最適 pH（見表 1-2 ）。（三）加酶量對果汁澄清的影響以橫坐標(biāo)為添加的酶量，縱坐標(biāo)為澄清度，作坐標(biāo)圖。用上述方法測定時(shí)，果汁的澄清度與酶量之間的關(guān)系在澄清度80%以下時(shí)，基本上近似直線，澄清度在80%時(shí)，肉眼也能看到幾乎是透明的，因此將此作為反應(yīng)終點(diǎn)。把添加0.1 毫升和 1 毫升分別的澄清度， 在坐標(biāo)圖上連接起來。找出澄清度達(dá)到 80%時(shí)的最少使用酶量作為所

8、需酶量。（四）果膠酶活力的確定在（三）的條件下，能使1 毫升果汁有80%澄清的酶活力定為 1 單位。酶澄清果汁的活力（/ml ） = d ÷ V× 5式中：d酶的稀釋倍數(shù)；V所需酶量（ml ）。（五）果汁中果膠的檢驗(yàn)分別取在不同條件下作用 2 小時(shí)的果汁 2.5 毫升置比色管中，加入 95%乙醇至總體積 10 毫升，振蕩。因果膠不溶于乙醇中，如有果膠存在，則有渾濁和沉淀生成，比較渾濁生成量，可知果汁經(jīng)果膠酶澄清效果。表 1-2 pH 值對果膠酶活力的影響實(shí)驗(yàn)序 pH果汁澄清度123345467 8 59五、附錄： 6.20.1mol/L- 檸檬酸鈉緩沖液（） ，3.0 檸檬

9、酸 O 21.01g/1000ml.H；OC0.1mol/L檸檬酸：含H2876C0.1mol/L 檸檬酸三鈉：含 NaH。 O 29.40g/1000mlO.2H 273650.1mol/L 0.1mol/L 0.1mol/L 0.1mol/L檸檬酸檸檬酸 pH 檸檬酸三鈉pH 檸檬酸三鈉 (yml) (yml) (xml) (xml)60.04.83.018.0 82.0 40.065.022.55.03.2 77.5 35.069.53.427.0 30.5 5.2 73.074.53.65.4 31.5 25.5 68.579.03.85.6 63.5 21.0 36.584.04.0

10、5.8 59.0 16.0 41.088.54.211.5 54.0 6.0 46.092.04.4 8.049.550.5 6.24.644.555.5實(shí)驗(yàn)二多酚氧化酶和抗壞血酸氧化酶活力的測定一、目的掌握多酚氧化酶及抗壞血酸氧化酶的測定方法。二、原理測定果實(shí)、蔬菜保鮮中氧化酶的動態(tài)，對了解植物的代謝情況及其與環(huán)境條件的關(guān)系有重要意義?？箟难嵫趸笗箍箟难嵫趸兂牲S褐色的脫氫抗壞血酸；多酚氧化酶使焦兒茶酚（鄰苯二酚）氧化產(chǎn)生黑素類，使果實(shí)蔬菜在不適宜的貯藏條件下品質(zhì)變劣?？箟难嵫趸傅臏y定是在該酶的最適pH 及適宜溫度下，向反應(yīng)瓶中加入一定量底物（抗壞血酸及酶液） 。根據(jù)抗壞血酸的

11、消耗量計(jì)算酶活力?？箟难嵯牧靠捎玫庖旱味ㄊＳ嗟目箟难醽頊y定。KIO 十 5KI 2HPO 3I 十 2KPO 十 3HO2233434 抗壞血酸十I 脫氫抗壞血酸十2HI2 在氧的存在下，多酚氧化酶將鄰苯二酚氧化為醌類，醌又進(jìn)一步氧化抗壞血酸為脫氫抗壞血酸。向反應(yīng)系統(tǒng)中加入焦兒茶酚和抗壞血酸，可由抗壞血酸的消耗量間接求得多酚氧化酶的活力。三、材料、儀器和試劑l 材料新鮮的馬鈴薯或蘋果等。2儀器電冰箱，組織搗碎機(jī)，恒溫水浴鍋，離心機(jī)，三角瓶50 毫升（×6），刻度吸管5 毫升（×1）、2毫升1（× 2）、 1 毫升（×2），微量滴定管（×2

