實(shí)驗(yàn)ELISA檢測(cè)溶血素 實(shí)三ELISA檢測(cè)溶血素

1、實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 elisaelisa檢測(cè)溶血素檢測(cè)溶血素【試劑與器材【試劑與器材】u綿羊紅細(xì)胞（綿羊紅細(xì)胞（srbcsrbc）免疫小鼠血清）免疫小鼠血清u抗抗srbcsrbc陽(yáng)性和陰性血清陽(yáng)性和陰性血清u辣根過(guò)氧化物酶（辣根過(guò)氧化物酶（hrphrp）標(biāo)記的抗甲胎）標(biāo)記的抗甲胎蛋白抗體蛋白抗體u碳酸鹽緩沖液（碳酸鹽緩沖液（ph9.6ph9.6）u磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩沖液（pbspbs，ph7.4ph7.4）u鄰笨二胺液鄰笨二胺液u硫酸（硫酸（2m2m）u酶標(biāo)反應(yīng)板、微量加樣器、溫箱、冰箱、酶標(biāo)反應(yīng)板、微量加樣器、溫箱、冰箱、酶標(biāo)儀等。酶標(biāo)儀等。【試劑與器材【試劑與器材】u包被稀釋液（包被稀釋液（

2、0.05mol/l na2co30.05mol/l na2co3nahco3 nahco3 緩緩沖液，沖液，ph9.6ph9.6） na2co3 1.5gna2co3 1.5g nahco3 2.9g nahco3 2.9g 加雙蒸水至加雙蒸水至1000ml1000mlu封閉液（封閉液（5%5%小牛血清小牛血清/pbs /pbs 溶液）溶液） 小牛血清小牛血清50ml50ml pbs pbs（ph7.4ph7.4）950ml950mlu洗滌液（洗滌液（pbstpbst，ph7.4ph7.4） naclnacl 8.0g 8.0g kh2po4 0.2g kh2po4 0.2g na2hpo4.

3、12h2o 2.9g na2hpo4.12h2o 2.9g kcl kcl 0.2g 0.2g tween tween 20 0.5ml 20 0.5ml 加雙蒸水至加雙蒸水至1000ml1000ml【試劑與器材【試劑與器材】u樣本稀釋液（樣本稀釋液（pbspbs，ph7.4ph7.4） naclnacl 8.0g 8.0g kh2po4 0.2g kh2po4 0.2g na2hpo4.12h2o 2.9g na2hpo4.12h2o 2.9g kcl kcl 0.2g 0.2g 加雙蒸水至加雙蒸水至1000ml1000mlu酶標(biāo)第二抗體：羊抗人酶標(biāo)第二抗體：羊抗人iggigg 標(biāo)記標(biāo)記hr

4、phrp（1 1：20002000）【試劑與器材【試劑與器材】u底物液（底物液（opdopdh2o2h2o2） a a 液液 （0.1mol/l 0.1mol/l 檸檬酸溶液）檸檬酸溶液） 檸檬酸檸檬酸19.2g 19.2g 加雙蒸水至加雙蒸水至1000ml1000ml b b 液液 （0.2mol/l na2hpo4 0.2mol/l na2hpo4 溶液）溶液） na2hpo4.12h2o 71.7g na2hpo4.12h2o 71.7g 加雙蒸水加雙蒸水1000ml1000ml 臨用前取臨用前取a a 液液24.3ml24.3ml，b b 液液25.7ml25.7mlu終止液（終止液（

5、2mol/lh2so4 2mol/lh2so4 溶液）溶液） 雙蒸水雙蒸水600ml600ml，濃硫酸，濃硫酸100ml100ml（緩慢滴加并（緩慢滴加并不斷攪拌），加雙蒸水至不斷攪拌），加雙蒸水至900ml900ml【操作方法【操作方法】（1 1）包被酶標(biāo)反應(yīng)板）包被酶標(biāo)反應(yīng)板u用用ph9.6 ph9.6 的碳酸鹽緩沖液的碳酸鹽緩沖液1 1：200 200 稀釋抗體，稀釋抗體，用之包被聚乙烯塑料板，每孔加用之包被聚乙烯塑料板，每孔加0.2ml0.2ml， 4 4c c 1224h1224h。（2 2）封閉酶標(biāo)反應(yīng)板）封閉酶標(biāo)反應(yīng)板u棄掉包被液，用棄掉包被液，用pbs pbs 洗滌洗滌3 3

