ELISPOT技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟

1、. （相關(guān)網(wǎng)站）ELISPOT技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟從原理上看ELISPOT的確很簡(jiǎn)單，但是在操作過(guò)程中有許多條件需要摸索，所以這里進(jìn)一步介紹一下ELISPOT的操作步驟。 （1） 將適量捕獲性抗體預(yù)先包被于96孔ELISPOT板上，用膠帶封板并在4孵育過(guò)夜。將板用PBS洗6遍，再用含體積比10%胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基封閉，室溫下孵育至少1h。FCS可以封閉所包被抗體的FCS受體以降低非特異性反應(yīng)。有一種特殊的96孔板底面介質(zhì)是PVDF膜，利用膜的多孔結(jié)構(gòu)可以讓單個(gè)細(xì)胞坐到其中，然后分泌細(xì)胞因子或特定抗體，這樣使最后的檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞靈敏度成為可能。同時(shí)，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT與ELIS

2、A的不同之處。理論上是可以同時(shí)包被兩個(gè)不同的抗體的，兩種不同的抗體可以利用不同的顯色系統(tǒng)顯出不同顏色，但是這樣就要考慮到不同抗體間的不親和性，必需保證每種抗體包被的數(shù)量要足夠。如果是使用試劑盒的預(yù)包被板，這一步就可以省略啦。 （2） 將陰性對(duì)照和細(xì)胞樣品，如外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，經(jīng)純化的CD8+T細(xì)胞或去除某種特異細(xì)胞群的PBMC，用含10%FCS的培養(yǎng)基稀釋至5×1042×105個(gè)/孔如果條件可以達(dá)到更高的細(xì)胞數(shù)，建議可以嘗試3×1055×105個(gè)/孔，特別是在分泌細(xì)胞），分裝于

3、ELISPOT板孔中，再加入特異的刺激物，如多肽或基因表達(dá)產(chǎn)物，提取的抗原等，陰性對(duì)照孔中只加入培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)中最好采用無(wú)血清的培養(yǎng)基，這樣可以避免因?yàn)檠迮尾煌牟町愃斐傻恼`差，同時(shí)也避免血清的某些成份會(huì)引起非特異的反應(yīng)），陽(yáng)性對(duì)照孔加入植物血凝素(PHA，2g/mL)或陽(yáng)性多肽，37，體積比為5% CO2培養(yǎng)2448h。要進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞必需制備成為懸液的形式。利用ELISPOT的檢測(cè)是十分靈敏的，頻率低至10-12的分泌細(xì)胞都可以被檢測(cè)出來(lái)。并且對(duì)于那些會(huì)貼壁的細(xì)胞也可以使用此種方法，雖然細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后不易被洗去，但是不會(huì)妨礙最后斑點(diǎn)的顯色。只要細(xì)胞可以正常分泌與抗體特異結(jié)

4、合的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物會(huì)逐步擴(kuò)散到細(xì)胞四周，最后還是可以顯示出斑點(diǎn)。 （3） 用含體積比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以棄去細(xì)胞，加入生物素化抗細(xì)胞因子的檢測(cè)抗體，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP標(biāo)記的鏈親和素，室溫孵育3h。 （4） 用PBS-Tween-20 再洗5次，加入底物 室溫下顯色，待出現(xiàn)紫色(AKP和底物的產(chǎn)物)或紅色(HRP和底物的產(chǎn)物)斑點(diǎn)時(shí)，即可用立體解剖顯微鏡或計(jì)算機(jī)輔助成像分析系統(tǒng)計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)，并用斑點(diǎn)形成單位(sfu/L百萬(wàn)加入細(xì)胞)記錄結(jié)果。每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)特異分泌CK的細(xì)胞。若預(yù)先包被抗原，則可用于ASC測(cè)定，這時(shí)，每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌特異抗體的細(xì)

5、胞。 完成了以上步驟后其實(shí)只是完成了實(shí)驗(yàn)的一半。在你不斷摸索反應(yīng)的條件之后，得到了一塊布滿斑點(diǎn)的板，接下來(lái)要如何對(duì)這些斑點(diǎn)進(jìn)行分析呢。如果利用顯微鏡人工技術(shù)無(wú)疑是太參有個(gè)人因素的實(shí)驗(yàn)了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果肯定會(huì)被審稿人好好質(zhì)疑一番。隨后，有人使用數(shù)碼相機(jī)拍攝下來(lái)后，使用photoshop進(jìn)行處理、計(jì)數(shù)，這種方法也存在較多的個(gè)人因素。一項(xiàng)技術(shù)要普及，為廣大研究人員所接受，就必需盡量減小人為的誤差。所以，近年許多公司開(kāi)始開(kāi)發(fā)計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)，使用系統(tǒng)設(shè)定的閾值對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行人工智能計(jì)數(shù)。這樣，由計(jì)算機(jī)將陰性對(duì)照中非特異反應(yīng)斑點(diǎn)進(jìn)行去除，同時(shí)由計(jì)算機(jī)進(jìn)行統(tǒng)一計(jì)數(shù)，這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果置信度便大大提升了。目前判斷的首要標(biāo)準(zhǔn)

6、還是斑點(diǎn)的大小，但是做過(guò)電泳、同位素等的計(jì)算機(jī)成像的研究人員都遇到過(guò)一個(gè)問(wèn)題：很多時(shí)候?qū)嶒?yàn)會(huì)產(chǎn)生一些較淡的斑點(diǎn)，用肉眼判斷絕對(duì)是背景。所以在設(shè)計(jì)軟件時(shí)也必需考慮到斑點(diǎn)深淺因素。計(jì)算機(jī)可以利用斑點(diǎn)的深淺、是否以中心為原點(diǎn)向四周減淡等特征對(duì)細(xì)胞分泌動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行分析，這項(xiàng)技術(shù)的成熟相信會(huì)使ELISPOT的應(yīng)用范圍更加擴(kuò)寬。 （5） ELISPOT 斑點(diǎn)的判讀像多數(shù)的Cell-based分析技術(shù)一樣，ELISPOT Cytokine技術(shù)也是相當(dāng)耗時(shí)、耗勞力的工作。事實(shí)上到目前為止，以目視法判讀少量細(xì)胞族群的特性如激活T細(xì)胞之激素分泌，仍被視為是免疫學(xué)技術(shù)上的一大挑戰(zhàn)。ELISPOT結(jié)果的判讀常需要專(zhuān)

