食品中化學(xué)物的化學(xué)致癌作用

1、第九章 食品中化學(xué)物的化學(xué)致癌作用 癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病。在很多國家，癌癥死亡率占死因順位的第二位，甚至第一位。降低癌癥的發(fā)生率和死亡率是整個醫(yī)學(xué)面臨的重大挑戰(zhàn)。癌癥的病因很復(fù)雜，有遺傳因素和環(huán)境因素（化學(xué)性、物理性及生物性因素）等。癌癥的病因?qū)W和發(fā)病學(xué)研究將有助于闡明癌癥的本質(zhì)，并且將有助于采取適當(dāng)?shù)拇胧┻M(jìn)行有效的預(yù)防和阻斷癌癥的發(fā)生。 化學(xué)物致癌作用的研究已有多年的歷史。近幾十年來，化學(xué)致癌問題引起了廣泛的關(guān)注。國際癌癥研究所在1970年左右指出，8090的人類癌癥和環(huán)境因素有關(guān)，其中主要是化學(xué)因素，約占90以上。Doll和Peto于1981年報告了歸因于環(huán)境因素的癌癥死亡的

2、百分率(范圍)；煙草30(2540)，酒精3(24)，飲食35(1070)，食品添加劑1，生殖和性行為7(113)，職業(yè)4，污染2，工業(yè)產(chǎn)品1，藥品和醫(yī)學(xué)處置1，地球物理因素(包括紫外線等)3，感染10?，未知7。其中，化學(xué)因素約占77。 化學(xué)致癌(chemical carcinogenesis)是指化學(xué)物質(zhì)引起正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并發(fā)展成腫瘤的過程，具有這種作用的化學(xué)物質(zhì)稱為化學(xué)致癌物(chemical carcinogen)。在此，“癌”的含義已作了推廣，包括上皮的惡性變(癌)，也包括間質(zhì)的惡性變(肉瘤)及良性腫瘤。第一節(jié) 人癌細(xì)胞的基因型特征 據(jù)推測癌細(xì)胞可能有300個以上的基因發(fā)生了改

3、變。至今，已有超過50個顯性癌基因被鑒定；約有30種家族性腫瘤綜合征與腫瘤抑制基因有關(guān)。當(dāng)然，肯定還存在許多未被鑒定的腫瘤相關(guān)性基因。例如：Test等(1991)在一組小細(xì)胞肺癌中觀察到100多種異常。盡管其中的許多異常可能不代表對癌癥的發(fā)生產(chǎn)生影響的基因，其他一些異常卻可能代表著尚未鑒定的腫瘤相關(guān)基因。有關(guān)參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、增殖和維持DNA保真度基因的研究也提示，它們的改變可能影響到細(xì)胞的增殖與突變，甚至致癌過程。 已有很多證據(jù)表明突變引起癌癥，包括：很多致癌物是致突變物；對某些致癌物的易感性取決于細(xì)胞代謝活化酶轉(zhuǎn)化致癌物成為致突變物的活力；DNA修復(fù)能力的缺失增加癌發(fā)生的可能性；在多種癌觀

4、察到染色體和基因組的不穩(wěn)定性；某些癌具有可遺傳性；癌的單克隆性；某些癌有突變的癌基因；某些癌有腫瘤抑制基因的丟失或突變。 多種實驗方法已經(jīng)證實癌細(xì)胞和相應(yīng)的正常細(xì)胞之間在基因水平上存在差異。表9-1列出了人類的已確認(rèn)或預(yù)期可影響腫瘤發(fā)生的部分基因。腫瘤相關(guān)基因包括癌基因、腫瘤抑制基因及DNA保真性相關(guān)基因，限于篇幅，以下只能舉例介紹ras和p53的發(fā)現(xiàn)、性質(zhì)及功能。表9-1 腫瘤相關(guān)基因基因類型與命名功 能1. 癌基因EGF、TGF、gp30、p75、NAF、NDF、heregulin，sis（PDGF）、hst生長因子(KS-3)、FGF-5、FGF-6、IGF-、eckerbB-1、erb

5、B-2、HER-2neu、erbB-3fms、ret、mas、trk、met、生長因子受體或受體同源物dbl、kit、eek、elk、eckHa-ras、Ki-ras、N-ras、gsp、gip C蛋白o(hù)bl、BCR-abl、src、fps/fes、fgr、yes、syn、lck、sea膜結(jié)合或細(xì)胞漿酪氨酸蛋白激酶raf/mil、pim-1、cot、mos 絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶c-myc、L-myc、N-myc、lyl-1、tal、scl、fos、jun、RARa/myl轉(zhuǎn)錄因子erbA、evi-1、vav、gli-1、myb、rel、ski、ets2. 腫瘤抑制基因Rb、p53 細(xì)胞周期調(diào)控

