免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

1、 免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)一、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展史概述二、免疫熒光組織化學(xué)的原理（一）直接方法1 檢查抗原方法2 檢查抗體方法（二）間接方法1檢查抗體(夾心法)方法2檢查抗體方法 3檢查抗原法 （三）補(bǔ)體法1直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物方法2間接檢查組織內(nèi)抗原方法（四）雙重免疫熒光組織化學(xué)標(biāo)記方法（五）對(duì)照試驗(yàn)1 直接方法 2 間接方法 3 補(bǔ)體方法 三、熒光抗體的制備（一）熒光素 1 異硫氰酸熒光素 2 四甲基異硫氰酸羅達(dá)明 3 得克薩斯紅(Texas red)4其它熒光素（二）熒光素標(biāo)記抗體的方法 1FITC標(biāo)記抗體的方法2四甲基異硫氰酸羅達(dá)明標(biāo)記抗體方法3藻紅蛋白標(biāo)記抗體方法4藍(lán)色熒光素

2、標(biāo)記抗體方法（三）熒光抗體的質(zhì)量控制 1染色特異性和敏感性的測(cè)定方法2F/P比值的測(cè)定方法3熒光抗體的保存四、免疫熒光組織化學(xué)染色方法（一）熒光抗體染色方法1直接方法2間接方法(雙層法) 3間接方法 (夾心法) 4補(bǔ)體方法5膜抗原熒光抗體染色方法6雙重染色方法7熒光抗體再染色方法（二）熒光抗原染色方法五、熒光顯微鏡檢查方法（一）熒光和熒光顯微鏡（二）熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求1載玻片2蓋玻片3標(biāo)本4封裱劑5鏡油（三）使用熒光顯微鏡注意事項(xiàng)（四）熒光圖像的記錄方法六、非特異性染色的消除方法（一）非特異性染色的主要因素（二）消除非特異性染色的方法1葡聚糖凝膠G-50柱層析法2DEAE纖維素柱層析法3熒

3、光抗體稀釋法4純化抗原方法5純化抗體方法免疫吸收方法6伊文氏藍(lán)(Evans blue)襯染色方法七、現(xiàn)狀與展望 免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)一、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展史概述免疫熒光組織化學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一，是由Coons和他的同事(1941)建立，免疫熒光技術(shù)與形態(tài)學(xué)技術(shù)相結(jié)合發(fā)展成免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)。它與葡萄球菌A蛋白(SPA)、生物素與卵白素、植物血凝素(ConA等)相結(jié)合拓寬了領(lǐng)域；與激光技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)，掃描電視和雙光子顯微鏡等技術(shù)結(jié)合發(fā)展為定量免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)；熒光激活細(xì)胞分類器Fluorescin activated cell sorter (FACS

4、)的應(yīng)用，激光共聚焦顯微鏡的問(wèn)世，使免疫熒光細(xì)胞技術(shù)發(fā)展到更高的階段，開(kāi)創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)的新領(lǐng)域。細(xì)胞顯微分光光度計(jì)與圖像分析儀的結(jié)合使免疫熒光組織化學(xué)的定量檢測(cè)更加準(zhǔn)確。80年代到90年代相繼又有新的熒光素出現(xiàn)如R-藻紅朊，B-藻紅朊，C-藻青蛋白，cy2, cy3, cy5, cy7均在流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡中廣泛應(yīng)用。由于免疫熒光組織化學(xué)的特異性，快速性和在細(xì)胞水平定位的準(zhǔn)確性，已在免疫學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、腫瘤學(xué)以及臨床檢驗(yàn)等許多方面得到廣泛應(yīng)用，日益發(fā)揮重要的作用。二、免疫熒光組織化學(xué)的原理免疫熒光組織化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再用這種熒光

5、抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，熒光素受激發(fā)光的照射，由低能態(tài)進(jìn)入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來(lái)的低能態(tài)，這時(shí)發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，利用熒光顯微鏡可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量（圖3-2-1）。圖3-2-1紫外光激發(fā)熒光物質(zhì)放射熒光示意圖用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法。用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。免疫熒光組織化學(xué)分直接法、間接法和補(bǔ)體法。（一）直接方法1