7、聘、有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)員才可以；有時(shí)就算有專(zhuān)職技師判讀，使用傳統(tǒng)的顯微鏡計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)仍不免會(huì)偶有主觀意見(jiàn)，而有所偏頗。 科學(xué)實(shí)證的本質(zhì)，在于如何使實(shí)驗(yàn)結(jié)果能盡可能客觀、精確、同時(shí)有高重現(xiàn)性，傳統(tǒng)的人工計(jì)算法顯然無(wú)法達(dá)到此一要求。故而有幾個(gè)科研團(tuán)隊(duì)使自行開(kāi)發(fā)Plate Scanner與自動(dòng)分析軟件，其中以Paul Lehmann教授研究開(kāi)發(fā)之ImmunoSpot? Analyzer自動(dòng)分析儀最具代表性。分析ELISPOT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的過(guò)程中，儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后儲(chǔ)存成TIF檔；這些影像可以進(jìn)一步使用手動(dòng)、或是自動(dòng)方式計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)目，如果使用ImmuneSpot分析軟件，可以先設(shè)定

8、條件，然后同時(shí)分析斑點(diǎn)的大小，以推估激素分泌的多寡。預(yù)料像ImmunoSpot? Analyzer這一類(lèi)自動(dòng)圖像掃描分析儀器，將可克服傳統(tǒng)顯微鏡判讀方法耗費(fèi)人力、及人為客觀性等缺點(diǎn)，徹底解除ELISPOT分析技術(shù)的瓶頸問(wèn)題，進(jìn)一步推廣該技術(shù)的新穎應(yīng)用。 ImmunoSpot影像掃描分析儀可以提供不同的數(shù)據(jù)格式，包括未處理與處理過(guò)的膜表面影像、每個(gè)小孔中的斑點(diǎn)數(shù)目、每個(gè)小孔中的平均斑點(diǎn)數(shù)目、每個(gè)小孔中斑點(diǎn)大小的直方統(tǒng)計(jì)圖。ELISPOT分析儀的出現(xiàn)解決了以下問(wèn)題 哪些斑點(diǎn)是抗原特異性 T 細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)具有進(jìn)一步分析價(jià)值），哪些是無(wú)關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)沒(méi)有 T 細(xì)胞研究?jī)r(jià)值） 斑點(diǎn)大小的意義

9、 。 在對(duì)不同細(xì)胞因子計(jì)數(shù)和分析時(shí)，如何定義斑點(diǎn)最大和最小尺寸 如何從單個(gè)細(xì)胞基礎(chǔ)上分析 實(shí)驗(yàn)精確度有多高？如果一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生相似的細(xì)胞因子，在多大程度上會(huì)干擾分析結(jié)果 幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)才能使結(jié)果更有意義ELISPOT實(shí)驗(yàn)具體操作過(guò)程ELISPOT實(shí)驗(yàn)具體操作過(guò)程第一天 包板1、用25ul/孔70%乙醇預(yù)濕反應(yīng)板，室溫避光10分鐘，棄乙醇，用0.05%吐溫PBS洗三遍。2、用75ul/孔適宜濃度稀釋于PH9.6碳酸鹽包被液中的捕獲抗體包板。3、避光4過(guò)夜。第二天 制板 1. 棄抗體包被液，0.05%吐溫PBS洗板3次。 2. 用200ul/孔15%人AB血清1640封閉反應(yīng)板，避光室溫2小時(shí)。 制備

10、效應(yīng)細(xì)胞 3. 純化你所感興趣的細(xì)胞。 4. 用2%NCS1640洗細(xì)胞兩遍，計(jì)數(shù)，用無(wú)血清1640配成適宜濃度的細(xì)胞懸液。 制備靶細(xì)胞 5. 用2%NCS1640洗細(xì)胞兩次，用無(wú)血清1640配成1×106/ml。 6. 加載你要研究的抗原肽，37，2小時(shí)。 7. 2%NCS1640洗細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用無(wú)血清1640配成適宜濃度的細(xì)胞懸液。鋪板8. 棄掉封閉液， 0.05%吐溫PBS洗板3次。9. 小心加入效應(yīng)細(xì)胞懸液100ul/孔，37，30-60分鐘。10.小心加入靶細(xì)胞懸液100ul/孔，37，5%CO2孵育箱18-20小時(shí)(IFNr為例)。第三天1. 棄細(xì)胞。2. 用0.05%吐

11、溫PBS洗反應(yīng)板6次。3. 加入100ul/孔用5%BSA-PBS配制的適宜濃度的生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37，2小時(shí)。4. 用0.05%吐溫PBS洗反應(yīng)板6次。5. 加入100ul/孔平衡至室溫的用PBS配制的酶-親合素復(fù)合物（1：1000），室溫或37，避光1小時(shí)。6. 棄酶-親合素復(fù)合物，0.05%吐溫PBS洗板3次，PBS洗板3次或更多次。7. 配制底物溶液，加入100ul/孔，室溫10-20分鐘，視 顯色結(jié)果而定。8. 用自來(lái)水終止顯色反應(yīng)。9. 棄掉底托，將底部膜沖干凈，倒扣，避光，風(fēng)干。10.過(guò)夜后，計(jì)數(shù)各孔斑點(diǎn)數(shù)。ELISPOT關(guān)鍵步驟無(wú)菌操作步驟 包板: 每孔75&C過(guò)