6、APC/FAP細(xì)胞周期調(diào)控(可能的功能)DCC細(xì)胞粘附或配體受體(可能的功能)WT1轉(zhuǎn)錄因子(可能的功能)NFl、NF2、VHL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(可能的功能)3. DNA修復(fù)基因(1) 錯配修復(fù)HMSH2、GTBP形成雜二聚體，結(jié)合錯配堿基HMLH1、hPMS1、hPMS2菌MutL基因的同源基因，功能未知(2) 核苷酸切除修復(fù)XPA合損傷DNAXPB（ERCC3）DNA解旋酶XPC結(jié)合單鏈DNA(ssDNA)HHR23B與XPC結(jié)合XPD(ERCC2) 解旋酶XPE結(jié)合損傷DNAERCC1內(nèi)切酶亞單位XPF(ERCC4) 內(nèi)切酶亞單位XPG內(nèi)切酶RPA 結(jié)合ssDNAPCNA引物模板結(jié)合復(fù)合物的形成

7、CSB(RECC6)參與轉(zhuǎn)錄鏈的優(yōu)先修復(fù)(3) 堿基切除修復(fù)DNA糖基化酶切除損傷堿基的酶家族脫嘌呤胞嘧啶內(nèi)切酶水解5端堿基的磷酸二酯鍵DNA聚合酶、損傷鏈的再合成DNA連接酶I和新合成的鏈與臨近核苷酸的連接(4) X射線誘導(dǎo)損傷的修復(fù)XRCClDNA連接酶活性，單鏈斷裂的修復(fù)XRCC2雙鏈斷裂的再連接XRCC3單鏈斷裂的再連接XRCC4、XRCC5(KU80)、XRCC6(KU70)、XRCC7(scid)雙鏈斷裂的修復(fù)，V(D)J重組一、癌基因(oncogene) 癌基因的檢測主要通過DNA轉(zhuǎn)染試驗。如把來源于人癌細(xì)胞的DNA文庫導(dǎo)人受體細(xì)胞(如NIH3T3中)，這樣，受轉(zhuǎn)染細(xì)胞就會有一少

8、部分發(fā)生轉(zhuǎn)化，分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆，抽提并制備DNA文庫。該文庫中含有人DNA和小鼠DNA，以人特有的Alu核酸序列為探針，分出含人Alu基因的克隆，并抽提DNA作轉(zhuǎn)染實驗，找出含有人的癌基因的克隆。進(jìn)而尋找出引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化的DNA序列和其代表的基因，如H-ras。通過這種方法確認(rèn)的基因被稱為顯性轉(zhuǎn)化癌基因。將正常功能已發(fā)生改變的這些基因的單拷貝轉(zhuǎn)染細(xì)胞即可引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。細(xì)胞癌基因活化方式有：基因突變、外源基因插人、染色體易位與基因重排、基因丟失、DNA甲基化程度降低等。 ras基因家族有5個成員，即H-ras-1、ras-2、K-ras-1、K-ras-2和N-ras。其中，H-ras和K-

9、ras最初從大鼠肉瘤病毒中鑒定出，N-ras是從人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤鑒定出的。ras基因家族的特征是：基因的核苷酸序列(一級結(jié)構(gòu))相差很大，幾乎完全不同，但所編碼的蛋白質(zhì)分子量大致相同，均為p2lras蛋白，且其氨基酸序列有85的同源性。H-c-ras和K-c-ras各自定位于兩條不同的染色體上，但其中均有一個基因座位是假基因(pseudogene)。所謂假基因是指缺失了內(nèi)含子而不能轉(zhuǎn)錄的變異基因，因此也沒有蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)物。ras基因轉(zhuǎn)錄與翻譯后，先在胞漿中形成分子量為22kD的蛋白質(zhì)，它是P21的前體蛋白，這種前體蛋白一旦合成就被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜，與細(xì)胞膜結(jié)合并修飾成為成熟的p2l ras蛋白。大約

10、24h后，p21ras被磷酸化而錨泊于細(xì)胞膜上。p2lras沒有蛋白激酶活性，但與鳥嘌呤核苷酸(GTP、GDP)有高度親和力，并具有GTP酶活性，能促使蘇氨酸磷酸化。故p2lras參與細(xì)胞內(nèi)的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)。p21ras的N端第12位、59位和61位氨基酸是熱點突變位置。ras基因家族的表達(dá)有相對的組織特異性。H-ras主要在泌尿道腫瘤如膀胱癌、腎盂癌等中表達(dá)，K-ras主要在肺癌和結(jié)腸癌中表達(dá)較高，而N-ras則主要在造血系統(tǒng)的惡性腫瘤表達(dá)。但最近的研究指出，表達(dá)的這種組織特異性是相當(dāng)有限的，如H-ras和K-ras在膽囊癌、胰腺癌、腎母細(xì)胞瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病及黑色素瘤的表達(dá)也較高。而N-r

