食品生物技術(shù)導(dǎo)論

1、食品生物技術(shù)：是現(xiàn)代生物技術(shù)在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，是指現(xiàn)代生命科學(xué)的研究成果為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代工程技術(shù)手段和其他學(xué)科的研究成果，用全新的方法和手段設(shè)計(jì)新型的食品和食品原料 基因工程：又稱基因拼接技術(shù)和dna重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種 dna分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品 基因工程的理論基礎(chǔ)：1、不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)2、基因是可切割和轉(zhuǎn)移的3、多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系4、基因的遺傳信息是可以遺傳的 基因工程的主要內(nèi)容：1、在供體細(xì)胞中用限制性內(nèi)切酶切割基因

2、，以分離出含有特定的基因片段或人工合成目的 基因并制備運(yùn)載體（質(zhì)粒、病毒或噬菌體）2、把獲得的目的基因與制備好的運(yùn)載體用dna連接酶連接組成重組體3、把重組體引入宿主細(xì)胞4、篩選、鑒定出含有外源目的基因或個(gè)體工具酶：限制性內(nèi)切酶、核酸酶、連接酶、聚合酶i型限制性內(nèi)切酶：不能專門切割 dna的某個(gè)特殊位點(diǎn)（未大量使用）n型限制性內(nèi)切酶：可在特殊位點(diǎn)切割 dna,產(chǎn)生具有黏性末端或其他形式的dna分子片段（廣泛應(yīng)用）? 同裂酶：來源不同，具有相同的識(shí)別序列? 同尾酶：識(shí)別序列不同，切割后，具有相同的dna黏性末端出型限制性內(nèi)切酶：具有獨(dú)特的識(shí)別方式和切割方法，如 mbo n 基因載體：質(zhì)粒（能自主

3、復(fù)制的雙鏈 dna分子，在細(xì)菌中獨(dú)立于染色體之外存在：具有復(fù)制起點(diǎn)相對(duì)分子質(zhì)量盡可能小有單一的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)有一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因）、植物病毒、噬菌體 理想的基因工程載體具備的特征：1、能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的dna自我復(fù)制，在外源dna插入其dna復(fù)制的非必需區(qū)內(nèi)，仍能保持穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)和遺傳特性2、易于從宿主細(xì)胞中分離，并進(jìn)行純化3、有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶單一酶切位點(diǎn)4、具有能夠直接觀察的表型特征質(zhì)粒載體pbr322:大小為4363bp,含有兩個(gè)抗生素抗性基因 （抗氨茉青霉素和抗四環(huán)素）， 還有單一的bam hi、hindm和sali的識(shí)別位點(diǎn)，這三個(gè)位點(diǎn)都在四環(huán)素抗性基因內(nèi)；

4、另 一個(gè)單一的psti識(shí)別位點(diǎn)在氨茉青霉素抗性基因內(nèi)質(zhì)粒載體puc19: pbr322帶的單一克隆位點(diǎn)較少， 篩選程序較費(fèi)時(shí)，puc19是在其發(fā)展的， 有一個(gè)氨茉青霉素抗性基因和一個(gè)大腸桿菌乳糖操縱子半乳糖甘酶基因（lac z'）的調(diào)節(jié)片段，一個(gè)調(diào)節(jié)lac z基因表達(dá)的阻遏蛋白的基因 lac i ,還有多個(gè)單克隆位點(diǎn) 酵母質(zhì)粒載體：既可以在大腸桿菌中復(fù)制，又可在酵母系統(tǒng)中復(fù)制，又稱穿梭載體噬菌體載體：細(xì)菌病毒聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（pcr）: pcr模才d dna聚合酶在生物體內(nèi)的催化作用，在體外進(jìn)行特異 dna序列的快速聚合及擴(kuò)增。能快速、簡便地在體外擴(kuò)增特定的dna片段，具有高度的 專一