12、），秒表。3試劑(1) pH6 、0.05M 磷酸鹽緩沖液 （ 0.2M NaHPO12.3ml ，0.2M NaHPO87.7ml ，稀釋 4 倍） 4 4 22(2) 0.1% 抗壞血酸 使用當(dāng)天配制。(3) 0.02M 焦兒茶酚（鄰苯二酚）稱取 0.22 克焦兒茶酚溶于100 毫升水中，使用當(dāng)天配制。(4) 10% 偏磷酸(5) 1% 淀粉溶液(6) 0.005M 碘液 碘化鉀 2.5 克溶于 200 毫升蒸餾水中， 加冰醋酸 1 毫升，再加 0.1M 碘酸鉀（ 0.3567克碘酸鉀溶于水，定容至100 毫升） 12.5 毫升，用蒸餾水定容至250 毫升。四、操作1.酶液制備將新鮮馬鈴薯

13、或蘋果8 克（去皮），切碎后置組織搗碎機(jī)內(nèi)，加入約60 毫升左右pH6 的磷酸鹽緩沖液（預(yù)先置冰箱內(nèi)冷卻），搗碎3 分鐘后將全部材料用緩沖液洗入100 毫升容量瓶內(nèi)，并定容至刻度。 在 20水浴上浸提30 分鐘，中間搖動數(shù)次。 將勻漿離心 （ 2500 轉(zhuǎn) /分，10 15 分鐘），取出上清液（酶液）備用。2. 測定取 6 個(gè) 50 毫升干燥的三角瓶，標(biāo)號后按下表準(zhǔn)確加入試劑?？箟难嵫趸负投喾友趸笢y定試劑加量表試劑 (毫升 瓶)焦兒茶酚 酶液 偏磷酸號蒸餾水抗壞血酸4242422抗壞血酸氧化酶 抗壞血酸氧化酶 1空白222323抗壞血酸氧化酶及多酚氧化酶 抗壞血酸氧化酶及多酚氧化酶2 1

14、1 2211 空32白向各瓶內(nèi)加水、抗壞血酸。向、號瓶加焦兒茶酚。向、號加偏磷酸。于20水浴預(yù)熱 3 5 分鐘后分別測定。向底物中加入酶液2 毫升，立刻記時(shí)，混勻。20保溫 3 分鐘后立即加入 1 毫升偏磷酸（、號不必再加）殺酶。加淀粉溶液3 滴，用 0.005M 碘液滴定至淺蘭色為止。記錄各號之滴定值。五、計(jì)算以每克鮮樣品每分鐘氧化抗血酸的毫克數(shù)表示酶活力?？箟难秆趸富盍? 單位克 )= -( + )/2多酚氧化酶活力( 單位 / 克)=( -( + )/2)-(2× 0.44 × n÷ W÷ (3 × 2) - - )/2×

15、0.44 × n÷ W÷ (3 × 2)式中0.44 每毫升0.005M 碘液氧化抗壞血酸毫克數(shù)。n酶提取液體積（毫升）。W鮮樣品重量（克）。由于酶液中同時(shí)存在以上兩種酶，所以測定多酚氧化酶的反應(yīng)系統(tǒng)中( 、 號 ) 的抗壞血酸的消耗量是兩種酶作用的結(jié)果。在計(jì)算中要減去抗壞血酸氫化酶的底物消耗量。實(shí)驗(yàn)三堿性磷酸酶活性功能基團(tuán)的化學(xué)修飾一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 使學(xué)生了解與掌握酶化學(xué)修飾的方法；2. 使學(xué)生了解酶化學(xué)修飾后的性質(zhì)變化。二、實(shí)驗(yàn)原理N-溴代琥珀酰亞胺（ NBS ）在一定條件下能比較專一地與蛋白質(zhì)分子中色氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)起反應(yīng)，從而改變咪唑基的化學(xué)性質(zhì)