12、夜。°micro;l包被抗體,  避光, 4封閉: 每孔加150 µl 10%AB血清1640, 避光室溫2 小時(shí)。細(xì)胞活化: 每孔加 100µl 103-2×105 C°細(xì)胞懸液，及特異抗原，肽，絲裂原等2-24hr,37以上資料由“北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司”與“北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部T細(xì)胞研究中心”提供 本帖最后由 自主創(chuàng)新 于 2008-3-17 10:53 編輯 ELISPOT實(shí)驗(yàn)技術(shù)要點(diǎn)ELISPOT實(shí)驗(yàn)技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn)1、捕獲抗體包被量需要滴定，它會(huì)影響斑點(diǎn)的形成。2、待測(cè)細(xì)胞的有效誘導(dǎo)，刺激劑劑量，

13、效果。首次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞濃度梯度是必要的。3、加樣細(xì)胞和試劑時(shí)槍頭千萬(wàn)不能碰觸孔底的PVDF膜，以防止其損壞。4、往板中所加液體切勿存有氣泡。5、放孵箱孵育時(shí)切勿經(jīng)常擾動(dòng)。6、整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中， 96孔板外最好包裹錫箔紙，直到顯色結(jié)束再棄去，以防邊緣影響。7、一塊板最好一次用完，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案，盡量最大程度地利用板孔和試劑。凍存細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)影響。8、檢測(cè)抗體和酶標(biāo)抗體最好現(xiàn)用現(xiàn)配。9、保證結(jié)果準(zhǔn)確，最好做復(fù)孔。10、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，板孔要陰干，不要在溫度過(guò)高及干燥環(huán)境下干燥孔板。11、洗板時(shí)也要小心，切勿損壞孔膜。12、加檢測(cè)抗體之前，最好在無(wú)菌環(huán)境下操作。13、設(shè)對(duì)照： 陽(yáng)性對(duì)照：重組細(xì)胞因

14、子或細(xì)胞因子分泌細(xì)胞             陰性對(duì)照：未刺激細(xì)胞，單純靶細(xì)胞對(duì)照             背景對(duì)照：無(wú)菌培養(yǎng)基14、操作BCIP/NBT顯色液時(shí)最好戴上手套。15、試劑平衡到室溫，尤酶標(biāo)抗體和底物。以上資料由“北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司”與“北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部T細(xì)胞研究中心”提供ELISPOT技術(shù)流程1    針對(duì)被分析物的 捕獲抗體包被在貼有PVDF膜的微孔板上。2在孔內(nèi)加入蛋白質(zhì) 封閉空的位點(diǎn)。3加入

15、抗原、肽段或有絲分裂素等刺激劑，加入細(xì)胞懸液孵育一定時(shí)間以激活細(xì)胞細(xì)胞受刺激后分泌的蛋白緊靠在細(xì)胞周?chē)?，與已固定的捕獲抗體結(jié)合。4吸出細(xì)胞懸液，用去離子水和清洗緩沖液洗滌細(xì)胞和未結(jié)合的蛋白被除去。5加入生物素標(biāo)記的針對(duì)被分析物的檢測(cè)抗體檢測(cè)抗體與被分析物結(jié)合，形成 夾心三明治復(fù)合物。6加入與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)連接的親和素親和素與檢測(cè)抗體上的生物素結(jié)合。7加入底物溶液,與酶發(fā)生顯色反應(yīng)，監(jiān)測(cè)顏色斑點(diǎn)的形成，終止底物反應(yīng)，室溫風(fēng)干，避光保存于封口塑料袋中直至分析顏色斑點(diǎn)。以上資料由“北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司”與“北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部T細(xì)胞研究中心”提供 本帖最后由 自主創(chuàng)新 于 2008-3-19

16、 12:01 編輯 ELISPOT技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟從原理上看ELISPOT的確很簡(jiǎn)單，但是在操作過(guò)程中有許多條件需要摸索，所以這里進(jìn)一步介紹一下ELISPOT的操作步驟。       （1） 將適量捕獲性抗體預(yù)先包被于96孔ELISPOT板上，用膠帶封板并在4孵育過(guò)夜。將板用PBS洗6遍，再用含體積比10%胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基封閉，室溫下孵育至少1h。FCS可以封閉所包被抗體的FCS受體以降低非特異性反應(yīng)。有一種特殊的96孔板底面介質(zhì)是PVDF膜，利用膜的多孔結(jié)構(gòu)可以讓單個(gè)細(xì)胞坐到其中，然后分泌細(xì)胞因子或特定抗體，這樣使最后的檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞靈敏度成為可能

17、。同時(shí)，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT與ELISA的不同之處。理論上是可以同時(shí)包被兩個(gè)不同的抗體的，兩種不同的抗體可以利用不同的顯色系統(tǒng)顯出不同顏色，但是這樣就要考慮到不同抗體間的不親和性，必需保證每種抗體包被的數(shù)量要足夠。如果是使用試劑盒的預(yù)包被板，這一步就可以省略啦。       （2） 將陰性對(duì)照和細(xì)胞樣品，如外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，經(jīng)純化的CD8+T細(xì)胞或去除某種特異細(xì)胞群的PBMC，用含10%FCS的培養(yǎng)基稀釋至5×1042×105個(gè)/孔如果條件

18、可以達(dá)到更高的細(xì)胞數(shù)，建議可以嘗試3×1055×105個(gè)/孔，特別是在分泌細(xì)胞），分裝于ELISPOT板孔中，再加入特異的刺激物，如多肽或基因表達(dá)產(chǎn)物，提取的抗原等，陰性對(duì)照孔中只加入培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)中最好采用無(wú)血清的培養(yǎng)基，這樣可以避免因?yàn)檠迮尾煌牟町愃斐傻恼`差，同時(shí)也避免血清的某些成份會(huì)引起非特異的反應(yīng)），陽(yáng)性對(duì)照孔加入植物血凝素(PHA，2g/mL)或陽(yáng)性多肽，37，體積比為5% CO2培養(yǎng)2448h。要進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞必需制備成為懸液的形式。利用ELISPOT的檢測(cè)是十分靈敏的，頻率低至10-12的分泌細(xì)胞都可以被檢測(cè)出來(lái)。并且對(duì)于那些會(huì)貼壁的細(xì)胞也