6、檢查抗原方法這是最簡(jiǎn)便、快速的方法，用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異性熒光抗體，直接用于細(xì)胞或組織抗原的檢查。此法特異性強(qiáng)，常用于腎穿刺，皮膚活檢和病原體檢查，其缺點(diǎn)是一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。（圖3-2-2）圖3-2-2 直接法2 檢查抗體方法將抗原標(biāo)記上熒光素，用此熒光抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng)，而將抗體在原位檢測(cè)出來(lái)。（二）間接方法1檢查抗體(夾心法)方法 此法是先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。2檢查抗體方法 用已知抗原細(xì)胞或組織切片，加上待檢血清，如果

7、血清含有切片中某種抗原的抗體，抗體結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體(抗種屬特異性IgG熒光抗體)與結(jié)合在抗原上的抗體反應(yīng)，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)明亮的特異性熒光。此法是檢驗(yàn)血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。3檢查抗原法此法是直接法的重要改進(jìn)，先用特異性抗體與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體與結(jié)合在抗原上的抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。同直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)3或4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于同一種屬產(chǎn)生的多種第一抗體的標(biāo)記顯示，這是現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。（三）補(bǔ)體法1直接檢查組織內(nèi)免

8、疫復(fù)合物方法 用抗補(bǔ)體C3熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補(bǔ)體反應(yīng)，而形成抗原-抗體-補(bǔ)體抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽(yáng)性熒光的部位就是免疫復(fù)合物上補(bǔ)體存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。2間接檢查組織內(nèi)抗原方法 常將新鮮補(bǔ)體與第一抗體混合同時(shí)加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)37孵育后，如發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補(bǔ)體熒光抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反應(yīng)，形成抗原-抗體-補(bǔ)體熒光抗體的復(fù)合物，此法優(yōu)點(diǎn)是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來(lái)源的第一抗體的檢查。（四）雙重免疫熒光組織化學(xué)標(biāo)記方法在同一組織標(biāo)本上需要同時(shí)檢查兩種抗原時(shí)要進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧话?/p>

9、均采用直接法，將兩種熒光抗體(如抗A和抗B)以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，發(fā)黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200標(biāo)記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。（五）對(duì)照試驗(yàn) 為了保證免疫熒光組織化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，排除某些非特異性染色，必須在初次試驗(yàn)時(shí)進(jìn)行以下對(duì)照試驗(yàn)：1直接方法 （1）標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本只加PBS或緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察組織內(nèi)如果有熒光，稱為自發(fā)熒光。 （2）抑制試驗(yàn)：可分為二步方法和一步方法。1）一步抑制方法：先將熒光抗體與過(guò)量未標(biāo)記特異性抗體作等量混合，再加在標(biāo)本上染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。2）二

10、步抑制方法：標(biāo)本先加未標(biāo)記的特異性抗體，水洗后再加標(biāo)記熒光抗體，結(jié)果應(yīng)呈陰性或明顯減弱的熒光。（3）陽(yáng)性對(duì)照：用已知陽(yáng)性標(biāo)本做直接法免疫熒光組織化學(xué)染色，結(jié)果應(yīng)呈陽(yáng)性熒光。結(jié)果：如對(duì)照1和2無(wú)熒光或弱熒光，3待檢查標(biāo)本呈強(qiáng)熒光即為特異性陽(yáng)性熒光。2間接方法（1）自發(fā)熒光對(duì)照：同直接法。（2）熒光抗體對(duì)照：標(biāo)本只加間接熒光抗體染色，結(jié)果陰性。（3）抑制試驗(yàn)：同直接法。（4）陽(yáng)性對(duì)照：同直接法。結(jié)果：如對(duì)照（1）、（2）、（3）均呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈陽(yáng)性熒光則為特異性熒光。3補(bǔ)體方法（1）自發(fā)熒光對(duì)照（2）熒光抗體對(duì)照（3）抑制試驗(yàn)（4）補(bǔ)體對(duì)照：取新鮮豚鼠血清1:10稀釋先作用標(biāo)本，洗后