11、as在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤中的表達(dá)也有一定程度增加。二、腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene) 腫瘤抑制基因，又稱抗癌基因，是癌細(xì)胞中另一類的常見的異?；?。腫瘤抑制基因要獲得轉(zhuǎn)化活性，兩個等位基因編碼區(qū)內(nèi)都需發(fā)生滅活性損傷。這些滅活性損傷包括等位基因丟失和編碼區(qū)滅活性突變。腫瘤抑制基因是經(jīng)過體細(xì)胞雜交研究發(fā)現(xiàn)的，正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合后腫瘤的形成就會受到抑制。對兒童視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的研究也為該類基因的存在提供了證據(jù)。該病有散發(fā)型和遺傳型兩種。Knudsen推測視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的家族性是由于生殖細(xì)胞發(fā)生了兩次可遺傳性突變，并且兩次突變發(fā)生于同一位置。散發(fā)型視網(wǎng)膜瘤患者

12、常單側(cè)眼發(fā)生腫瘤，其生殖細(xì)胞沒有遺傳缺陷，只是癌細(xì)胞中兩個等位基因分別發(fā)生突變，視網(wǎng)膜細(xì)胞中視網(wǎng)膜基因蛋白(Rb)異常。由于該分子結(jié)構(gòu)異常干擾了自身的磷酸化，導(dǎo)致該分子失活。因此，該分子可被缺失、重排或突變滅活。 p53是人類腫瘤中分布最廣泛的一種突變的腫瘤抑制基因。對p53基因的認(rèn)識經(jīng)歷了幾個階段，即腫瘤抗原、癌基因和腫瘤抑制基因。直到1989年才知道其癌基因的作用實際上是突變型p53基因的作用，而野生型p53是一種腫瘤抑制基因。人p53定位于17號染色體短臂(17p13，1)，長約20kb，有11個外顯子和10個內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄成2.5kb mRNA，編碼393個氨基酸的蛋白，分子量為53kD

13、，有5個高度保守區(qū)，即第13-19，117142，171-192，236-258，270-286。野生型p53蛋白主要參與細(xì)胞周期的G1S交界處的檢查點的檢查機制，負(fù)責(zé)檢查細(xì)胞基因組的完整性，如DNA有損傷，則p53使細(xì)胞阻滯于G1期，以使其修復(fù)，如修復(fù)失敗，則p53蛋白可啟動細(xì)胞發(fā)生凋亡。突變型p53蛋白不僅不能抑制腫瘤發(fā)生，反而促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞凋亡。此外，突變型p53蛋白的半衰期遠(yuǎn)比野生型長，野生型p53蛋白的半衰期為20min，而突變型p53蛋白的半衰期為1.4-7h。人類腫瘤中，p53突變主要在高度保守區(qū)，以第175、248、249、273及282位點突變率最高。p53基因突

14、變有三種類型，即完全丟失、顯性負(fù)突變(dominant negative mutation)和顯性正突變(dominant positive mutation)。完全丟失是指細(xì)胞內(nèi)兩個等位基因均丟失或失活。有時細(xì)胞內(nèi)野生型與突變型p53基因共存，但由于后者的表達(dá)產(chǎn)物的半衰期較長，使其濃度遠(yuǎn)高于野生型p53蛋白。突變型p53蛋白與野生型p53蛋白結(jié)合并使后者失去抑癌作用，這稱為顯性負(fù)突變。顯性正突變是指野生型p53基因變?yōu)橥蛔冃蚿53而獲得致癌活性。臨床上，Li-Fmurneni綜合征是一種家族性p53基因原發(fā)缺陷癥，顯性遺傳，細(xì)胞染色體缺失17p，患者受照射后，p53蛋白不能被誘導(dǎo)高表達(dá)，故患

15、者對照射易感，易并發(fā)乳腺癌、肉瘤、腦瘤及結(jié)腸癌等多種腫瘤。三、DNA保真性相關(guān)基因 第三類基因系與DNA修復(fù)相關(guān)性基因。在某些方面，它與腫瘤抑制基因相似。因為單個正常的等位基因就可以決定表型，必須兩個等位基因全部失活才能增加癌癥的易感性。DNA修復(fù)相關(guān)基因在癌癥發(fā)生中很重要，但并不是決定腫瘤表型最重要的成份。 癌基因、腫瘤抑制基因和其他癌相關(guān)基因在正常細(xì)胞的功能是參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控及DNA復(fù)制和修復(fù)中DNA保真性的控制。已知有300多個遺傳特征與癌發(fā)生率有關(guān)，80多個基因在癌細(xì)胞中發(fā)生改變，30多個基因與人的腫瘤高易感性有關(guān)。這些數(shù)據(jù)及癌細(xì)胞表型的變化，說明致癌過程是一種多態(tài)現(xiàn)象，是由