5、性和靈敏度。過程：變形一退火一延伸，如此反復(fù)進(jìn)行約30個(gè)循環(huán)。條件：要有與被分離目的基因的 dna雙鏈兩端序列相互補(bǔ)的 dna引物（約20個(gè)堿基）有熱穩(wěn)定性的酶 dntp作為模板的目的 dna序列 反應(yīng)緩沖液 克?。簩⒅亟Mdna導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和篩選，達(dá)到大量的重組分子，即外源基因的無 性繁殖重組dna導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法： 率 轉(zhuǎn)化：將重組dna分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞中復(fù)制保存，這個(gè)過程為轉(zhuǎn)化 會(huì) 轉(zhuǎn)染：將攜帶外源基因的病毒感染受體細(xì)胞的方法（又分為磷酸鈣沉淀法 與體外包裝法）率微注射技術(shù)：將外源基因直接注射到真核細(xì)胞內(nèi)的方法 率 電轉(zhuǎn)化法：用到電轉(zhuǎn)移 率 微彈技術(shù)：也叫高速粒子轟擊

6、法或基因槍技術(shù) 率脂質(zhì)體介導(dǎo)法： 奉 其他方法：加速冷凍法、碳化硅纖維介導(dǎo)法受體細(xì)胞：能攝取外源dna并使其穩(wěn)定保持的應(yīng)用價(jià)值或理論研究價(jià)值的細(xì)胞 選擇受體細(xì)胞應(yīng)考慮：安全性便于重組dna分子的導(dǎo)入便于篩選克隆分子 重 組dna分子在受體細(xì)胞內(nèi)并能穩(wěn)定維持適于外源基因的自主表達(dá)、分泌或積累重組體的鑒定： 報(bào)告基因的檢測法：指在構(gòu)建目的基因時(shí)將一種報(bào)告基因（如gus nptn、cat nos、ocs lus gfp）構(gòu)建在一起，當(dāng)目的基因轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞時(shí)，報(bào)告基因一同被轉(zhuǎn)入（這種報(bào) 告基因是受體細(xì)胞本身不存在的，而且具有易于檢驗(yàn)的表型 轉(zhuǎn)基因生物的 pcr鑒定：以被檢測的dna為模板，在外源基因的

7、兩側(cè)設(shè)計(jì)合理的引物，通 過pcr反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物 目的基因分子雜交檢測方法 ：利用表達(dá)穩(wěn)定、易于檢測的報(bào)告基因的表達(dá)來間接地證明目的 基因的存在與表達(dá)，若需進(jìn)一步證明目的基因的存在、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)程度，需用分子雜交方法來檢測rna沉默：指在真核生物（植物、動(dòng)物、真菌）中保守的由雙鏈rna誘導(dǎo)的鑒定和破壞其細(xì)胞質(zhì)中異常變異或過表達(dá)的rna的一種機(jī)制。是廣泛存在于植物、動(dòng)物、線蟲和真菌等真核生中的一種高度保守的、序列特異的rna降解機(jī)制.rna沉默對(duì)于調(diào)控發(fā)育、維持基因組的穩(wěn)定性以響應(yīng)生物和非生物脅迫等具有重要作用 細(xì)胞工程：是以細(xì)胞為基本單位， 在離體條件進(jìn)行培養(yǎng)或人為的精

8、細(xì)操作，使細(xì)胞在體外大規(guī)模地繁殖，使細(xì)胞的一些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而達(dá)到體外生產(chǎn)生物產(chǎn)品的目的 細(xì)胞周期：指正常連續(xù)分裂的細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束到下一次分裂完成所經(jīng)歷的連續(xù)動(dòng)態(tài)過 程（分為間期【g1期、s期、g2期】和分裂期【m期】） .滯后期：當(dāng)細(xì)胞接種或傳代至合適培養(yǎng)基中，細(xì)胞并不馬上立即進(jìn)入快速對(duì)數(shù)生長期，而是群體細(xì)胞的生長存在一個(gè)緩慢生長階段，稱為滯后期 對(duì)數(shù)生長期：經(jīng)過滯后期準(zhǔn)備，細(xì)胞適應(yīng)了新的環(huán)境，只要細(xì)胞生長所需要的各種營養(yǎng)條件 具備，細(xì)胞數(shù)目就呈幾何級(jí)數(shù)增加，而進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期（傳代接種或凍存細(xì)胞的理想時(shí)期） 穩(wěn)定期：新生的細(xì)胞數(shù)與死亡的細(xì)胞數(shù)大致相當(dāng)，細(xì)胞數(shù)保持一個(gè)