11、再用抗補(bǔ)體熒光抗體染色，結(jié)果陰性。（5）抑制試驗(yàn)：標(biāo)本加滅活的第一抗體，再加1:10稀釋的新鮮豚鼠血清孵育后，再加未標(biāo)記的抗補(bǔ)體血清與抗補(bǔ)體熒光抗體等量混合稀釋液，結(jié)果應(yīng)為陰性。（6）陽(yáng)性對(duì)照。（1）（5）結(jié)果陰性，6和待檢標(biāo)本陽(yáng)性時(shí)，則為特異性熒光。三、熒光抗體的制備 制備熒光抗體是免疫熒光組織化學(xué)的重要技術(shù)之一，制備特異性強(qiáng)和高效價(jià)的熒光抗體必須選用高質(zhì)量的熒光素和高效價(jià)的抗體。（一）熒光素?zé)晒馐侵敢粋€(gè)分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時(shí)停止?？梢援a(chǎn)生明亮熒光的染料物質(zhì)，稱熒光色素。目前主要常用于標(biāo)記抗體的熒光色素如下：1 異硫氰酸熒光素（fluorescei

12、n isothiocyanate, FITC）FITC是一種呈黃色粉末狀，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光譜為490495nm，最大發(fā)射光譜為520530nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光，分子量為389.4。（圖3-2-3）圖3-2-3 FITC的分子結(jié)構(gòu)式在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵結(jié)合,成為標(biāo)記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個(gè)IgG分子上最多能標(biāo)記1520個(gè)FITC分子。2四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC)TMRIT

13、C是一種紫紅色粉末，較穩(wěn)定。其最大吸收光譜為550nm，最大發(fā)射光譜620nm呈橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對(duì)比清晰，與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同F(xiàn)ITC。它可用于雙標(biāo)記示蹤研究(圖3-2-4)。3得克薩斯紅(texas red)得克薩斯紅是一種褐色粉末狀，易溶于有機(jī)溶劑，性質(zhì)穩(wěn)定，在4下能保存2年以上，最大吸收光譜為590-595nm，最大發(fā)射光譜為620-630mm，共有四種結(jié)構(gòu)，常用的分子量為625.15(圖3-2-5)。圖3-2-4 TMRITC 的分子結(jié)構(gòu)式 圖3-2-5 Texas red的分子結(jié)構(gòu)式4 其它熒光素如4-乙酰胺-4-異硫氰酸-2-硫酸芪(SITS) 7-氨基甲基香豆 素

14、AMC呈蘭色熒光；藻紅素R(phycoerythrin-R)；花青(Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5,Cy7)等。 （二）熒光素標(biāo)記抗體的方法1FITC標(biāo)記抗體的方法（1）Marsshall氏法1）材料：抗體溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液、無(wú)菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶(25-50ml) 、冰及冰槽(或1000ml燒杯)、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯(500ml)、pH7.2的0.01mol/L PBS葡聚糖凝膠G-25層析柱等。2）方法及步驟：抗體的準(zhǔn)備：取適量已知抗體濃度之溶液，加入三角燒瓶中，再加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，

15、使最后抗體濃度為20mg/ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌(速度適當(dāng)以不起泡沫為宜)510min。熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)標(biāo)記的抗體總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準(zhǔn)確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。結(jié)合：邊攪拌邊將稱取的熒光素漸漸加入抗體溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上(大約在510min內(nèi)加完)，加完后，在4左右繼續(xù)攪拌1218h，通常將裝置安放4冰箱或冰庫(kù)中進(jìn)行。透析：結(jié)合完畢后，將標(biāo)記的抗體溶液離心(2000r/min)10min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中再置于燒杯中用0.01M pH7.2緩沖鹽水透析(04)

16、過(guò)夜。過(guò)柱：取透析過(guò)夜的標(biāo)記物，通過(guò)葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定。（圖3-2-6，圖3-2-7） 圖3-2-6 Sephadex G-25對(duì)FITC標(biāo)記抗體液(羊抗兔)柱層析洗脫模型 圖3-2-7 FITC 與家兔IgG球 蛋白在25和2時(shí)結(jié)合 的動(dòng)力學(xué) ( Kawamura 1964)（2）Chadwick氏法1）試劑和材料：抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%重碳酸鈉水溶液、0.01mol/L pH8.0磷酸鹽緩沖鹽水、1%硫柳汞、離心機(jī)及離心管、三角燒瓶(25ml)、冰槽、無(wú)菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯(500ml)透析袋、棉線、玻棒等。2）方法及