16、多種途徑組成的。癌癥的發(fā)生是多步驟、需多基因參與的過程，包括癌基因和癌基因的協(xié)同、癌基因和抑癌基因的協(xié)同。 癌基因和腫瘤抑制基因比較見表9-2，近年的研究表明，正常細(xì)胞必須通過腫瘤相關(guān)基因遺傳改變的積累才能形成癌細(xì)胞，遺傳改變的多樣性和復(fù)雜性導(dǎo)致癌細(xì)胞的各種表型如自主性增殖、脫離細(xì)胞周期控制點、細(xì)胞和結(jié)構(gòu)的非典型性、侵襲和轉(zhuǎn)移等。lloyd等(1990)認(rèn)為成人腫瘤的形成過程可能積累多達(dá)10次以上的突變。癌癥的發(fā)病機制是復(fù)雜的，不同靶器官的機制也不盡相同。Vogelstein等(1988)描述的人結(jié)腸癌多階段模型(圖9-1)顯示，在引發(fā)和促長階段后還有多種遺傳學(xué)改變，因而，致癌的進(jìn)展階段也是相

17、當(dāng)復(fù)雜的，在進(jìn)展階 表9-2 致癌過程中涉及的兩組基因比較原 癌 基 因腫瘤抑制基因1. 涉及細(xì)胞生長和分化1. 功能不清楚，但可能涉及生長和分化(負(fù)調(diào)節(jié)?)2. 存在基因家族2. 存在基因家族3. 在癌中被活化或擴增3. 在痛中被滅活或丟失4. 因點突變、染色體易位或基因擴增而活化4. 因染色體丟失、染色體缺失、點突變、轉(zhuǎn)換、體細(xì)胞重而滅活5. 幾乎沒有證據(jù)與遺傳性癌有關(guān)5. 有明顯證據(jù)涉及遺傳癌和非遺傳癌段中外源化學(xué)物也可能影響腫瘤的演變。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，癌的侵襲和轉(zhuǎn)移也是個復(fù)雜 的過程，由相應(yīng)的基因控制，如轉(zhuǎn)移基因及轉(zhuǎn)移抑制基因。癌基因和腫瘤抑制基因的研究為鑒定化學(xué)致癌物作用靶基因提

18、供了基礎(chǔ)。體內(nèi)存在的癌癥相關(guān)基因是癌癥發(fā)生的內(nèi)因，而環(huán)境致癌因素是癌癥發(fā)生的外因。已經(jīng)證明化學(xué)致癌物引起實驗動物的癌癥涉及這些癌基因的活化和腫瘤抑制基因的滅活。 染色體：5q 12p 18q 17p改變：突變/丟失 突變 突變/丟失 突變/丟失基因：APC/MCC DNA K-ras DCC p53低甲基化 其他改變正常上皮 上皮過度增殖 早期腺瘤 中期腺瘤 晚期腺瘤 癌癥 轉(zhuǎn)移 引發(fā) 促長 進(jìn)展圖9-1 結(jié)腸致癌作用的多階段模型(Vogelstein等，1988)第二節(jié) 化學(xué)致癌機制 對化學(xué)致癌作用的機制研究已有多年的歷史，并形成了一些學(xué)派，主要有遺傳機制學(xué)派(genetic theory)

19、和遺傳外機制學(xué)派(epigenetic theory)。遺傳機制學(xué)派認(rèn)為，外來致癌因素引起細(xì)胞基因的改變或外來基因整合到細(xì)胞基因中，從而導(dǎo)致癌變。遺傳外機制學(xué)派認(rèn)為癌癥的發(fā)生是由于非基因改變機制引起的。隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)及遺傳學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的迅速發(fā)展，目前對致癌作用機制的認(rèn)識逐步深入，鑒于致癌物的多樣性和致癌過程的復(fù)雜性，遺傳機制和遺傳外機制可能是相輔相成的，在致癌作用的不同階段中起作用?；瘜W(xué)致癌機制重要的學(xué)說有親電子劑學(xué)說、體細(xì)胞突變學(xué)說、癌基因?qū)W說和癌變的階段學(xué)說。目前認(rèn)為，正常細(xì)胞經(jīng)過遺傳學(xué)改變的積累，才能轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞，癌癥的發(fā)生是多階段過程，至少包括引發(fā)、促長和進(jìn)展階段。癌變的階段

20、學(xué)說是在上世紀(jì)40年代，Rous、Mottram和Bemblum等分別研究利用致癌性多環(huán)芳烴和巴豆油誘發(fā)小鼠皮膚乳頭瘤，提出化學(xué)致癌的兩階段學(xué)說，即引發(fā)(啟動，initiation)和促長(promotion)兩個階段。其實驗證據(jù)是用亞致癌劑量(即在實驗期間不引起腫瘤發(fā)生的劑量)的致癌性多環(huán)芳烴涂抹小鼠皮膚一次，20周后不發(fā)生乳頭瘤或很少發(fā)生。但如在使用劑量相同的致癌物之后再用巴豆油涂抹同一部位(每周2次，共20周)則有約1312的小鼠發(fā)生乳頭瘤。單獨使用巴豆油或在涂抹致癌物之前使用巴豆油都不引起乳頭瘤。據(jù)此提出化學(xué)致癌的引發(fā)和促長兩階段學(xué)說，將所用的致癌性多環(huán)芳烴稱為引發(fā)劑(initiato