16、。若色氨酸殘基是酶活力所必需的，經(jīng)NBS修飾后，酶活力完全喪失。并在278 nm處的紫外吸收值下降。堿性磷酸酶（ALPase）酶活性中心含有一個(gè)色氨酸殘基，是酶活力表現(xiàn)所必需的。在NBS修飾過程中，隨著NBS濃度增大酶活力逐漸下降，最終完全失活。酶的紫外吸收光譜特征發(fā)生了明顯的變化，278 nm特征吸收峰隨著NBS濃度的增大而逐漸下降至消失。三、實(shí)驗(yàn)材料1. 儀器恒溫水浴鍋，722 分光光度計(jì)，50 L 微量進(jìn)樣器，秒表，貝克曼UV -650 分光光度計(jì)。2.試劑（1） 0.1 mol/L NaAc -HAc 緩沖液（ pH 4.5 ）： 0.1 mol/LNaAc 48 mL+0.1 mol

17、/L HAc 52 mL。（2） 2 mmol/L NBS ：準(zhǔn)確稱取178 mg NBS 溶于 50 mLpH 4.5 、 0.1 mol/L NaAc -HAc 中。（3） 1 mmol/L NBS 。（4）測定堿性磷酸酶活力試劑： （底物溶液的終濃度含0.05 mol/L NaCO -NaHCO 緩沖液，pH 10.1 ，3232 mmol/L MgCl， 5 mmol/L pNPP ） 2 （ 5） 0.1 mol/L NaOH 。（ 6） 0.01 mol/L Tris -HCl （ pH 7.5 ）。（7） 0.1 mol/ NaCO -NaHCO pH 10.1 緩沖液：分別取0

18、.1 mol/L NaCO 溶液（取 28.6 g32323NaCO ·10HO 溶于 1000 mL 蒸餾水中） 70 mL 和 0.1 mol/L NaHCO溶液（取 8.4 g NaHCO 溶于 1000 33223mL 蒸餾水中） 30 mL 混勻，用酸度計(jì)準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH 10.1 。（8） 0.5 mol/L 醋酸鎂溶液：稱取醋酸鎂107.25 g 溶于蒸餾水中，稀釋至1000 mL 。（9） 0.1 mol/L 醋酸鈉溶液：稱取醋酸鈉8.2 g 溶于蒸餾水中，稀釋至1000 mL 。（10 ）0.01 mol/L 醋酸鎂 -0.01 mol/L 醋酸鈉溶液：取0.5 mol

19、/L 醋酸鎂 20 mL 及 0.1 mol/L 醋酸鈉100 mL ，混勻后加蒸餾水稀釋至1000 mL 。（11）底物溶液（ 5 mmol/LpNPP ）：按以下比例混勻（7） :（ 8） :（ 10） :HO=1:0.2:0.5:0.28 。 2（12 ） 20 mmol/L MgCl ：稱取1.904 gMgCl 溶于 1000 mL蒸餾水中。223. 材料牡蠣堿性磷酸酶液四、實(shí)驗(yàn)步驟1、NBS 對酶的修飾作用取 6 支試管，編號。按表2-1 方法操作：表 2-1645123管號1 mL 各管加入酶液ALPase/mL3.50 3.253.0 2.75 0.1 mol/LNaAc -H