19、可以使用此種方法，雖然細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后不易被洗去，但是不會(huì)妨礙最后斑點(diǎn)的顯色。只要細(xì)胞可以正常分泌與抗體特異結(jié)合的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物會(huì)逐步擴(kuò)散到細(xì)胞四周，最后還是可以顯示出斑點(diǎn)。       （3） 用含體積比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以棄去細(xì)胞，加入生物素化抗細(xì)胞因子的檢測(cè)抗體，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP標(biāo)記的鏈親和素，室溫孵育3h。       （4） 用PBS-Tween-20 再洗5次，加入底物 室溫下顯色，待出現(xiàn)紫色(AKP和底物的產(chǎn)物)或紅色(HRP和底物的產(chǎn)物)斑點(diǎn)時(shí)，即可用立體

20、解剖顯微鏡或計(jì)算機(jī)輔助成像分析系統(tǒng)計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)，并用斑點(diǎn)形成單位(sfu/L百萬(wàn)加入細(xì)胞)記錄結(jié)果。每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)特異分泌CK的細(xì)胞。若預(yù)先包被抗原，則可用于ASC測(cè)定，這時(shí)，每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌特異抗體的細(xì)胞。       完成了以上步驟后其實(shí)只是完成了實(shí)驗(yàn)的一半。在你不斷摸索反應(yīng)的條件之后，得到了一塊布滿斑點(diǎn)的板，接下來(lái)要如何對(duì)這些斑點(diǎn)進(jìn)行分析呢。如果利用顯微鏡人工技術(shù)無(wú)疑是太參有個(gè)人因素的實(shí)驗(yàn)了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果肯定會(huì)被審稿人好好質(zhì)疑一番。隨后，有人使用數(shù)碼相機(jī)拍攝下來(lái)后，使用photoshop進(jìn)行處理、計(jì)數(shù)，這種方法也存在較多的個(gè)人因素。一項(xiàng)技術(shù)要普

21、及，為廣大研究人員所接受，就必需盡量減小人為的誤差。所以，近年許多公司開(kāi)始開(kāi)發(fā)計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)，使用系統(tǒng)設(shè)定的閾值對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行人工智能計(jì)數(shù)。這樣，由計(jì)算機(jī)將陰性對(duì)照中非特異反應(yīng)斑點(diǎn)進(jìn)行去除，同時(shí)由計(jì)算機(jī)進(jìn)行統(tǒng)一計(jì)數(shù)，這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果置信度便大大提升了。目前判斷的首要標(biāo)準(zhǔn)還是斑點(diǎn)的大小，但是做過(guò)電泳、同位素等的計(jì)算機(jī)成像的研究人員都遇到過(guò)一個(gè)問(wèn)題：很多時(shí)候?qū)嶒?yàn)會(huì)產(chǎn)生一些較淡的斑點(diǎn)，用肉眼判斷絕對(duì)是背景。所以在設(shè)計(jì)軟件時(shí)也必需考慮到斑點(diǎn)深淺因素。計(jì)算機(jī)可以利用斑點(diǎn)的深淺、是否以中心為原點(diǎn)向四周減淡等特征對(duì)細(xì)胞分泌動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行分析，這項(xiàng)技術(shù)的成熟相信會(huì)使ELISPOT的應(yīng)用范圍更加擴(kuò)寬。  &

22、#160;    （5） ELISPOT 斑點(diǎn)的判讀像多數(shù)的Cell-based分析技術(shù)一樣，ELISPOT Cytokine技術(shù)也是相當(dāng)耗時(shí)、耗勞力的工作。事實(shí)上到目前為止，以目視法判讀少量細(xì)胞族群的特性如激活T細(xì)胞之激素分泌，仍被視為是免疫學(xué)技術(shù)上的一大挑戰(zhàn)。ELISPOT結(jié)果的判讀常需要專(zhuān)聘、有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)員才可以；有時(shí)就算有專(zhuān)職技師判讀，使用傳統(tǒng)的顯微鏡計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)仍不免會(huì)偶有主觀意見(jiàn)，而有所偏頗。 ELISPOT技術(shù)原理在免疫學(xué)領(lǐng)域中，對(duì)于疾病以及疫苗研究不僅僅局限于體液免疫應(yīng)答（B細(xì)胞免疫），細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(cell mediated immune respon

23、se，CMI)也是人們所關(guān)注的，而T細(xì)胞在CMI中起關(guān)鍵作用。在研究免疫應(yīng)答機(jī)制時(shí)以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)體液中游離的細(xì)胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。 80 年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和 CK 分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ ELISPOT ）。作為一項(xiàng)新型的免疫酶技術(shù)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是從單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌抗體細(xì)胞(ASC)

24、 或分泌細(xì)胞因子(CK) 細(xì)胞的一項(xiàng)細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。由于該方法具有較高的特異性和敏感性，易操作，成本相對(duì)流式細(xì)胞分析術(shù)也較低，已被廣泛用于分泌CK細(xì)胞檢測(cè)或ASC測(cè)定中，對(duì)探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。        ELISPOT 法源自 ELISA，又突破傳統(tǒng) ELISA 法，是定量 ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：        （1） ELISA通過(guò)顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。

25、60;      （2） ELISPOT也是通過(guò)顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過(guò)ELISPOT 分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（某些研究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率）        由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬(wàn)-30萬(wàn)細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。捕獲抗體為高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不

26、會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。        下面將從發(fā)展、原理、具體實(shí)驗(yàn)操作、技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用幾方面進(jìn)行介紹。ELISPOT技術(shù)的發(fā)展（1） ELISPOT技術(shù)的過(guò)去       ELISPOT是20多年前便己研發(fā)成功的老技術(shù)。Czerkinsky 等人率先在1983年，運(yùn)用該技術(shù)成功地檢測(cè)出因受激而分泌抗體的B細(xì)胞頻率。從那時(shí)起世界各國(guó)免疫學(xué)者便開(kāi)始一長(zhǎng)期的ELISPOT Cytokine技術(shù)競(jìng)賽，每個(gè)團(tuán)隊(duì)都希望能率先將此一技術(shù)推廣來(lái)研究T細(xì)胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境，藉由偵測(cè)T細(xì)胞分泌的各類(lèi)細(xì)胞