21、r)，巴豆油稱為促長劑(promotor)，巴豆油中具有促長作用的有效成分經(jīng)鑒定為佛波醇酯(TPA)。癌變的階段學(xué)說在肝、膀胱、肺、胃腸道等癌癥發(fā)生和體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗中得到證實。進(jìn)一步的研究證明，癌變過程是多階段過程，從良性腫瘤向惡性轉(zhuǎn)變的過程稱為進(jìn)展(progression)階段?；瘜W(xué)致癌過程的主要階段見圖9-2，在引發(fā)和進(jìn)展階段有細(xì)胞基因組(DNA)的結(jié)構(gòu)改變。在促長階段雖不涉及細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu)改變，但依賴于基因的表達(dá)改變。前致癌物 正常細(xì)胞DNA結(jié)合 活化 修復(fù) 引發(fā)的細(xì)胞終致癌物 致癌物-DNA 促長 加合物 分化的腫瘤DNA復(fù)制 進(jìn)展錯配修復(fù)失敗 DNA修復(fù)不分化的癌 轉(zhuǎn)移細(xì)胞死亡

22、細(xì)胞含錯配堿基圖9-2 化學(xué)致癌過程的主要階段一、引發(fā)階段 引發(fā)階段是指化學(xué)物或其活性代謝物(親電子劑)與DNA作用，導(dǎo)致體細(xì)胞突變成引發(fā)細(xì)胞的階段。在引發(fā)過程中至少有三個細(xì)胞功能是重要的，即致癌物的代謝，DNA修復(fù)和細(xì)胞增殖。 Miller等(1971)提出親電子劑學(xué)說，認(rèn)為大多數(shù)有機致癌物都是間接致癌物(indirect acting carcinogen)，又稱前致癌物(pro-carcinogen)，或先形成近致癌物(proximate carcinogen)再進(jìn)一步活化成終致癌物(ultimate carcinogen)。終致癌物是親電子劑，含有親電子中心，可與細(xì)胞大分子的親核中心共

23、價結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥。本身就有反應(yīng)活性，不需要代謝活化的致癌物或能自發(fā)形成親電子劑的致癌物稱為直接致癌物(direct acting carcinogen)。毒物代謝酶類對于間接致癌物具有代謝活化和代謝解毒雙重功能，間接致癌物的致癌性取決于代謝活化和代謝解毒之間的平衡。終致癌物引起DNA損傷可誘導(dǎo)DNA修復(fù)，DNA修復(fù)可能是無誤的，也可能將錯誤的堿基引入基因組，而細(xì)胞增殖對于產(chǎn)生基因組可遺傳的改變是必需的。引發(fā)階段歷時很短，引發(fā)作為一個突變事件，需要一次或多次細(xì)胞分裂來“固定”引發(fā)事件，引發(fā)所確定的基因型和或表型是不可逆的。引發(fā)細(xì)胞在形態(tài)上與正常細(xì)胞很難區(qū)別。引發(fā)是不可逆的，但并非所有的引發(fā)細(xì)

24、胞都將構(gòu)成腫瘤，因其中大多數(shù)將經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡(凋亡)。引發(fā)細(xì)胞不具有生長自主性，因此不是腫瘤細(xì)胞。引發(fā)劑本身有致癌性，大多數(shù)是致突變物，沒有可檢測的閾劑量，引發(fā)作用是不可逆的并且是累積性的。引發(fā)劑作用的靶主要是原癌基因和腫瘤抑制基因。引發(fā)階段的個體變異、物種差異及親器官特征是取決于細(xì)胞對致癌物的代謝、DNA修復(fù)及細(xì)胞增殖凋亡的平衡。二、促長階段促長階段是引發(fā)細(xì)胞增殖成為癌前病變或良性腫瘤的過程。促長劑單獨使用不具致癌性，必須在引發(fā)劑后使用才發(fā)揮促長作用，促長劑通常是非致突變物，存在閾劑量和最大效應(yīng)，其劑量反應(yīng)關(guān)系呈S形曲線。促長劑通常影響引發(fā)細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致局部增殖并引起良性局灶性病理損害

25、如乳頭瘤、結(jié)節(jié)或息肉。這些病損很多會消退，僅少數(shù)細(xì)胞發(fā)生進(jìn)一步突變引成惡性腫瘤。促長劑可能經(jīng)特異的受體中介干擾細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、改變基因表達(dá)；促長劑可能在細(xì)胞和分子水平上通過改變細(xì)胞周期控制，選擇性促進(jìn)引發(fā)細(xì)胞的增殖；促長劑還可能抑制程序性細(xì)胞死亡(凋亡)。促長階段歷時較長，早期有可逆性，晚期為不可逆的，因此在促長階段(特別是在早期)持續(xù)給以促長劑是必需的。促長階段的另一個特點是對生理因素調(diào)節(jié)的敏感性，衰老、飲食和激素可影響促長作用。證實引發(fā)和促長作用的實驗方案如圖9-3A，實驗期限一般為3-6個月，終點一般是癌前損害(PNL)，如小鼠皮膚乳頭瘤、大鼠和小鼠肝轉(zhuǎn)化灶、大鼠乳腺末端芽狀增生、大腸