9、恒定數(shù)值，即進(jìn)入了生長的穩(wěn)定期 衰亡期：處于穩(wěn)定期的細(xì)胞如果不傳代或不加入新鮮培養(yǎng)基，則會(huì)進(jìn)入衰退死亡期 （培養(yǎng)基加細(xì)胞總數(shù)不變，活細(xì)胞數(shù)顯著下降） 細(xì)胞的全能性：一個(gè)與合子具有相同遺傳內(nèi)容的體細(xì)胞具有產(chǎn)生完整生物個(gè)體的潛在能力（意味著每個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞仍然保持著完整的遺傳信息） 細(xì)胞融合：兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程（過程：制備原生質(zhì)體一誘導(dǎo)細(xì)胞融合一篩選雜合細(xì)胞）* 微生物細(xì)胞的培養(yǎng)基組成：碳源、氮源、無機(jī)鹽（ 功能：構(gòu)成菌體的組成 作為酶活性,基團(tuán)的組成部分 調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)的 ph 主要元素：磷、硫、鎂、鉀、鈣【以鹽和化合物形式添加

10、微量元素：鉆、銅、鐵、鎰、鋁、鋅【以雜質(zhì)存在，不必添加】）、維生素培養(yǎng)基分類：成分不同（天然、合成），物理狀態(tài)（固體、半固態(tài)、液體），用途（基礎(chǔ)、加 富、鑒別、選擇）培養(yǎng)方法：固體培養(yǎng)（用于菌種的分離、純化、保藏和種子的制備），液體培養(yǎng)（分為：»續(xù)箝養(yǎng)【恒濁培養(yǎng)：根據(jù)體系內(nèi)微生物的生長密度，通過自控儀表調(diào)節(jié)料液的流量，以取得菌體濃度和生長速度恒定的微生物細(xì)胞的培養(yǎng)方式恒化培養(yǎng)：保持培養(yǎng)液的流速不變，使培養(yǎng)罐內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)濃度基本恒定，并使微生物始終在低于其最走標(biāo)培葬面隹的主要同同是；®一個(gè)生產(chǎn)所有的嫌都要停止運(yùn)作，必須滅國后培養(yǎng)過程，如提高培養(yǎng)溫度、改變高生長速度的條件下進(jìn)行

11、繁殖】、中間卦料培養(yǎng)、同步諳養(yǎng)、合第養(yǎng)） 連續(xù)培養(yǎng)遇到的問題：能動(dòng)，在許多情配下有可能設(shè)計(jì)出一種染菌h或原料等,可使雜國不易生長:連續(xù)培養(yǎng)的收率和產(chǎn)物液度相對(duì)分批培養(yǎng)要低這將不否三養(yǎng)更易受菌種退化的的影洞，因?yàn)橥嘶嬙谠诒壬a(chǎn)肉更具生亡優(yōu)勢(shì)，少數(shù)退化i司的培養(yǎng)，合逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)，從而造成減產(chǎn)植物細(xì)胞培養(yǎng)：廣義上 指在無菌條件下，將離體的單個(gè)游離細(xì)胞在人工控制的環(huán)境里培養(yǎng), 以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他生物產(chǎn)品的一種技術(shù) 食品上指細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，即使游離的植物細(xì)胞或一些小的細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng) 基中增值并分離提取細(xì)胞產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物組織培養(yǎng)：愈傷組織一胚一完整個(gè)體糾胞培養(yǎng)：單個(gè)細(xì)胞一大量細(xì)