27、因子，來(lái)定量機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時(shí)預(yù)測(cè)體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進(jìn)行的下游免疫反應(yīng)。ELISPOT Cytokine技術(shù)雖說(shuō)操作簡(jiǎn)單，但該技術(shù)并沒(méi)能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng)用在ex vivo T細(xì)胞功能研究。要讓ELISPOT技術(shù)從B細(xì)胞免疫走向T細(xì)胞免疫的產(chǎn)生的第一個(gè)主要問(wèn)題，便是靈敏度的提升，因?yàn)門(mén)細(xì)胞因子較之B細(xì)胞免疫球蛋白產(chǎn)量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對(duì)抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì)等幾個(gè)技術(shù)性的問(wèn)題，使當(dāng)時(shí)多數(shù)研究團(tuán)隊(duì)很難獲得清晰的斑點(diǎn)，結(jié)果是敏感度不夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。這問(wèn)題直到1996美國(guó)俄亥俄卅Case Wes

28、tern Reserve大學(xué)Paul Lehmann團(tuán)隊(duì)引進(jìn)PVDF薄膜的應(yīng)用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術(shù)因斑點(diǎn)呈色問(wèn)題造成低敏感度的缺失。與原來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來(lái)吸附單株抗體，使T細(xì)胞分泌的各類(lèi)細(xì)胞因子能在細(xì)胞周?chē)徒环?，讓呈色斑點(diǎn)集中、清晰、對(duì)比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)薄膜（Panel B）并行實(shí)驗(yàn)的比較結(jié)果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過(guò)完全相同的實(shí)驗(yàn)，Panel A呈現(xiàn)較清晰

29、的小色點(diǎn)。 第二個(gè)技術(shù)性問(wèn)題是ELISPOT Cytokine實(shí)驗(yàn)分析的幾個(gè)基本假設(shè)缺乏科學(xué)實(shí)證，也使得該技術(shù)在當(dāng)時(shí)并沒(méi)受到該有的廣泛重視。沒(méi)有科研人員嘗試去厘清一些基礎(chǔ)但很重要的問(wèn)題，諸如；     實(shí)驗(yàn)所得的斑點(diǎn)是抗原特定T細(xì)胞所生產(chǎn)，還是旁觀細(xì)胞受Cytokine刺激的次級(jí)效應(yīng)？     斑點(diǎn)的小或大有何生理意義；如何決定cutoff值？     能否相信斑點(diǎn)是由單一的細(xì)胞造成？    ELISPOT Cytokine分析技術(shù)能準(zhǔn)確測(cè)量的頻率范圍？    如果效應(yīng)相互拮抗的cytokine

30、同時(shí)產(chǎn)生，它們是否會(huì)互相妨礙？及到什么程度？ （2） ELISPOT 技術(shù)的現(xiàn)在1996年以來(lái)隨著抗體制備、PVDF膜材篁等技術(shù)改良，ELISPOT 分析技術(shù)已經(jīng)逐漸達(dá)到科研人員的期待，它已是當(dāng)世公認(rèn)最靈敏抗原特定T細(xì)胞的體外檢測(cè)技術(shù)。藉由檢驗(yàn)新鮮分離PBMC細(xì)胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術(shù)可提示T細(xì)胞免疫系統(tǒng)的兩個(gè)重要參數(shù)：抗原特定T細(xì)胞的clone族群大??；和免疫效應(yīng)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)路徑Th1/Th2。多年來(lái)經(jīng)過(guò)數(shù)十個(gè)研究團(tuán)隊(duì)的致力研究，對(duì)于ELISPOT分析技術(shù)本身的幾個(gè)問(wèn)題，也有了科學(xué)上的驗(yàn)證。目前一般公認(rèn)，ELISPOT技術(shù)允許科研人員在單細(xì)胞水平上識(shí)別抗原特

31、定T細(xì)胞，主要針對(duì)經(jīng)由CD4或者CD8細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下，ELISPOT Cytokine 斑點(diǎn)的數(shù)量分析顯示斑點(diǎn)是由一個(gè)單細(xì)胞所生成，同時(shí)斑點(diǎn)形態(tài)學(xué)與Time Response分析則顯示斑點(diǎn)直徑大小直接反映該細(xì)胞族群的產(chǎn)能。也因?yàn)槿绱耍珽LISPOT是個(gè)免疫學(xué)上的標(biāo)竿技術(shù)，它可以允許科研人員在幾乎自然生理?xiàng)l件下，觀察細(xì)胞實(shí)際分泌Cytokine的進(jìn)程，進(jìn)而可以得到藥理學(xué)信息，闡明免疫調(diào)節(jié)藥物如何影響T細(xì)胞分泌各類(lèi)cytokine的速率。藥物抑制T細(xì)胞免疫一般可通過(guò)兩程截然不同的機(jī)轉(zhuǎn)；使能分泌Cytokine的Precursor T細(xì)胞族群變小，或減少每Precursor T細(xì)

32、胞的cytokine產(chǎn)能，而ELISPOT技術(shù)能提供雙份信息。ELISPOT分析技術(shù)的幾個(gè)特點(diǎn)已經(jīng)讓它在抗原特定T細(xì)胞免疫學(xué)上獨(dú)占鰲頭。此技術(shù)是當(dāng)世唯一準(zhǔn)許百萬(wàn)分之一1:1000,000的準(zhǔn)確分析，如此強(qiáng)效的解析力使流式細(xì)胞技術(shù)也望其項(xiàng)背，以目前國(guó)內(nèi)外常規(guī)的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術(shù)的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對(duì)T細(xì)胞免疫學(xué)研究是必須的，因?yàn)榭乖囟═細(xì)胞一般在機(jī)體周邊循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生的頻率通常低于萬(wàn)中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術(shù)被證實(shí)適用于冰凍后復(fù)蘇的人類(lèi)淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離