20、Ac/mL 4.0 3.751.25 0.501.00 0.25 0.75 1 mmol/L NBS/mL 00.250.100.0500.150.20NBS 終濃度 /mmol/L按上表順序加入后，混勻，室溫放置5 min 進(jìn)行修飾作用。飾的酶液（其中1 號為對照） 。然后再測定酶的剩余活力。分別得到16號的不同NBS濃度修2、NBS 對酶修飾后剩余活力測定取 19 支試管，編號。實(shí)驗(yàn)。按表2-2 操作：0 號為空白對照管，用于儀器調(diào)零；16號為測定管，重復(fù)3 組，作平行表2-26540號 123管1.9 mL各管測活底物5 min37 預(yù)熱預(yù)熱 0.1 mL 對應(yīng)加入已修飾的酶液修飾酶液1

21、0 min反應(yīng)時(shí)間精確反應(yīng)2 mL0.1 mol/L NaOH各管加入 0.1 mL空白管補(bǔ)加酶液OD405 100/%相對酶活力以空白管校正儀器，在 722 分光光度計(jì)測定波長 405nm 的 OD 值（ OD ）。 4053、數(shù)據(jù)處理通過 405 nm 的 OD 值（ OD）計(jì)算各管的酶活力，以 1 號管的酶活力為 100% ，其他管核算為相 405 對活力。以修飾劑 NBS 濃度為橫坐標(biāo)，各管的剩余酶活力為縱坐標(biāo)繪制酶活力與 NBS 的關(guān)系圖。說明 NBS 對堿性磷酸酶的修飾作用。4、NBS 修飾后酶的紫外特征吸收峰的變化情況在貝克曼UV -650型分光光度計(jì)自動掃描記錄天然酶液（無經(jīng)N

22、BS處理，即1 號酶）和經(jīng)不同濃度 NBS為 1 mL處理的酶液的紫外吸收光譜。波長范圍為230-300 nm（在石英比色杯中，空白對照管Tris · HCl 緩沖液代替酶液，其他加入量同3.1 表）。解釋酶的紫外吸收光譜的變化情況。5、NBS 修飾后酶的紫外差示光譜的變化情況在一對含隔板的石英比色杯中，空白對照管的兩室為1、2 室，樣品測定管的兩室為3、4 室。按表2-3加樣：表 2-34213號室 ALPase 酶液 /mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.1 mol/L Tris.HCl/mL 0.5 0.5 0.1 mol/LNaAC -HAc/mL 2 mmol/L N

23、BS/mL0.50.5 上述 3 室的酶也在 NBS 濃度為 1 mmol/L 下處理，在紫外分光光度計(jì)自動掃描記錄波長范圍為 230-300nm OD 值。解釋酶的紫外差吸收光譜的變化情況。五、作業(yè)1. 如何用化學(xué)修飾方法研究酶活性中心功能基團(tuán)的性質(zhì)？2. 酶的化學(xué)修飾實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意什么事項(xiàng)？3. 如何判斷 NBS 是作用于色氨酸殘基的？附：（ 1）堿性磷酸酶：廣泛存在于微生物界。堿性磷酸酶能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、 酚或糖等磷酸受體上。 在磷的生物和化學(xué)循環(huán)過程中，堿性磷酸酶起了及其重要的作用。 在生物體內(nèi)堿性磷酸酶與磷的代謝直接相關(guān)，參與磷與鈣物質(zhì)的消化、

24、吸收、分泌以及骨骼2+對該范圍內(nèi)。 MgpH 堿性區(qū)域，一般在pH 9.010.5 的形成等生理生化過程。堿性磷酸酶的作用最適酶的活力有顯著的激活作用。（2）堿性磷酸酶酶活力分析：通常是以對-硝基磷酸二鈉（ pNPP ）為底物，在 pH 10.1 的碳酸鹽緩 ）的測活體系中檢測酶催化pNPP 水解產(chǎn)生黃色的對硝基苯酚 （ pNPMg沖液（含 2 mmol/L）2+的量。產(chǎn)物pNP 在 405nm 處有最大的吸收峰，可以根據(jù)OD 的值的增加計(jì)算酶活力的大小。酶活力定義為：4052+的測活體系中每分2 mmol/L MgpH 10.1的碳酸鹽緩沖液含5 mmol/L pNPP在37下，以為底物，在