26、和結(jié)腸的變性隱窩等。三、進(jìn)展階段進(jìn)展階段是從引發(fā)細(xì)胞群(癌前病變、良性腫瘤)轉(zhuǎn)變成惡性腫瘤的過程，在進(jìn)展期腫瘤獲得生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。在進(jìn)展期中可觀察到惡性腫瘤(癌)的多種特征，包括生長率增加、侵襲、轉(zhuǎn)移、對激素?zé)o反應(yīng)性、形態(tài)特征隨疾病的發(fā)展獨立地變異等。這些特征是由于在進(jìn)展階段的核型不穩(wěn)定性。環(huán)境因素在早期可影響進(jìn)展階段，但隨惡性腫瘤的生長和核型不穩(wěn)定性的發(fā)展，對環(huán)境因素的反應(yīng)可能喪失。作用于促長階段的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成進(jìn)展期的化學(xué)物稱為進(jìn)展劑(progressor)，進(jìn)展劑可引起染色體畸變，但不一定具有引發(fā)活性。進(jìn)展劑導(dǎo)致核型不穩(wěn)定性的機制很多，包括有絲分裂裝置的紊亂、端粒功能改變、DNA低甲基化、

27、重組、基因易位和基因擴增等。進(jìn)展階段主要的特征是核型不穩(wěn)定性，腫瘤的染色體發(fā)生斷裂和斷片易位，存在多復(fù)本或部分整個缺失。染色體結(jié)構(gòu)改變伴有細(xì)胞癌基因和或腫瘤抑制基因的突變，這些突變可能反映了適于惡性生長的細(xì)胞選擇并也可能反過來增加了核型不穩(wěn)定性。這些突變可能來自于癌基因腫瘤抑制基因的功能改變或由于化學(xué)致癌物暴露。表9-3 多階段致癌的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征引 發(fā)促 長進(jìn) 展1. 不可逆性1. 在基因表達(dá)和細(xì)胞水平上有可逆性1. 不可逆性2. 經(jīng)引發(fā)的“干細(xì)胞”在形態(tài)學(xué)上不能鑒定2. 持續(xù)給以促長劑才可維持促長細(xì)胞群2. 核型不穩(wěn)定性導(dǎo)致細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變；3. 對外源化學(xué)物及其他化學(xué)因子敏

28、感；3. 對衰老、飲食和激素因子敏感3. 在進(jìn)展階段早期，已改變的細(xì)胞對環(huán)境因子敏感；4. 引發(fā)細(xì)胞可能自發(fā)(內(nèi)源性)發(fā)生；4. 內(nèi)源性促長劑可起“自發(fā)性”促長作用；4. 在進(jìn)展階段觀察到良性或惡性能腫瘤5. 需經(jīng)細(xì)胞分裂“固定”；5. 劑量反應(yīng)關(guān)系顯示有閾值和最大作用；5. 進(jìn)展劑使已促長的細(xì)胞進(jìn)入此期。6. 劑量反應(yīng)關(guān)系沒有易于確定的閾值；6. 以能否有效地擴大引發(fā)細(xì)胞群來確定促長劑的相對強度。7. 經(jīng)規(guī)定的促長階段后，定量癌前病變來確定引發(fā)劑的相對強度。 A式AAAH AAG GAAaAAH H B圖9-3 在動物致癌研究中(A)證實引發(fā)和促長的實驗?zāi)Ｊ?B)證實進(jìn)展作用的實驗?zāi)Ｊ絇NL

29、癌前損害，NL惡性損害；i二偶見，1+-4+：少量-大量；V引發(fā)劑， 促長劑， 進(jìn)展劑證實進(jìn)展作用的實驗方案比較復(fù)雜(圖9-3B)，是在引發(fā)和促長階段之后再給以進(jìn)展劑，然后再繼續(xù)給以促長劑，實驗應(yīng)有適當(dāng)?shù)膶φ眨K點為惡性損害(NL)。引發(fā)、促長和進(jìn)展階段的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征見表9-3。兼有引發(fā)劑、促長劑和進(jìn)展劑作用的化學(xué)致癌物可稱為完全致癌物(complete carcinogen)。 綜上所述，化學(xué)致癌是長期的、復(fù)雜的多階段過程，至少涉及引發(fā)、促長和進(jìn)展三個階段。在引發(fā)和進(jìn)展階段涉及遺傳機制，在促長階段主要是遺傳外機制。在引發(fā)階段主要是細(xì)胞原癌基因和腫瘤抑制基因的突變，在進(jìn)展階段主要是核型不