33、樣品有相當(dāng)?shù)男r(jià)，沒(méi)有喪失功能。這一點(diǎn)對(duì)臨床試驗(yàn)非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣，如果試驗(yàn)牽涉全國(guó)多個(gè)臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，病人血樣可冰存并同時(shí)集中在中央實(shí)驗(yàn)室一齊被測(cè)試。同理，一個(gè)血樣或標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品可被分裝小份，被送到不同檢驗(yàn)中心進(jìn)行測(cè)試，以交互比對(duì)，同時(shí)有利LISPOT Cytokine技術(shù)流程的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。 （3） ELISPOT 未來(lái)展望ELISPOT 分析技術(shù)正在歐美各國(guó)發(fā)揮它的完整潛能，它讓免疫學(xué)家可以直接洞察活體內(nèi)T細(xì)胞相關(guān)生理學(xué)或病理學(xué)，就像是心臟外科醫(yī)師手上的那張心電圖，經(jīng)由這個(gè)技術(shù)科研人員可以在活體內(nèi)直接進(jìn)入一個(gè)器官系統(tǒng)，在那里視察、發(fā)掘，得到全新的智識(shí)

34、。從各國(guó)文獻(xiàn)可見(jiàn)ELISPOT技術(shù)已經(jīng)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的要求，并被廣泛地應(yīng)用在多項(xiàng)領(lǐng)域，包括監(jiān)視癌癥病人接受免疫療程時(shí)的反應(yīng)(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、腫瘤(Nagorsen, 2000)、或自體免疫病人體內(nèi)的一個(gè)特定的免疫反應(yīng)型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技術(shù)同時(shí)也在數(shù)個(gè)疫苗效價(jià)評(píng)估人體試驗(yàn)中，被當(dāng)成重要的終結(jié)指針。2003年1月，世界衛(wèi)生組織通過(guò)與大陸北京性艾中心

35、合作，將應(yīng)用ELISPOT技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)HIV疫苗研究免疫應(yīng)答反應(yīng)技術(shù)，該計(jì)劃將是首次利用ELISPOT技術(shù)對(duì)亞洲國(guó)家從事HIV疫苗研究和臨床試驗(yàn)的有關(guān)研究。我們期待未來(lái)此一技術(shù)能在我國(guó)免疫學(xué)界得到廣泛地應(yīng)用。 原理       ELISPOT就其原理來(lái)說(shuō)實(shí)在是很簡(jiǎn)單的，從本質(zhì)上說(shuō)和ELISA的原理是一樣的，理解起來(lái)并不難。細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通

36、過(guò)北京賽智創(chuàng)業(yè)科技公司的ELISPOT 酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。傳統(tǒng)的ELISA與ELISPOT都是根據(jù)酶免疫學(xué)檢測(cè)原理，通過(guò)酶的高催化頻率，放大反應(yīng)效果，從而達(dá)到很高敏感度的檢測(cè)效果。ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術(shù)原理與ELISA相似。其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是在96微孔培養(yǎng)盤(pán)底部披覆PVDF薄膜，用來(lái)吸附特殊挑選、且無(wú)毒性（不含sodium azide、內(nèi)毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)分離處理后，會(huì)被分配到微孔盤(pán)上，再接受適當(dāng)?shù)目乖碳?，并將微孔盤(pán)放置于溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)一段時(shí)間。一般而言，記憶型T細(xì)胞在

37、受抗原刺激數(shù)小時(shí)后會(huì)開(kāi)始分泌細(xì)胞激素，此時(shí)局部(在緊靠分泌細(xì)胞的周?chē)?分泌出的細(xì)胞激素會(huì)被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤(pán)中的細(xì)胞被移除并清洗后，被捕獲的細(xì)胞激素可進(jìn)一步使用生物素（Biotin）標(biāo)記的二次抗體來(lái)標(biāo)志，其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細(xì)胞會(huì)留下染色斑點(diǎn)。反應(yīng)步驟可大致分為：       （1） 利用特定細(xì)胞因子的單克隆抗體包被96孔板，封閉剩余的空白位點(diǎn)；       （2） 加入細(xì)胞懸液，用特異性抗原刺激、活化細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子，細(xì)胞因子會(huì)

38、往附近擴(kuò)散與之前包被的抗體進(jìn)行特異結(jié)合；       （3） 洗掉細(xì)胞；       （4） 加入酶標(biāo)二抗特異與細(xì)胞因子進(jìn)行結(jié)合，通過(guò)底物的顯色反應(yīng)，一個(gè)細(xì)胞所在位置就會(huì)顯出斑點(diǎn)，最后利用顯微鏡或者特定的讀板機(jī)（reader）就可以計(jì)算出樣品中被激活細(xì)胞的數(shù)目。       以上是檢測(cè)分泌細(xì)胞因子細(xì)胞的流程，如果是檢測(cè)分泌特異抗體的細(xì)胞只需把包被特異抗體變?yōu)榘惶禺惪乖纯伞?本帖最后由 自主創(chuàng)新 于 2008-3-15 22:25 編輯 Elispot知識(shí)  &#

39、160; Elispot與51Cr Release;Elisa;IC/Flow Cytometry的比較文件大小24.0 KB (24,576 字節(jié))文件類(lèi)型   DOC文檔   隨著酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,使體外檢測(cè)各種細(xì)胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應(yīng)答機(jī)制時(shí)以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)體液中游離的細(xì)胞因子（CK）或抗體，但由于 游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體 及CK的水平。80年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了

40、體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和CK分 泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對(duì)探 索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義  (ELISPOT)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法文件大小20.5 KB (20,992 字節(jié))文件類(lèi)型    DOC文檔   ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統(tǒng)ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。本文介紹了ELISPOT法的原理,方法和應(yīng)用領(lǐng)域等知識(shí).   ELISPOT診斷結(jié)核病更快速更準(zhǔn)確文件大小19.5 KB (19,