12、胞一分泌的產(chǎn)物* 治物細(xì)胞培養(yǎng)基組成：碳源、植物生長激素、有機(jī)氮源、維生素、生長調(diào)節(jié)劑動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：將動(dòng)物細(xì)胞或組織從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，在體外繼續(xù)生長和增殖的過程（過程：取材 一分散成單個(gè)細(xì)胞一制成懸液一傳代）【動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物】【胰蛋白酶】【貼壁&懸浮】 【營養(yǎng)不足&空間障礙】（方法：懸浮培養(yǎng) 【轉(zhuǎn)瓶、滾瓶、發(fā)酵罐式】，貼壁培養(yǎng)【貼壁因子吸附一接觸一貼壁一擴(kuò)展】固定化培養(yǎng)基【細(xì)胞生長密度高、抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)】大規(guī)模培養(yǎng)法 【空心纖維法、微載體法、微囊法】 ）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基組成：氨基酸（12種

13、）、維生素、鹽、糖類（葡萄糖）、有機(jī)添加劑、激素和生長因素、其他成分（血清）【沒有細(xì)胞壁，易受污染 】細(xì)胞融合技術(shù)：指在一定條件下，將不同來源的原生質(zhì)體（除去細(xì)胞壁的細(xì)胞）相融合并使之分化再生，形成新物種或新品種的技術(shù)，又稱為體細(xì)胞雜交（過程：兩個(gè)親本細(xì)胞并列，細(xì)胞膜相接觸一膜組織局部破壞一形成包圍融合細(xì)胞的連續(xù)胞膜）（方法：生物學(xué)法【病毒】，化學(xué)融合劑法，電處理融合法）植物細(xì)胞工程在食品工業(yè)的應(yīng)用 ：生產(chǎn)香料生產(chǎn)食品添加劑（色素、甜味劑、鮮味劑、 防腐劑、增稠劑）生產(chǎn)天然食品生產(chǎn)植物藥生產(chǎn)抗氧化劑動(dòng)物細(xì)胞工程的應(yīng)用：疫苗生產(chǎn) 干擾素生產(chǎn) 單克隆抗體生產(chǎn) 干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分 化其他基因重組產(chǎn)品生

14、產(chǎn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)：一級(jí)結(jié)構(gòu)（氨基酸排列順序），二級(jí)結(jié)構(gòu)（借助氫鍵沿一維方向具有周期性 結(jié)構(gòu)的構(gòu)象），三級(jí)結(jié)構(gòu)（借助次級(jí)鍵【非共價(jià)鍵】盤繞成具有特定肽鏈走向的緊密球狀構(gòu) 象），四級(jí)結(jié)構(gòu)（寡聚蛋白質(zhì)中各亞基之間在空間上的相互關(guān)系或結(jié)合方式）蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)：指食品體系在加工、 貯藏、制備和消費(fèi)過程中蛋白質(zhì)對(duì)食品生產(chǎn)需要特 征的那些物理、化學(xué)性質(zhì)（兩大類：流體動(dòng)力學(xué)性質(zhì)【 水吸收和保持、溶脹性、黏附性、黏度、沉淀、膠凝、蛋 白質(zhì)面團(tuán)和纖維這種結(jié)構(gòu)起作用的性質(zhì)】表面性質(zhì)【濕潤性、分散性、溶解性、表面張力、乳化作用、蛋白質(zhì)的起泡特 性、脂肪和風(fēng)味的結(jié)合】）蛋白質(zhì)工程：指通過生物技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或者對(duì)

15、編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)彳叵以 便獲得更適合人類需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的技術(shù)（研究內(nèi)容：以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過有控制的基因修飾和基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造、設(shè)計(jì)、構(gòu)建，并最終生產(chǎn)出性能比自然界存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類社會(huì)需要的新型蛋白質(zhì)前提：了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能核心手段：改造基因步驟：分離純化目的蛋白，使之結(jié)晶并做分析，得到其空間結(jié)構(gòu)的盡可能多的信息對(duì)目的蛋白的功能作詳盡的研究，確定它的功能域通過對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)、 空間結(jié)構(gòu)和功能之間相互關(guān)系的分析，找出關(guān)鍵的基因和結(jié)構(gòu)圍繞這些關(guān)鍵的基因和結(jié)構(gòu)提出對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造的方案，并用基因工程的方法去實(shí)施對(duì)經(jīng)過改