30、穩(wěn)定性。正常細(xì)胞經(jīng)過遺傳學(xué)改變的積累才能轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞。第三節(jié) 化學(xué)致癌物的分類 可以用多種標(biāo)準(zhǔn)對化學(xué)致癌物進(jìn)行分類，如根據(jù)化學(xué)致癌物的結(jié)構(gòu)和來源、根據(jù)致癌作用的證據(jù)可靠性程度、根據(jù)作用機制等。本節(jié)主要介紹國際癌癥研究所(1ARC)的分類及根據(jù)作用機制的分類。一、IARC分類 IARC從1971年起組織專家組收集和評價世界各國有關(guān)化學(xué)物質(zhì)對人類致癌危險性的資料，編輯出版IARC關(guān)于化學(xué)物質(zhì)致人類癌癥危險性評價專題論文集，并于1979年、 1982年和1987年三次組織專家組對上述專題論文集所評價的環(huán)境因子和類別、混合物及暴露環(huán)境對人類的致癌性進(jìn)行再評價，并出版報告。自1987年專題論文集改名為I

31、ARC關(guān)于致人類癌癥危險性評價專題論文集，并擴展到物理因子、生物因子致人類癌癥危險性評價。 IARC關(guān)于化學(xué)物質(zhì)致人類癌癥危險性分類只與一種化學(xué)物致癌性證據(jù)的充分性(證據(jù)權(quán)重)有關(guān)，而并不涉及其致癌活性大小及其機制。IARC將化學(xué)物對人類致癌性資料(流行病學(xué)調(diào)查和病例報告)和對實驗動物致癌性資料分為四級：致癌性證據(jù)充分、致癌性證據(jù)有限、致癌性證據(jù)不足及證據(jù)提示缺乏致癌性。對人致癌性證據(jù)充分是指在致癌物和人癌癥發(fā)生之間有因果關(guān)系。致癌性證據(jù)有限是指因果關(guān)系的解釋是可信的，但其他的解釋如偶然性、偏倚、混雜因素不能完全排除。致癌性證據(jù)不足是指資料的性質(zhì)、一致性或統(tǒng)計學(xué)把握度不足以判斷因果關(guān)系或沒有對

32、人致癌性的資料。證據(jù)提示缺乏致癌性是指有幾個在已知人類充分暴露水平范圍內(nèi)的研究表明暴露水平與所研究的癌癥無關(guān)聯(lián)。 分類為人致癌物(組1)必須要有流行病學(xué)證據(jù)的支持。流行病學(xué)研究(隊列研究和病例對照研究)試圖為化學(xué)品接觸與人群癌癥發(fā)生(或死亡)增加的因果關(guān)系提供證據(jù)。癌癥流行病學(xué)研究是比較困難的，一般是在人群接觸某種化學(xué)品多年之后進(jìn)行，可能有很多混雜因素，并往往受到經(jīng)費和時間的限制。為治療目的給以化學(xué)品(藥品)和職業(yè)性接觸，較易控制接觸條件，但個體數(shù)和接觸期限也往往受到限制。因此，對于很多化學(xué)品需要由動物致癌試驗、短期試驗等為接觸此化學(xué)品的致癌危險性提供論據(jù)(主要用于危害鑒定)。 實驗動物致癌性

33、資料證據(jù)評價標(biāo)準(zhǔn)： (1) 致癌性證據(jù)充分指確立了受試物與腫瘤發(fā)生率(惡性或惡性和良性腫瘤合計)增加的因果關(guān)系：見于兩種或兩種以上動物；一個物種但經(jīng)兩次或多次獨立的試驗(包括不同時間或不同實驗室或在不同實驗方案條件下)；在一個物種一次試驗中，惡性腫瘤發(fā)生率、部位、腫瘤類型或發(fā)癌時間得到肯定的陽性結(jié)果。 (2) 致癌性證據(jù)有限指資料提示有致癌作用，但在作決定性評價中證據(jù)有限：致癌性證據(jù)限于一個試驗；在設(shè)計、實施或結(jié)果解釋的合理性方面尚有疑問；僅有良性腫瘤、未確定致癌性潛力的損傷、或該種系中此腫瘤的自發(fā)率較高。 (3) 致癌性證據(jù)不足指資料由于重要的定性或定量上的限制，不足以證明致癌作用的存在與否

34、，或沒有實驗動物致癌性的資料。 (4) 證據(jù)提示無致癌性是指有足夠的資料(至少兩種種系)證明該物質(zhì)無致癌性。但需指出，證據(jù)提示無致癌性的結(jié)論必然限于所研究的種系、腫瘤部位和暴露劑量水平。 IARC根據(jù)對人類和對實驗動物致癌性資料，以及在實驗系統(tǒng)和人類其他有關(guān)的資料(包括癌前病變、腫瘤病理學(xué)、遺傳毒性、結(jié)構(gòu)活性關(guān)系，代謝和動力學(xué)，理化參數(shù)及同類的生物因子)進(jìn)行綜合評價，將環(huán)境因子和類別、混合物及暴露環(huán)境與人類癌癥的關(guān)系分為下列四組： 組1，對人類是致癌物。對人類致癌性證據(jù)充分者屬于本組。 組2，對人類是很可能或可能致癌物。又分為兩組，即組2A和組2B。 組2A，對人類很可能(probably)是