41、968 字節(jié))文件類(lèi)型DOC文檔     英國(guó)的研究人員最近報(bào)道了一種比結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（TST）更為有效的快速血液試驗(yàn)方法。這一靈敏的酶聯(lián)免疫點(diǎn)化驗(yàn)方法(ELISPOT)可用來(lái)探測(cè)對(duì)結(jié)核桿菌抗原特異的T細(xì)胞。英國(guó)牛津大學(xué)Nuffield臨床醫(yī)學(xué)系Dr.Ajit Lalvani及其同事報(bào)告：這些抗原不存在于牛 結(jié)核分支桿 菌BCG和大多數(shù)環(huán)境中的分枝桿菌。  新的免疫學(xué)測(cè)定法(ELISPOT)文件大小22.5 KB (23,040 字節(jié))文件類(lèi)型DOC文檔     免疫方法學(xué)進(jìn)展迅速，近年不斷出

42、現(xiàn)新的種類(lèi)?，F(xiàn)介紹檢測(cè)人IFN為例的PVDF Elispot法，僅供參考。ELISPOT法用于計(jì)量單個(gè)細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞因子生成細(xì)胞。此方法可測(cè)定細(xì)胞受到刺激后，產(chǎn)生細(xì)胞因子生成細(xì)胞的量，及未接受和/或接受治療的病人中細(xì)胞因子生成細(xì)胞的量。它的優(yōu)點(diǎn)是：減少體外操作步驟，使對(duì)細(xì)胞因子生成過(guò)程的分析結(jié)果盡可能與體內(nèi)一致。收藏 分享 評(píng)分 【摘要】  目的 構(gòu)建肝癌多表位基因和含Tat PTD的多表位基因的原核表達(dá)載體，表達(dá)純化融合蛋白，比較其細(xì)胞免疫反應(yīng)。方法 人工合成多表位和Tat基因；分別克隆入原核表達(dá)載體pBVIL1，構(gòu)建含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因原核表達(dá)

43、載體pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T；誘導(dǎo)表達(dá)、純化目的蛋白；IFN- ELISPOT法檢測(cè)免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答。結(jié)果 正確構(gòu)建復(fù)合表位基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，目的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中獲到高效表達(dá)，并得到有效純化；ELISPOT檢測(cè)顯示Tat+T蛋白免疫組能更有效地激發(fā)特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)論 所構(gòu)建的含Tat PTD的新型復(fù)合表位抗原能激活特異性CTL反應(yīng)，為基于CTL表位的肝癌免疫治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】  肝細(xì)胞癌 T細(xì)胞表位 ELISPOT Tat PTD    【Abstract】  Objective  T

44、o construct the prokaryotic recombinant plasmid to express HCC multiple epitopes gene, then purify the fused protein for ELISPOT analysis.Methods  The gene of multi-epitope were gained and it was cloned into prokaryotic expression vector and expressed in E.coli. An recombinant eukaryotic expres

45、sion vector was constructed and its eukaryotic expression was determined in transfected cells. Balb/c mice were immunized with different forms of antigen. The cell immune response was tested by ELISPOT.Results  The recombinant prokaryotic plasmid was correctly constructed. The gene was expresse

46、d in E. coli. highly and the expressed protein was purified efficiently. The antigen specific T cell response IFN- release  was much stronger in protein Tat+T group than in the other groups.Conclusion  This preliminary result showed that immunization with those improved recombinant polyepi

47、tope antigen has high antigenicity, especially in induction of high CTL response. This research may be useful to further development of immunotherapy for HCC.    【Key words】  hepatocellular carcinoma;T-cell epitopes;ELISPOT;TatPTD    肝細(xì)胞癌（HCC）是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)肝癌患者約

48、占全世界的50%，在我國(guó)加強(qiáng)肝癌的防治研究意義重大。隨著分子免疫學(xué)、腫瘤免疫治療學(xué)的迅猛發(fā)展，使免疫治療可能成為治療肝癌的有效手段13。主動(dòng)特異性免疫治療即腫瘤疫苗因其特異性高、針對(duì)性強(qiáng)又成為免疫治療的方向與主流。尋找腫瘤特異性/相關(guān)性抗原，增強(qiáng)其免疫原性，提高腫瘤免疫治療的效果已經(jīng)成為腫瘤疫苗研究的核心問(wèn)題。因此，本研究擬采用肝癌中高表達(dá)的AFP、MAGE-1分子作為模式腫瘤抗原，從抗原遞呈方式角度提高肝癌復(fù)合表位的免疫原性，為基于CTL表位肽的肝癌免疫治療打下基礎(chǔ)。    1  材料與方法    1.1  材料

49、  DNA限制性內(nèi)切酶（EcoR、BamH、Xho和Xba）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自博大生物公司；原核表達(dá)載體pET22b為Novagen公司產(chǎn)品，原核表達(dá)載體pBVIL1由本室構(gòu)建并保存4；Ni-NTA superflow 購(gòu)自 QIAGEN公司；ELISPOT檢測(cè)采用法國(guó)DIACLONE公司的Murine IFN ELISPOT 試劑盒；多肽由上海博亞生物公司合成與純化，純度達(dá)90%以上；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司。    1.2  肝癌復(fù)合表位基因的克隆  選取肝癌高表達(dá)的AFP和MAGE-

50、1作為模式腫瘤抗原58，選中6個(gè)CTL表位作為研究對(duì)象，以-NG-為連接臂對(duì)各表位加以連接9。以HIV Tat蛋白的4757位氨基酸和通用PAPRE表位作為T(mén)at 序列。    人工合成Tat（中間含EcoR、BamH）和多表位基因。通過(guò)原核表達(dá)載體pET22b將Tat和多表位基因連接。將含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因加入6個(gè)his分別克隆于原核表達(dá)載體pBVIL1中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T，并對(duì)其進(jìn)行酶切及DNA序列鑒定。    1.3  目的蛋白的表達(dá)、純化