16、造的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性測定，看看改造效果如何 然后，重復(fù)和這兩個(gè)步驟，直到獲得比較理想的結(jié)果改造方法：個(gè)別氨基酸的改變和一整段氨基酸序列的刪除、置換或插入【 初級(jí)改造】 蛋白質(zhì)分子的剪裁，如結(jié)構(gòu)域的拼接【 高級(jí)結(jié)構(gòu)】 從頭設(shè)計(jì)合成新型蛋白質(zhì)主要采用的基因突變方法 ：基因定向誘變，盒式突變）盒式突變：又稱片段取代法，是利用目標(biāo)基因序列中適當(dāng)限制酶切位點(diǎn)，插入各種合適的突變dna片段，用以取代目標(biāo)基因中特定 dna片段。（是一種常用的定點(diǎn)突變技術(shù)。適用于 需要突變位點(diǎn)的兩端有成對(duì)的酶切位點(diǎn)的情況）基因的定向誘變：在dna水平上產(chǎn)生多肽編碼順序的特異性改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系 ：蛋白質(zhì)是功能性大分子

17、.每一種蛋白質(zhì)都有特定的一級(jí)結(jié)構(gòu)和空 間結(jié)構(gòu)，這些特定的結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)行使蛋白質(zhì)功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)的各種功能又是其結(jié)構(gòu)的表現(xiàn).蛋白質(zhì)的任何功能都是通過其肽鏈上各種氨基酸殘基的不同功能基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)的，所以,蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)一旦確定 ，蛋白質(zhì)的可能功能也就確定了 ，而且從某種程度上來說 ，蛋白質(zhì) 的三級(jí)結(jié)構(gòu)比一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系更大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)維系生物體生命活動(dòng)的重要性：（1）蛋白質(zhì)是細(xì)胞和生物體結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的重要物質(zhì)，如紅細(xì)胞中與運(yùn)輸氧氣有關(guān)的血紅 蛋白；細(xì)胞膜上與物質(zhì)跨膜運(yùn)輸有關(guān)的載體蛋白及與細(xì)胞識(shí)別、傳導(dǎo)有關(guān)的糖蛋白。rna(2)具有催化作用的酶大多是蛋白質(zhì)，如唾液淀粉酶可把淀粉分解為麥芽

18、糖；纖維素酶和果 膠酶在植物細(xì)胞工程中用于除去細(xì)胞壁；胰蛋白酶在動(dòng)物細(xì)胞工程中用于分離細(xì)胞；聚合酶在基因表達(dá)過程中用于dna轉(zhuǎn)錄為mrnao(3)有些蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用， 如垂體分泌的生長激素對(duì)動(dòng)物生長有促進(jìn)作用， 若幼年缺乏， 可導(dǎo)致侏儒癥；胰島b細(xì)胞分泌的胰島素有降低血糖濃度的作用， 若人體缺乏，則患糖尿??； 胰高血糖素由胰島 a細(xì)胞分泌，有升高血糖濃度的作用，與胰島素作用相拮抗。(4)特異性免疫中的免疫物質(zhì)，既包括體液免疫中由漿細(xì)胞分泌的免疫球蛋白一一抗體，也 包括細(xì)胞免疫中由效應(yīng) t細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素等淋巴因子。蛋白質(zhì)的主要功能：催化功能：酶調(diào)節(jié)功能：激素結(jié)構(gòu)功能：皮、毛、骨、牙、細(xì)胞骨

19、架運(yùn)輸功能：血紅蛋白 免疫功能：免疫球蛋白運(yùn)動(dòng)功能：鞭毛、肌肉蛋白 儲(chǔ)藏功能：酪蛋白 生物膜功能：及神經(jīng)傳導(dǎo)等如何理解蛋白質(zhì)工程是第二代基因工程：蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程，是包含多學(xué)科的綜合科技工程領(lǐng)域?；蚬こ淌峭ㄟ^基因操作把外源基因轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)纳矬w內(nèi)，并在其中進(jìn)行表達(dá)，它的產(chǎn)品是該基因編碼的天然存在的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程就是根據(jù)蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)工程自誕生之日起， 就與基因工程密不可分。 蛋白質(zhì)工程根據(jù)對(duì)分子 預(yù)先設(shè)計(jì)