6、次，甩干后用次，甩干后用5%5%小小牛血清牛血清/pbs /pbs 液封閉。放液封閉。放3737c40minc40min（或（或4 4c c 過(guò)夜）。封閉結(jié)束后用洗滌液洗板，并在濾紙過(guò)夜）。封閉結(jié)束后用洗滌液洗板，并在濾紙上拍干，每孔洗上拍干，每孔洗3 3遍，每遍遍，每遍3min3min。elisaelisa平板包被平板包被間接法間接法u抗原包被抗原包被: : 將包被液稀釋的抗原（將包被液稀釋的抗原（srbcsrbc）bsa bsa （2-10ug/ml2-10ug/ml）加入）加入9696孔酶標(biāo)版中，孔酶標(biāo)版中，每孔每孔100ul100ul，4c4c過(guò)夜。吸出上清液，加過(guò)夜。吸出上清液，加入

7、封閉液入封閉液200ul/200ul/孔?？?。37c37c封閉封閉1-1.51-1.5小時(shí)小時(shí)或或4c4c過(guò)夜。封閉結(jié)束后用洗滌液洗板過(guò)夜。封閉結(jié)束后用洗滌液洗板3 3次，每次次，每次3 3分鐘。分鐘。【操作方法【操作方法】（3 3）按圖）按圖1-11 1-11 所示加入待測(cè)樣品及陽(yáng)性所示加入待測(cè)樣品及陽(yáng)性對(duì)照（用對(duì)照（用pbs pbs 稀釋?zhuān)┫♂專(zhuān)﹗將稀釋好的待測(cè)血清樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)將稀釋好的待測(cè)血清樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)板中，每孔板中，每孔0.2ml0.2ml，陽(yáng)性對(duì)照樣品亦相，陽(yáng)性對(duì)照樣品亦相應(yīng)稀釋。置于應(yīng)稀釋。置于3737c c 溫箱溫箱0.51h0.51h。棄去。棄去孔中液體，用洗滌液洗滌

8、孔中液體，用洗滌液洗滌3 3 遍，每遍遍，每遍3min3min。（4 4）加酶標(biāo)二抗）加酶標(biāo)二抗 （用（用pbs pbs 稀釋?zhuān)┫♂專(zhuān)﹗加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗甲胎蛋抗加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗甲胎蛋抗體，每孔體，每孔0.2ml 0.2ml 置于置于3737c c 溫箱，溫箱，3045 min3045 min。棄去孔中液體，拍干，每。棄去孔中液體，拍干，每孔洗滌孔洗滌3 3 遍，每遍遍，每遍3min3min。【操作方法【操作方法】（5 5）加入底物液）加入底物液u取底物液：取底物液：a a 液液24.3ml24.3ml，b b 液液25.7ml25.7ml，加雙蒸水加雙蒸水50ml 50ml

9、 得得ph5.0 ph5.0 的磷酸的磷酸枸緣枸緣酸緩沖液酸緩沖液100ml100ml。再加入鄰苯二胺。再加入鄰苯二胺40mg40mg，充分溶解，最后加入充分溶解，最后加入30% h2o2 0.15ml30% h2o2 0.15ml。每孔加入底物液每孔加入底物液100l100l。避光室溫作。避光室溫作用用510min510min。（6 6）終止反應(yīng)）終止反應(yīng)u當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯顏色變化后，每當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯顏色變化后，每孔加入終止液孔加入終止液50l 50l 終止反應(yīng)。終止反應(yīng)?！窘Y(jié)果分析【結(jié)果分析】目測(cè)：根據(jù)顯色深淺，用（目測(cè)：根據(jù)顯色深淺，用（- -）為無(wú)色，（）為無(wú)色，（+ +）為淺）

10、為淺色，（色，（+）為黃色，（）為黃色，（+ + + + +）為棕黃色表示。）為棕黃色表示。一般呈一般呈+ + +以上者為陽(yáng)性以上者為陽(yáng)性酶標(biāo)儀測(cè)定：在酶標(biāo)儀測(cè)定：在492nm 492nm 波長(zhǎng)下測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)od od 值（值（a a492492） 。u當(dāng)待測(cè)樣品當(dāng)待測(cè)樣品a a492492值與陰性對(duì)照值與陰性對(duì)照a a492492值值的比值（的比值（p/np/n）大于大于2.12.1時(shí)，或待測(cè)樣品時(shí)，或待測(cè)樣品a a492492 對(duì)照對(duì)照a a492492值值 +3s，即可判斷為陽(yáng)性。以最大顯色至陽(yáng)性顯色孔的即可判斷為陽(yáng)性。以最大顯色至陽(yáng)性顯色孔的50%反應(yīng)孔的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。反應(yīng)孔的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。x【注意事項(xiàng)【注意事項(xiàng)】1.1.封閉時(shí)注意將封閉液加滿各反應(yīng)孔，并去除各封閉時(shí)注意將