25、鐘催化產(chǎn)生1 mmol/L pNP 的酶量定義為 1 個(gè)酶活力單位。酶的比活力定義為每 mg 蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。實(shí)驗(yàn)四超氧化物歧化酶的制備及活力測定一、前言超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase 簡稱 SOD ）是一種重要的氧自由基清除劑，屬金屬酶，它在生物界分布極廣，它催化的化學(xué)反應(yīng)是：- + HOO + O + O + 2H 22222-）而起保護(hù)細(xì)胞的作用，故引起國內(nèi)外醫(yī)藥能專一清除生物氧化產(chǎn)生的超氧陰離子（ D 由于 SOD 2 界和生化界的極大關(guān)注。在食品工業(yè)中，可以作為一種天然的抗氧化劑而廣泛應(yīng)用。通過本實(shí)分掌握以豬血為原料制備SOD 的方法。用 SOD

26、抑制連苯三酚在空氣中自氧化速率的方法測其活性。二、原理SOD 是一種酸性蛋白，在酶分子上共價(jià)連接金屬輔基，因此它對熱、pH 及某些理化性質(zhì)表現(xiàn)出異常的穩(wěn)定性，如離于強(qiáng)度非常低，即使加熱到95 ， SOD 活性喪失也很少，是迄今發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定性最高的球蛋白之一。利用此性質(zhì)將豬紅血球中其它蛋白質(zhì)沉淀除去，再用 DEAE SephadexA50 進(jìn)行離子交換層析，因?yàn)?DEAE Sephadex A 50 是弱堿性陰離子交換樹脂，可吸附 SOD ，然后用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集具有SOD 活性的洗脫液， 濃縮，凍干即可得SOD 成品。三、材料、儀器和試劑（）材料新鮮豬血。（二）儀器大燒杯 500

27、毫升及 1000 毫升；電熱恒溫水浴鍋；層析柱1× 17 厘米；自動部分收集器；離心機(jī)；超過濾器；臺式離心濃縮干燥器，pH 計(jì)， 752 型紫外分光光度計(jì)。（三）試劑1. 0.9% 氯化鈉溶液。2. 95% 乙醇。3. 氯仿。4. 丙酮。5. 磷酸緩沖液（ pH7.6 、 2.5mM 50mM ）。6. 試劑 SOD 。7. 45mM 連苯三酚緩沖液。8. pH8.2 、 50mM Tris HCl 緩沖液。9. 10mM 鹽酸。四、操作（一）豬血SOD 的制備1. 取新鮮豬血，離心（3000轉(zhuǎn)分，20 分鐘）除去黃色血漿，紅血球用0.9%氯化鈉清洗二次，接著用兩倍量的水?dāng)嚢枞苎胄?/p>

28、時(shí)。2. 在溶血后的血液中緩慢加入0.25 倍體積的95%乙醇和0.15 倍體積的氯仿，攪拌15 分鐘，離心除去血紅蛋白得到清液。3. 向清液中緩慢加入丙酮出現(xiàn)沉淀，離心后得沉淀。4. 使沉淀溶于水，然后置恒溫水浴中于55 65 ，進(jìn)行熱處理15 分鐘以使雜蛋白變性沉淀，離心去沉淀得清液。清液可再加丙酮進(jìn)行第二次沉淀，離心分離得沉淀供層析用。5. 用50mMDEAE Sephadex A 50 裝好層析柱（1× 17 厘米），以沉淀上層析柱，用pH7 ， 2.5mM 的磷酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，每 4 毫升收集一管，前 20 管不含 SOD 活性，收集具有SOD活性的洗脫液。6把具有S