20、的方案，通過對(duì)天然蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行改造，來實(shí)現(xiàn)對(duì)它所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行改造。因此，它的產(chǎn)品已不再是天然的蛋白質(zhì)，而是經(jīng)過改造的、具有了人類所需要的優(yōu)點(diǎn)的蛋白質(zhì)中心、法貝h如何理解蛋白質(zhì)工程的非理性設(shè)計(jì)非理性蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)技術(shù)是在不了解有關(guān)酶結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系等信息的情況下通過對(duì)酶 基因的隨機(jī)突變和基因片段的重組來創(chuàng)造突變庫，然后通過高通量的篩選手段鑒定性能改善的突變體，挑出的有益突變基因可以作為下一輪突變的模板，進(jìn)行多輪突變和篩選，以進(jìn)一步提高酶的性能。這些失敗可能是因?yàn)閷?duì)要改造的酶性質(zhì)的內(nèi)在機(jī)制缺乏理解，有很多失敗例子都是將氨基酸序列同源作為氨基酸替換的唯一標(biāo)準(zhǔn)，忽視了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性，這樣做的

21、結(jié)果是導(dǎo)致替換的氨基酸不但對(duì)要改變的酶特性無影響，而且常常因氨基酸改變導(dǎo)致酶構(gòu)像的改變而使酶鈍化。 蛋白質(zhì)工程理性設(shè)計(jì)：在理性設(shè)計(jì)中，首先要根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)， 功能和機(jī)制等詳細(xì)資料對(duì) 氨基酸序列中要突變的位點(diǎn)進(jìn)行精確設(shè)計(jì)，然后通過取代、插入或缺失等手段改變蛋白質(zhì)分子中特定的氨基酸。從而鑒定出與酶特性相關(guān)的關(guān)鍵殘基和結(jié)構(gòu)元件。理性設(shè)計(jì)的方法 有寡核甘酸介導(dǎo)的重組 pcr限制性內(nèi)切酶酶切片段取代法，盒式突變法和化學(xué)合成法。與使用化學(xué)因素、自然因素導(dǎo)致突變的方法相比，定點(diǎn)突變具有突變率高、簡單易行、重復(fù)性好的特點(diǎn)。蛋白質(zhì)工程的改造策略1、疏水氨基酸常常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的活動(dòng)中心區(qū)域；“螺旋和3折疊區(qū)通常

22、不會(huì)是酶的活性 中心以及底物結(jié)合的中心，而是作為結(jié)構(gòu)的支架；環(huán)區(qū)、轉(zhuǎn)角區(qū)域和帶電荷區(qū)域通常位于蛋白質(zhì)的表面。2、進(jìn)行定點(diǎn)突變時(shí)，應(yīng)注意保守氨基酸殘基。如果要改變酶活性、底物結(jié)合活性等高度特 異性的性質(zhì)，則應(yīng)盡量保留保守殘基。3、應(yīng)注意保留潛在的 n糖基化位點(diǎn)（asn-x-ser/thr-x-pro）中的asn（天門冬酰胺/set（絲氨酸） 或thr（蘇氨酸）。4、對(duì)于含有內(nèi)含子的序列，可以刪除某一外顯子或外顯子組合，因?yàn)閱蝹€(gè)外顯子通常編碼 獨(dú)立折疊的結(jié)構(gòu)域，刪去該結(jié)構(gòu)域后可能不會(huì)影響蛋白其余部分的正確折疊。5、構(gòu)建兩個(gè)同源蛋白的嵌合體時(shí)，應(yīng)盡量使其接合部位處在具有相同或相近功能的氨基酸 序列中

23、；而當(dāng)兩個(gè)非同源蛋白組成嵌合體時(shí)，則應(yīng)使接合部分盡量位于所預(yù)測結(jié)構(gòu)的邊緣。6、如果對(duì)目的蛋白的三維結(jié)構(gòu)一無所知，那么可以在目的序列中隨機(jī)插入六聚體接頭以鑒 定功能性結(jié)構(gòu)域。插入六聚體接頭后，在原蛋白質(zhì)序列中添加兩個(gè)氨基酸，比插入更多的氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)整體功能的破壞要輕。7、進(jìn)行缺失突變時(shí)，應(yīng)避免直接利用天然存在的限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行刪除。 蛋白質(zhì)工程在食品中的應(yīng)用：* 提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個(gè)方面：延長酶的半衰期；提高酶的熱穩(wěn)定性； 延長藥用蛋白的保存期； 抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失。一、消除酶的被抑制特性1985年，美國的埃斯特爾借助寡核甘酸介導(dǎo)的定位突變技術(shù)，用19種其他氨基酸分