17、步驟：抗體準(zhǔn)備：用04的pH 8.0磷酸鹽緩沖鹽水將抗體蛋白溶液稀釋至濃度為3040mg/ml， 置入三角燒瓶?jī)?nèi)，放于冰槽中。熒光素準(zhǔn)備：按每毫克蛋白加入熒光素0.01mg計(jì)算，稱取所需之熒光素量，用3%重碳酸鈉水溶液溶解。將準(zhǔn)備的抗體與熒光素溶液等量混合，充分?jǐn)噭?，?4冰箱中結(jié)合1824h。透析和柱層析：方法同Marshall氏法。（3）改良法試劑：1）0.01mol/L pH7.2PBS配法：NaCl 18g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4 0.2g，溶于2000ml蒸餾水中，校定pH至7.2。2）0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液配法：取0.5mol/L Na2CO3(

18、5.3%)10ml加入0.5mol/L NaHCO3(4.2%)90ml，混勻后，校定pH至9.0。3）3%重碳酸鈉水溶液配法：稱1.5g無(wú)水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。方法及步驟：取高效價(jià)的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水(0.15mol/L NaCI)及緩沖液(0.5mol/L NaHCO3-Na2CO3 pH 9.0)稀釋使每ml內(nèi)含抗體10mg，緩沖液為總量的10%，降溫至4，加入異硫氰酸熒光素，(蛋白：熒光素=80mg:1mg)，在04下電磁攪拌1214h。然后用半飽和的硫酸銨將標(biāo)記球蛋沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨(用Nessler

19、氏試劑測(cè)驗(yàn)至隔夜透析的鹽水無(wú)氨離子及熒光色素為止)。將制備好的熒光抗體加疊氮鈉0.01%，分裝在1ml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中(4)可以用半年以上，-20保存可達(dá)2年以上。2四甲基異硫氰酸羅達(dá)明標(biāo)記抗體方法（1）取IgG10ml(6mg/ml)在0.1mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液中透析過(guò)夜。（2）將四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(每毫克IgG 加入520mg)溶于二甲亞砜(1mg/ml)，取此溶液300ml,一滴一滴加入抗體溶液中，同時(shí)電磁攪拌。（3）在室溫中攪拌2h，避光。（4）把結(jié)合物移入直徑3cm，高30cm大小的Bio-Gel P-6層析柱，用0.01mol/L pH 8.0的PBS

20、平衡過(guò)柱，流速為1.5ml/min。（5）收集先流出的紅色結(jié)合物，即為標(biāo)記抗體，分裝，4保存?zhèn)溆谩?藻紅蛋白標(biāo)記抗體方法（1）巰基化藻紅蛋白(phycoerthrin,PE)的制備 600l的15.5mg/ml鹽酸巰醇亞胺(iminothiolane hydrochloride)加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2ml PB(pH 6.8)混合，裝入透析袋置入50mmol/L pH 6.8 PB中透析，4過(guò)夜，再換用pH7.5 PB透析6h。每個(gè)PE分子中可結(jié)合8個(gè)巰基。（2）巰基PE-IgG制備 異雙功能試劑SPDPN-Succinimdyl 3-(2-pyridyldithi

21、o) propionate 30mg (1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入700l的4.2mg/ml IgG PB溶液(50mmol/L pH 7.5)，在室溫中反應(yīng)2.5h。再加入巰基化PE400l(1.7mg/ml)加到500l反應(yīng)混合液中，室溫反應(yīng)12h，加入100l的50mmol/L碘乙酸鈉封閉殘余巰基，在4用PB透析過(guò)夜。加入 0.01%NaN3分裝，4保存半年。（3）PE-標(biāo)記蛋白A方法1）取4.08mg PE 溶于0.1mol/L pH 7.4 PB(含0.1mol/L NaCl)1ml中，溶解后， 取出0.5ml，再加入10l SPDP無(wú)水甲醇液(2.6mg/ml)，SPDP/