51、60; 挑取單個(gè)克隆于37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1%接種量接種于LB（Amp+）培養(yǎng)基中，37活化至A值達(dá)0.40.6時(shí)，42水浴搖床繼續(xù)培養(yǎng)5h，收集菌體，取1ml誘導(dǎo)后的菌體沉淀15%SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，選取表達(dá)量最高的作為蛋白純化的工程菌。    制備包涵體，選用Ni-superflow進(jìn)行重組蛋白的純化，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。收集各部分洗脫峰，SDS-PAGE鑒定。凝膠過(guò)濾脫鹽復(fù)性重組蛋白。    1.4  小鼠免疫方案  進(jìn)行將6周齡Balb/c小鼠分為AC組，每組6只。A組為T(mén)at+T

52、重組蛋白組；B組為T(mén)重組蛋白組；C組為PBS對(duì)照組。重組蛋白免疫初次采用與弗氏完全佐劑1:1混合，50g/只，皮下多點(diǎn)和腹腔注射免疫小鼠；加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑，皮下多點(diǎn)和腹腔注射免疫小鼠。初次免疫后，分別于第3周和6周各加強(qiáng)1次。末次免疫后2周處死小鼠，無(wú)菌條件下取出脾臟，分離脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用于IFN-的ELISPOT檢測(cè)抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)。    1.5  免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的分離  斷頸處死小鼠，無(wú)菌取出脾臟，在 200目不銹鋼網(wǎng)上研磨脾組織。將脾細(xì)胞懸液8ml緩慢沿管壁加入裝有4ml Ficoll淋巴細(xì)胞分離液的透明離心管中，

53、1500r/min離心20min，小心吸取白膜層，用10ml預(yù)冷的培養(yǎng)基洗2次。計(jì)數(shù)分離得到的淋巴細(xì)胞，最后將細(xì)胞重懸于20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。    1.6  免疫小鼠IFN-的ELISPOT檢測(cè)  ELISPOT檢測(cè)具體操作按Murine IFN ELISPOT 試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，主要步驟如下：（1）在用100l/孔70%乙醇清洗ELISPOT板，室溫下放置10min；（2）棄去乙醇，100l/孔PBS洗板3次；（3）用10ml PBS稀釋100l捕獲抗體（capture antibody），混勻，加入PVDF板中，10

54、0l/孔，4靜置過(guò)夜（16h）；（4）次日清空孔內(nèi)液體，100l/孔PBS洗板1次，加入100l/孔2%脫脂奶PBS，室溫封閉2h；（5）輕輕晃動(dòng)ELISPOT板，棄去孔內(nèi)液體，在紙上輕輕拍干，100l/孔PBS清洗1次；（6）在每孔中加入合適濃度的細(xì)胞懸液和刺激原混合液共100l，蓋好板蓋，于37 5%CO2孵箱中培養(yǎng)20h；（7）輕輕晃動(dòng)ELISPOT板，清空孔內(nèi)液體，在紙上輕輕拍干；（8）加入100l/孔洗液（含0.1%Tween20的PBS），4靜置10min；（9）100l 0.1%Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次，每次靜置1min；（10）用10ml 1% BSA 的

55、PBS稀釋100l檢測(cè)抗體（detection antibody），混勻，每孔加入100l，37 CO2孵箱中孵育1.5h；（11）清空孔內(nèi)液體，100l 0.1%Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次；（12）用1%BSA PBS稀釋鏈親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶（Streptavidin-Alkaline Phosphatase Conjugate），每孔加入1:5000的稀釋酶液100l，37孵育1h；（13）清空孔內(nèi)液體，100l 0.1%Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次，拍干ELISPOT板直至沒(méi)有殘留液體；（14）在每孔中加入100l即用型BCIP/NBT底物反應(yīng)液

56、。室溫避光顯色210min，肉眼觀察斑點(diǎn)的形成；待斑點(diǎn)形成后，用蒸餾水終止反應(yīng)；（15）拍干ELISPOT板，4放置過(guò)夜，ELISPOT儀讀取結(jié)果（ImmunoSpot 3.2 Beta 1軟件），室溫避光保存。轉(zhuǎn)貼于 中國(guó)論文下載中心 2  結(jié)果    2.1  原核表達(dá)載體pBVIL1/T、pBVIL1/Tat+T的構(gòu)建與鑒定  將Tat、多表位（T）基因克隆于原核表達(dá)載體pET22b,構(gòu)建原核表達(dá)載體PET/Tat、PET/T,用EcoR和BamH雙酶切PET/Tat和T基因，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，連接Tat和多表位基因。

57、    將含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因克隆入原核表達(dá)載體pBVIL1，原核表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖1。酶切鑒定pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T的陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序與設(shè)計(jì)序列完全一致，成功構(gòu)建的原核表達(dá)載體可進(jìn)行表達(dá)純化。    2.2  目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化  將測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng) 15% SDS-PAGE電泳pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T分別在分子量22×103和21×103處出現(xiàn)一新增的蛋白條

58、帶，其大小與預(yù)計(jì)值相符，而空載體pBVIL1對(duì)照表達(dá)17×103的蛋白條帶。融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)（圖2）。    我們對(duì)不同的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了摸索，如誘導(dǎo)時(shí)的菌液濃度、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間等。最終確定誘導(dǎo)前培養(yǎng)約2.5h至A達(dá)0.5，42誘導(dǎo)5h為最佳條件,進(jìn)行重組蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)與純化。采用Ni柱法純化目的蛋白，洗脫峰中的目的蛋白純度較高（圖3）。    2.3  ELISPOT檢測(cè)免疫小鼠IFN-  ELISPOT結(jié)果示意圖見(jiàn)圖4。檢測(cè)結(jié)果顯示：A組（重組蛋白Tat+T免疫組）產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)明顯多于B組（重組蛋白T免疫組）和PBS對(duì)照組，差異有顯著性（P<0.05）。含Tat融合肽的重組蛋白Tat+T比不含Tat融合肽的重組蛋白T產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平高（圖5）。圖1  原核表達(dá)載體pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T的構(gòu)建示意圖    3  討論    如何評(píng)價(jià)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，是抗腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)。從T細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)的方法來(lái)看，EL