24、別替代枯草芽抱桿菌蛋白酶分子第 222位殘基上易氧化的 met ,獲得了一系列活性差異很大的突變 酶。發(fā)現(xiàn)除了用 cys代替met的突變體以外，其他突變體的酶活性都降低了。 二、引入二硫鍵，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性 溶菌酶分子：由一條肽鏈構(gòu)成，并在空間上折疊形成二個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，酶活性中心位于二個(gè)結(jié)構(gòu)域之間。該酶分子在第97位和54位殘基上是兩個(gè)未形成二硫鍵的半胱氨酸。由于二硫鍵是一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的重要共價(jià)化學(xué)鍵，能將分子中的不同部位牢固地聯(lián)結(jié)在一起。因此，提高酶熱穩(wěn)定性最常用的辦法是在分子中增加一對(duì)或數(shù)對(duì)二硫鍵。 三、轉(zhuǎn)化氨基酸殘基，改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性 在高溫下asn和gln容易脫

25、氨形成 asp和glu,而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變，使蛋白質(zhì)失 去活性。對(duì)釀酒酵母的磷酸丙糖異構(gòu)酶進(jìn)行誘變改造。這種酶有兩個(gè)相同的亞基，每個(gè)亞基含有2個(gè)asn,由于它們都位于亞基之間的界面上，可能對(duì)酶的熱穩(wěn)定性起決定性作用。通 過寡核甘酸介導(dǎo)的定向誘變技術(shù)，將第14位和第78位上的2個(gè)asn分別轉(zhuǎn)變成thr（蘇氨酸）和ile（異亮氨酸）殘基，大幅度提高突變酶的熱穩(wěn)定性。四、改變酶的最適ph值條件葡萄糖異構(gòu)酶最適 ph為堿性，在80 c穩(wěn)定，而在堿性條件下，80 c時(shí)使高果糖漿焦化產(chǎn)生有害物質(zhì)，反應(yīng)只能在60c進(jìn)行。采用盒式突變技術(shù)將葡萄糖異構(gòu)酶分子中酸性氨基酸（glu或asp）集中的區(qū)域置換為

26、堿性氨基酸 （arg或lys）,可使葡萄糖異構(gòu)酶的最適ph值變?yōu)樗嵝裕纯稍诟邷叵逻M(jìn)行反應(yīng)。五、提高酶的催化活性酶的催化活性由酶分子上的必需基團(tuán)決定，如對(duì)酪氨酸-trna合成酶進(jìn)行定點(diǎn)突變。在天然狀態(tài)下，酪氨酸-trna合成酶分子內(nèi)第51位蘇氨酸殘基的羥基能與底物酪氨酰腺喋吟核甘酸戊糖環(huán)上的氧原子形成氫鍵，這個(gè)氫鍵的存在影響酶分子與另一底物 atp的親和力。因此, 利用定向誘變技術(shù)將酶分子第 51位蘇氨酸殘基改變?yōu)楦彼釟埢?酶(pro-51)與atp的親和 力被增加了近100倍，而且最大反應(yīng)速度亦大幅度提高。六、修飾酶的催化特異性利用定點(diǎn)突變技術(shù)葡萄糖淀粉酶的催化特性。如將活性中心的 gl