22、蛋白摩爾比為10, 22反應(yīng)5min，過(guò)Sephadex G-50(1×17cm)，用100mmol/L pH 7.4PBS(含0.1mol/L NaCl)平衡和洗脫。2）0.5ml蛋白(2mg/ml)100mmol/L PBS(含有100mmol/L NaCl pH 7.4)，加入2.6l上述SPDP甲醇液， SPDP：蛋白A=9：5 ，22，40min, 加入25l二硫蘇糖醇(DTT) pH 7.4緩沖液，22，25min，同上過(guò)sephadex G-25，收集蛋白A峰。3）取0.77mg/ml的PE 和0.27mg/ml蛋白A 等量混合，22反應(yīng)6h，混合物4保存?zhèn)溆?，以上兩種

23、PE標(biāo)記制品，可最后溶于0.01mol/L pH 7.4 PB(含有0.1mol/L EDTA、1mol/L 碘乙酰胺、1% BAS和0.1% NaN3)，04保存。4藍(lán)色熒光素標(biāo)記抗體方法Kbaffan 等(1986)首先創(chuàng)立了藍(lán)色熒光素標(biāo)記和染色技術(shù)，可進(jìn)行雙標(biāo)記或多標(biāo)記。（1）取7-氨基-甲基香豆素(7-amino-4-methyl coumarin,AMC)260g溶于二甲亞砜25l中。（2）將上液加入10ml IgG- 巴比妥緩沖液(0.5mol/L, pH 8.5,內(nèi)含50100mg IgG)中，室溫反應(yīng)2h，過(guò)Sephadex G-50除去游離熒光素, 最大熒光波長(zhǎng)43

24、0nm, 最大吸收波長(zhǎng)354nm。（三）熒光抗體的質(zhì)量控制1染色特異性和敏感性的測(cè)定方法（1）特異性染色和效價(jià)測(cè)定 直接染色效價(jià)以倍比稀釋熒光抗體溶液如1：2，1：4，1：8，與相應(yīng)抗原標(biāo)本作一系列染色，熒光強(qiáng)度在“+”的最大稀釋度，為其染色滴度(效價(jià))或單位。實(shí)際染色應(yīng)用時(shí)，可取低一個(gè)或兩個(gè)稀釋度(即24個(gè)單位)，如染色效價(jià)為1：64，實(shí)際應(yīng)用時(shí)可取1：32或1：16。間接染色效價(jià)可按抗核抗體熒光染色法步驟，先用不同稀釋度的熒光抗體染色，結(jié)果以抗核抗體熒光強(qiáng)度“+”為標(biāo)準(zhǔn)，染色用效價(jià)和直接法相同。（2）非特異性染色測(cè)定 根據(jù)熒光抗體的用途不同，可用相類似的抗原切片或涂片，倍比稀釋熒光抗體，按

25、常規(guī)染色，結(jié)果在標(biāo)本上出現(xiàn)的非特異染色應(yīng)顯著低于特異染色，否則應(yīng)采取消除非特異性染色的方法處理熒光抗體。（3）吸收試驗(yàn) 在熒光抗體中加入過(guò)量相應(yīng)抗原，于室溫中攪拌2h后，移入4中過(guò)夜，3000r/min,離心30min，收集上清液，再用于相應(yīng)抗原陽(yáng)性標(biāo)本染色，結(jié)果應(yīng)不出現(xiàn)明顯陽(yáng)性熒光。2F/P比值的測(cè)定方法F(熒光素)和P(抗體蛋白)的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，一般要求F/P的克分子比值為12。過(guò)高時(shí)，非特異性染色增強(qiáng)；過(guò)低時(shí)，熒光很弱，降低敏感性。（1）蛋白質(zhì)定量 測(cè)定熒光抗體的蛋白質(zhì)mg/ml量。（2）結(jié)合熒光素定量 先制作熒光素定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，即準(zhǔn)確稱取FITC1mg，溶于1

26、0ml 0.5mol/L pH 9.0碳酸鹽緩沖液中，再用0.01mol/L pH 7.2 PBS稀釋到100ml，此時(shí)熒光素含量為10g/ml，以此為原液，再倍比稀釋9個(gè)不同濃度的溶液，用分光光度計(jì)在490nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值（OD），以光密度為縱坐標(biāo)，熒光素含量為橫座標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)圖。熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸收光譜峰值向長(zhǎng)波方向位移約5nm，F(xiàn)ITC和蛋白質(zhì)結(jié)合后由490nm變?yōu)?93-495nm，RB200和蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)?95nm。F/P比值的計(jì)算：可按以下公式計(jì)算。 FITC mg/ml 160000×103 FITCmg/ml F/P克分子比值= × = 0