29、OD活性的洗脫液通過超過濾濃縮(SOD分子量約為32000) ，然后冷凍干燥，可得淡藍(lán)綠色成品。在各制備環(huán)節(jié)測定酶的總回收率和比活力。計(jì)算后將結(jié)果填入下表。測定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表結(jié)果純化酶活力蛋白質(zhì)總體積比活濃度力步驟毫升 (單) (毫克) /毫升（毫單位 () / 毫位 /升）克除血紅蛋白丙酮沉淀（一）性變熱丙酮沉淀（二）層析 柱酶活力總收率（二）活力測定連苯三酚氧化法1. 連苯三酚自氧化速率的測定取 3 支試管分別標(biāo)號 0、1、2，加入 3 毫升 50M 的 Tris 一 HCl 緩沖液（內(nèi)含 1mM/L 乙二胺四乙酸二鈉），在 25 下保溫 15 分鐘，試管 1 加入預(yù)熱的 45mM 連苯三酚

30、10 微升左右，記時(shí)，速以0 號試管溶液做空白對照用752 或754 分光光度計(jì)在325nm處測定4 分鐘內(nèi)每分鐘OD值變化為A325連。2. SOD 或粗酶提取液活力的測定在 2號試管中加入預(yù)熱酶液10 微升，搖勻，再加入預(yù)熱的45mM連苯三酚 10 微升，計(jì)時(shí)，仍以 0號管作對照在 325 處測定 4 分鐘內(nèi)每分鐘的 OD 值的變化為A325 酶。3. 酶活力計(jì)算酶活力定義：在25時(shí)， 1 毫升反應(yīng)液中每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達(dá)50% 時(shí)的酶量為一個(gè)活力單位。單位活力（/ml ） =（ A325 連 A325 酶）÷ A325 連÷ 50%× 100 &#

31、215;反應(yīng)液總體積×酶液稀釋倍數(shù)÷加酶體積五、注意事項(xiàng) 嚴(yán)格控制連苯三酚的自氧化率在0.07OD/min。只有控制連苯三酚最終濃度在0.07 0.10范圍內(nèi)， SOD對自氧化抑制程度才基本不變，如果連苯三酚濃度大于范圍減小，而且要大大降低 SOD對連苯三酚自氧化的抑制程度。0.10mM 不僅自氧化速率線性 SOD 對連苯三酚自氧化抑制應(yīng)控制在50%左右，這樣測得的酶單位才可靠。實(shí)驗(yàn)表明，隨著SOD加樣量的增加，相應(yīng)酶液的酶單位數(shù)卻減少。也就是說，以SOD對連苯三酚自氧化抑制50%為標(biāo)準(zhǔn)，如大于這個(gè)數(shù)值，則實(shí)際測得的數(shù)據(jù)偏低；反之，若酶量過小，測得的數(shù)據(jù)偏高。因此要適當(dāng)調(diào)節(jié)

32、樣液的釋稀倍數(shù)。 連苯三酚和被測樣液的加入量采用微量進(jìn)樣，只有 10 微升左右， 故在整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中這個(gè)量可以忽略不計(jì)。實(shí)驗(yàn)五過氧化物酶活力的測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆者^氧化物酶活力的測定方法。二、原理過氧化物酶的活力與果蔬的成熟度間接地成正相關(guān)，故常稱其為“成熟酶”。在用加熱方法殺滅食品中有害的酶時(shí)，也常以過氧化物酶作指標(biāo)酶，因?yàn)樵撁改蜔帷＿^氧化物酶能將愈創(chuàng)木酚（鄰甲氧基苯酚）氧化成紅棕色的 4-鄰甲氧基苯酚。在 470 毫微米波長處測定消化值，即可求酶活力。三、材料、儀器和試劑1材料蘋果或其他果蔬。2儀器容量瓶 100 毫升（× 1）。具塞比色管20 毫升（× 6）、 10