27、u、asp被gln、asn取代時(shí)，突變體酶分解a -1, 4糖昔鍵和a -1, 4糖昔鍵的活性比例發(fā)生明顯改變。七、修飾nisin的生物防腐效應(yīng)nisin是乳酸球菌分泌的有較強(qiáng)抗菌作用的小分子肽，可用于罐頭食品、乳制品、肉制品的保藏。nisin由34個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。nisin分子結(jié)構(gòu)中包含 5種稀有氨基酸，即aba、dha、dhb、ala-sala和ala-&aba,它們通過硫醛鍵形成五個(gè)內(nèi)環(huán)。改變 nisin氨基酸的序列，可增強(qiáng)其穩(wěn)定性、溶解度和擴(kuò)大抑菌譜等，擴(kuò)大 nisin的應(yīng)用范圍。酶工程：又稱酶技術(shù)，就是利用酶催化的作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需要的產(chǎn)品的

28、過程，是酶學(xué)理論與化工技術(shù)相結(jié)合而形成的一種新技術(shù)1是指重組dma技術(shù)的產(chǎn)汕化設(shè)計(jì)與應(yīng)用.包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分口上游技術(shù)指的 是基因重絹、克隆和表達(dá)的設(shè)i十與構(gòu)建(即重組dza技 術(shù))：而下游技忙貝上步愛到荃因工程菌或名田胞白勺大規(guī)模 土畜養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程.在 聿i用 jk因工布142t 術(shù)了 姆締 當(dāng) 安， 洲t g 妁壅曲上,4卜備質(zhì) 嶼龕l爰改序更1, 結(jié)抬開.勿能比行：旺而通也號(hào)壬e麻的船曲.嘉基ml序次i妁 吐電4期年后的仔姆普尋奴，農(nóng)史& 至由析的不。頁有歡妁爰，質(zhì)q； 利用密注量妁約膏總. dza, 妄石質(zhì)紜無備質(zhì)片隊(duì)等代族4 住 jc 已 鳧檜

29、 我才員*t妁維1 "禾 春,畬發(fā)畤工衽鳥于生物枝術(shù)的下環(huán)戰(zhàn)術(shù) » 應(yīng)工業(yè)化大觀棋珞養(yǎng)癡的.生產(chǎn)生 他嗣品的一種戰(zhàn)術(shù).化學(xué)酶工程：亦稱初級(jí)酶工程，指自然酶、 化學(xué)修飾酶、固定化酶及化學(xué)人工酶的研究和應(yīng) 用天然酶：材料提取，工業(yè)應(yīng)用*化學(xué)修飾酶：化學(xué)修飾，酶學(xué)研究和疾病治療率固定化酶：束縛于支持物上，反復(fù)使用率人工合成酶：化學(xué)合成生物酶工程：亦稱高級(jí)酶工程， 是酶學(xué)和以dna重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合 的產(chǎn)物。率用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）率修飾酶基因產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）率設(shè)計(jì)新酶基因，合成自然界不曾有的酶（新酶）。獲取酶制劑的方法：組織提?。耗竟系鞍酌?/p>

30、、凝乳蛋白酶微生物發(fā)酵：最大量的來源化學(xué)及生物合成：生物重組利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)： 酶種豐富：微生物種類多、菌株易誘變，菌種多樣 酶產(chǎn)量高：微生物生長繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶 生產(chǎn)成本低：微生物培養(yǎng)基來源廣泛、價(jià)格便宜 可以采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動(dòng)化，經(jīng)濟(jì)效益高可改造性強(qiáng)：可以利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開發(fā)新酶種酶生產(chǎn)菌的要求：安全可靠，非致病菌不易退化，不易感染噬菌體 產(chǎn)酶量高，而且最好產(chǎn)生胞外酶，以利于酶產(chǎn)品的分離純化能利用廉價(jià)的原料，發(fā)酵周期短，易培養(yǎng)酶的發(fā)酵方法：固體發(fā)酵法：優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡單，操作方便。缺點(diǎn)是缺點(diǎn)是勞動(dòng)強(qiáng)度較大，原料利用率較低， 生產(chǎn)周期較長液體發(fā)酵法：液體深層發(fā)酵是目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式固定化細(xì)胞發(fā)酵： 歷史不長，技術(shù)要求較高，需特殊的固定化細(xì)胞反應(yīng)器，只適用于胞外酶的生產(chǎn)提高酶產(chǎn)量的方法：（1）通過條件控制提高酶產(chǎn)量?添加誘導(dǎo)物?降低阻