27、.41× 蛋白質(zhì) mg/ml 390×106 蛋白質(zhì)mg/ml式中160000為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為FITC的分子量。蛋白質(zhì)從克換算為毫克需再乘以103，而熒光素從克換算為微克需要再乘以106。測(cè)定RB200熒光抗體的克分子比值公式如下： (RB200 mg/ml×10-3) ÷580 RB200熒光抗體的克分子比值= 蛋白質(zhì)mg/ml÷160000(IgG) A515nmOD 160000TMRITC熒光抗體克分子量比值= 或=重量比(g/g) × A280nmOD 5803熒光抗體的保存以04或-20低溫保存，防止抗體活性

28、降低和蛋白變性。最好加入濃度為1：5000的硫柳汞或者1：10000，疊氮納防腐，小量分裝如0.11ml，真空干燥后更易長(zhǎng)期保存。四、免疫熒光組織化學(xué)染色方法（一）標(biāo)本制作 （二）熒光抗體染色方法1 直接方法（1）染色 切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)如1：8或1：16的熒光抗體，在室溫或37染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。（2）洗片 傾去熒光抗體，將切片浸入pH 7.2PBS中洗兩次，電磁振動(dòng)，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。（3）50%緩沖(0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH 9.09.5)甘油封固、鏡檢。直接法比較簡(jiǎn)單，適合做細(xì)菌、螺旋體、原蟲(chóng)、真

29、菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)的抗原，特異性高而敏感性較低。2間接方法(雙層法)（1）切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37作用30min。然后用0.01mol/L pH 7.2PBS洗兩次，10min，用吸水紙吸去多余的液體。（2）再滴加間接熒光抗體(如兔抗人-球蛋白熒光抗體等)，同上步驟，染色30min，37，緩沖鹽水洗兩次10min，振動(dòng)，緩沖甘油封固，鏡檢。3間接方法 (夾心法)（1）切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。（2）滴加未標(biāo)記的特異性抗原作用切片于37，30min。（3）緩沖鹽水

30、洗2次，每次5min，吹干。（4）滴加特異性熒光抗體在切片上37，30min。（5）如（3）水洗。（6）緩沖甘油封固，鏡檢。4補(bǔ)體方法（1）材料和試劑1）免疫血清60滅活20min，用Kolmers鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8。補(bǔ)體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補(bǔ)體熒光抗體等，按下述的補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效價(jià)如為1：32則免疫血清應(yīng)用1：8稀釋。2）補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測(cè)定的結(jié)果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4的0.1mol/LPBS中溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。3）抗

31、補(bǔ)體熒光抗體：在免疫血清效價(jià)為1：4，補(bǔ)體為2單位的條件下，用補(bǔ)體染色法測(cè)定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià)，然后按染色效價(jià)1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。（2）方法步驟1）涂片或冰凍切片用冷丙酮10min固定和PBS洗一次，3min，吹至組織表面無(wú)水份。2）吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清及補(bǔ)體的等量混合液(此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都各稀釋一倍)滴于切片上，37作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。3）用緩沖鹽水洗2次，攪拌或振動(dòng)，每次5min，吸干標(biāo)本周?chē)荨?）滴加經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的抗補(bǔ)體熒光抗體30min，37，水洗同(3)。5）蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。5膜抗原熒光抗體染色方

32、法本法應(yīng)用直接法或間接法的原理和步驟，可對(duì)活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色，常用于T和B細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、瘤細(xì)胞抗原和受體等的研究，陽(yáng)性熒光主要在細(xì)胞膜上。FACS即采用此原理和方法。6雙重染色方法在同一標(biāo)本上有兩種抗原需要同時(shí)顯示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗體用FITC標(biāo)記，B抗原的抗體用羅達(dá)明標(biāo)記，可采用以下染色方法：（1）一步法雙染色方法 先將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合(A+B)，按直接方法進(jìn)行染色。（2）二步法雙染色方法 先用RB200標(biāo)記的B抗體染色，不必洗去，再用FITC標(biāo)記的A抗體染色，按間接法進(jìn)行。結(jié)果：A抗原陽(yáng)性熒光呈現(xiàn)綠色，B抗原陽(yáng)性呈現(xiàn)桔紅色熒光。（三）熒光抗原染色方法某些抗原