33、毫升（× 7）?？潭任? 毫升（× 5）。分光光度計(jì)、秒表、組織搗碎機(jī)或研體、恒溫水浴。3試劑（ 1） pH5.0 、 0.2M 醋酸緩沖液 (0.2MNaAC70 毫升，毫升 )。（2） 0.1%愈創(chuàng)木酚 將 0.1 克愈創(chuàng)木酚定溶于100 毫升水中。（3） 0.08%HO取 30%HO2.67 毫升，稀釋到100 毫升，混勻。再從其中取出10 毫升，用水定 2222 容至 100 毫升。（4）英格鹽液吸取 5% 分析純重鉻酸鉀 （ KCrO ）溶液 12毫升和10%分析純硝酸鈷 Co(NO) 23722溶液 5 毫升，混勻后加水 7 倍稀釋，作成標(biāo)準(zhǔn)液，相當(dāng)于每100

34、毫升含有 4-鄰甲氧基苯酚 675微克。取此液 74.07 毫升，稀釋至100毫升，配成 500 微克 /100 毫升（ 5 微克毫升）溶液。四、操作1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取 6 支 10 毫升具塞比色管，分別加入5 微克毫升的英格鹽液10、 8、 6、 4、 2、 l、 0 毫升，然后稀釋到 10 毫升。其濃度分別為每毫升含5、 4、 3、2、 l 、 0.5 和 0 微克 4-鄰甲氧基苯酚。用分光光度計(jì)在 470毫微米波長處測定光密度（以 0 作空白） 以 4-鄰甲氧基苯酚含量（微克毫升）為橫坐標(biāo)， OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2酶液制備將材料洗凈，用濾紙吸干。取樣品1 克，切碎，置研缽中，加

35、少量石英砂，研成勻漿。也可用組織搗碎機(jī)處理。小心地將勻漿全部用水移入100 毫升容量瓶中，定容?；靹蚝箅x心，取上清液。3測定在 20 毫升具塞刻度試管中，分別加入液 1 毫升（酶活力強(qiáng)時(shí)可稀釋后再取溶液22pH5.0 醋酸緩沖液1 毫升），搖勻。置于1 毫升， 0.1% 愈創(chuàng)木酚溶液30水浴中， 溫度平衡后加入1 毫升和酶0.08%HOl 毫升，立即記時(shí)，混勻。反應(yīng) 1 分鐘，立即倒入比色杯中測的 4-鄰甲氧基苯酚的含量。對照試驗(yàn)用 1 毫升蒸餾水代替OD 值。470 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出相應(yīng)0.08% HO 。以 22 對照試驗(yàn)調(diào)整分光光度計(jì)的零點(diǎn)。五、計(jì)算每 1 毫克 4-鄰甲氧基苯酚相當(dāng)于1

36、 愈創(chuàng)木酚單位酶活力。用G.U 克鮮重 /小時(shí)表示酶活力。酶活力 =W × 60× n÷ 1000式中：W 樣品OD 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的4-鄰甲氧基苯酚量（微克毫升）47060 換算為1小時(shí)。1000換算為毫克4-鄰甲氧基苯酚。n鮮樣品制成勻漿總稀釋倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)六脂肪酶活性的測定一、目的要求(1) 了解脂肪酶活性測定原理，并掌握測定技術(shù)。(2) 通過實(shí)驗(yàn)，加深對酶活力和比活性含義的理解。二、原 理脂肪酶催化脂肪水解， 生成脂肪酸和甘油。 產(chǎn)生的脂肪酸可以用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液滴定， 從而作定量測定。CHCOOH 十 NaOH CHCOONa HO233171733三、試劑和器材測試樣品脂肪酶溶液： 稱取 100mg 酶粉，加水少許調(diào)勻成糊狀， 再加水至 25mL ，即成稀釋 250 倍的酶液，使用前搖勻。試劑l 25%聚乙烯醇橄欖油乳化液稱取 3g 聚乙烯醇，加蒸餾水150mL ，加熱溶解成2溶液。向其中加入50mL橄欖油，用高速組織搗碎機(jī)攪動3 4 次，每次10s，即成乳白色聚乙烯醇橄欖油乳化液。2 0.025mol/L 磷酸緩沖液甲液：稱磷酸二氫鉀 （ KHP