33、可以用熒光素標(biāo)記，制成熒光抗原，標(biāo)記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同。用熒光抗原可以直接檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗體，特異性較好，敏感性較差。染色方法同熒光抗體染色的直接方法。由于多數(shù)抗原難以提純或量少昂貴，一般很少采用此法。五、熒光顯微鏡檢查方法（一）熒光顯微鏡熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具，分透謝和落射二種類型，落射光無(wú)需鏡內(nèi)操作方便，效果更好。它是由超高壓光源、濾板系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像。（二）熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求1載玻片載玻片厚度應(yīng)在0.8-1.2mm之間，太厚的玻片，

34、一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚焦。載玻片必須光潔，厚度均勻，無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。2蓋玻片蓋玻片厚度在017mm左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過(guò)，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光又可激發(fā)標(biāo)本。3標(biāo)本組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重疊或雜質(zhì)掩蓋，背景非特異染色引起的熒光影響判斷。4封裱劑封裱劑常用甘油，必須無(wú)自發(fā)熒光，無(wú)色透明，熒光的亮度在pH8.59.5時(shí)較亮，不易很快褪

35、去。所以，常用甘油和0.5molL,pH9.09.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。如果用抗褪色劑封裱熒光染色標(biāo)本更有利于顯微攝影。配方是將P次苯基二胺二氫氯100mg加入PBS 10m1中，調(diào)pH至9.09.5，再加入甘油90ml，混勻，在室溫放置過(guò)夜，待其中小氣泡完全消失即可使用。5鏡油一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油，最好使用特制的無(wú)熒光鏡油可用甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。對(duì)于落射光熒光顯微鏡BX60，Nikon E-1000無(wú)須鏡油。（三）使用熒光顯微鏡注意事項(xiàng)1嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。2應(yīng)在

36、暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈515min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開(kāi)始觀察標(biāo)本。3防止紫外線對(duì)眼睛的損害。在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。4檢查時(shí)間每次以12h為宜，超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射35min后，熒光也明顯減弱或褪色；所以最多不得超過(guò)23h。5熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再啟用時(shí)，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。6標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料

37、袋中4保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。7熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般為四級(jí)，即“”無(wú)或可見(jiàn)微弱自發(fā)熒光?！?”僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光?！?”可見(jiàn)有明亮的熒光。“+”可見(jiàn)耀眼的熒光。（四）熒光圖像的記錄方法熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時(shí)，必須將二者結(jié)合起來(lái)綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀察，作為一般定性觀察，基本上是可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，采用細(xì)胞分光光度計(jì)，流式細(xì)胞儀，激光共聚焦顯微鏡和圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易減弱褪色，要

38、及時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微鏡攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24o以上。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大，如FITC的標(biāo)記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度就有降低。有的熒光強(qiáng)度不夠，曝光速度太慢，只能用人工掌握曝光時(shí)間，將熒光圖像拍攝下來(lái)。研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微數(shù)碼相機(jī)攝影系統(tǒng)裝置，如Nikon公司2001年在我國(guó)推出了Nikon E-1000 全自動(dòng)熒光顯微鏡配備有Cool CCD與計(jì)算機(jī)聯(lián)接將圖像采集在軟盤(pán)上再與彩色打印機(jī)連接直接打印照片。六、非特異性染色的消除方法（一）非特異性染色的主要因素組織的非特異性染色的機(jī)理很復(fù)雜，其產(chǎn)生的原因主要可分

39、以下幾點(diǎn)：1一部分熒光素未與抗體結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去引起非特異性染色。2抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分非特異結(jié)合。3除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原(如Forssman氏抗原)，可與組織中特異性抗原以外的相應(yīng)抗原結(jié)合。4從組織中難以提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。5抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，這種過(guò)量標(biāo)記的抗體分子帶過(guò)多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。6熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)?。（二）消除非特異性染色的方法消除熒光抗體非特異性染色的方法應(yīng)根據(jù)產(chǎn)生的原因采取

40、適當(dāng)?shù)姆椒ǎＳ玫姆椒ㄓ幸韵聨追N： 1透析法 熒光素如FITC分子可以通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過(guò)，可將未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。 （1）將標(biāo)記完畢的熒光抗體液裝入一透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，液面稍留空隙，緊扎。 （2）浸人0.01molL pH7.2的PBS中(懸于大于標(biāo)記物體積約50100倍的PBS內(nèi))，在4中透析，每日更換34次PBS，透析液中無(wú)熒光即可(在熒光光源照射下)。 2葡聚糖凝膠G-50柱層析法除去游離熒光素可用葡聚糖凝膠G-25或G-50柱層析方法，加入熒光抗體1518ml(按床體積的510加樣)，使其緩慢滲人柱內(nèi)，待即將全部入柱時(shí)，加入PBS少許，關(guān)閉下口，停留3040

41、min，使游離熒光素充分進(jìn)入分子篩孔中，然后再接通洗脫瓶開(kāi)始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開(kāi)明顯的距離界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來(lái)越大，熒光抗體最先流出，分前、中、后三部分，收集中間部分，測(cè)FP比值，合格者濃縮，分裝。如僅用小量熒光抗體，可用1cm×20cm的層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過(guò)濾23.5ml熒光抗體。 3. 熒光抗體稀釋法 先測(cè)定熒光抗體的特異性染色與非特異性染色效價(jià)，若二者效價(jià)相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽(yáng)性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法

42、和染色效價(jià)測(cè)定方法相同。 4. 純化抗原方法 用各種方法提純單一成分的抗原是產(chǎn)生單價(jià)特異性抗體的最主要條件?，F(xiàn)代免疫化學(xué)技術(shù)(免疫吸收法)和柱層析法等提供了很大的可能性。5伊文藍(lán)（Evan blue）襯染色方法用0.01%伊文藍(lán)的0.01mol/L pH7.2 PBS溶液稀釋熒光抗體，可將背景細(xì)胞和組織染色呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對(duì)比，減少了非特異性熒光，宜作常規(guī)應(yīng)用。伊文藍(lán)一般配成1%溶液，保存于4，用前再稀釋至0.01%用以稀釋熒光抗體。此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。七、現(xiàn)狀與展望免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)經(jīng)過(guò)半個(gè)多世

43、紀(jì)的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，已成為現(xiàn)代研究生物和醫(yī)學(xué)的重要手段之一。由于免疫熒光技術(shù)與形態(tài)、機(jī)能相結(jié)合不斷完善和發(fā)展，尤其是合成了多種新熒光素與抗體容易結(jié)合，結(jié)合物穩(wěn)定?？梢院虵ITC結(jié)合進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)記或三標(biāo)記。至今，它已和親合化學(xué)技術(shù)如SPA，Biotin及avidin, ConA相結(jié)合，應(yīng)用領(lǐng)域也日益擴(kuò)大，又與現(xiàn)代的電子計(jì)算機(jī)和掃描電視技術(shù)，共聚焦顯微鏡，熒光激活細(xì)胞分類器（FACS）以及數(shù)碼相機(jī)攝影技術(shù)的應(yīng)用，使得快速性、簡(jiǎn)便性有了更大的提高，使得定量更加準(zhǔn)確。90年代又開(kāi)展了熒光原位末端標(biāo)記和熒光原位雜交技術(shù)，使得范圍更廣大。雖然免疫組織化學(xué)有了很大的發(fā)展，如免疫金銀法，免疫膠體鐵

44、法，SP，Evision和CSA法，但由于它有自己獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，特異性強(qiáng)，定位準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速、鮮明，在許多領(lǐng)域中仍占有不可取代的地位。如腎活檢、皮膚活檢中IgG, IgM, IgA, C3等檢測(cè)，自身抗體的檢查，傳染病的快速診斷，單克隆抗體的篩選及鑒定等。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，放射出更加燦爛五彩繽紛的熒光。參考文獻(xiàn)1. Akivoshi. Kawamura, JR. Fluorescent antibody techniques and their application. University of Tokyo Press. 19692.

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