35、致癌物，指對人類致癌性證據(jù)有限。對實驗動物致癌性證據(jù)充分。 組2B，對人類是可能(possible)致癌物，指對人類致癌性證據(jù)有限，對實驗動物致癌性證據(jù)并不充分；或指對人類致癌性證據(jù)不足，對實驗動物致癌性證據(jù)充分。 組3，現(xiàn)有的證據(jù)不能對人類致癌性進(jìn)行分類。 組4，對人類可能是非致癌物。 IARC專家組在1999年1月報告對834種環(huán)境因子和類別、混合物及暴露環(huán)境與人類癌癥關(guān)系評價結(jié)果，其中組1有75種，組2A有59，組2B有225種，組3有471種，組4有1種。組1和組2A詳見本章附錄。 IARC對化學(xué)物質(zhì)引起人類癌癥危險性評價，是目前公認(rèn)的權(quán)威性資料。在要了解某種化學(xué)物的致癌性時，應(yīng)首先查

36、閱IARC的資料(網(wǎng)址http：1935116411monoevalcrthgr01html)。二、根據(jù)致癌機制分類 根據(jù)化學(xué)致癌物的作用機制，Weisburger和William將化學(xué)致癌物分為遺傳毒性和非遺傳毒性兩大類。 1. 遺傳毒性致癌物(genotoxic carcinogens) 遺傳毒性致癌物對DNA造成損害，屬于遺傳毒性致癌物有以下幾種： (1) 直接致癌物：親電子性有機化合物，不依賴代謝活化，能直接與DNA反應(yīng)。 (2) 間接致癌物：需經(jīng)宿主或體外代謝活化成親電子劑后才能與DNA反應(yīng)。 (3) 無機致癌物：有些可能是親電子劑，但有些是通過選擇性改變DNA復(fù)制保真性，導(dǎo)致DNA

37、的改變，如金屬鎳、鉻。2. 非遺傳毒性致癌物(non-genotoxic carcinogens) 非遺傳毒性致癌物不與DNA反應(yīng)，可能間接地影響DNA并改變基因組導(dǎo)致細(xì)胞癌變，或者通過促長作用、增強作用導(dǎo)致癌的發(fā)展。非遺傳毒性致癌物包括以下幾種： (1) 促長劑：本身無致癌性，在給以遺傳毒性致癌物之后再給以促長劑可增強遺傳毒性致癌物的致癌作用，也可促進(jìn)“自發(fā)性”轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)展成癌。如佛波酯(TPA及其衍生物)、苯巴比妥、二丁基羥基甲苯(BHT)、1，8，9蒽三醇、DDT、TCDD(二惡英)及膽鹽等。 (2) 激素調(diào)控劑：主要改變內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡及細(xì)胞正常分化，常起促長劑作用。如乙烯雌酚、雌二醇、

38、硫脲。 (3) 細(xì)胞毒劑：可能引起細(xì)胞死亡，導(dǎo)致細(xì)胞增殖活躍及癌發(fā)展。如次氮基三乙酸及氯仿等。 (4) 過氧化物酶體增殖劑：過氧化物酶體增殖可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧自由基過量生成。如祛脂乙酯、鄰苯二甲酸乙基己酯。 (5) 免疫抑制劑：主要對病毒誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化起增強作用。如嘌呤同型物。 (6) 固態(tài)物質(zhì)：物理狀態(tài)是關(guān)鍵性因素，可能涉及細(xì)胞毒性。如塑料、石棉等。 3. 未分類：美舍吡倫。 非遺傳毒性致癌物并無與DNA反應(yīng)的證據(jù)，在慢性染毒可引起實驗動物癌癥發(fā)生率增加，其中某些非遺傳毒性致癌物是對自發(fā)性引發(fā)細(xì)胞起促長劑作用。但并非所有的非遺傳毒性致癌物均有促長活性。這些致癌物可能經(jīng)多種機制起作用，包括：引起細(xì)

39、胞增殖失調(diào)，直接的或持續(xù)的組織損傷，并隨之導(dǎo)致細(xì)胞增殖；增強氧應(yīng)激，生成活性氧自由基，導(dǎo)致DNA損傷；擾亂受體中介細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。 此外，已鑒定了一類助癌物(cocareinogen)。助癌物本身無致癌性，在致癌物之前或同時應(yīng)用助癌物可顯著增加癌癥的發(fā)生。如芘在苯并(a)芘致皮膚腫瘤起助癌作用，紙煙煙霧中的兒茶酚和其他酚類化合物可能兼具促長劑和助癌物的作用。助癌作用的機制可涉及增加致癌物的細(xì)胞攝入、增加活化的致癌物的比例、耗盡競爭性親核劑、抑制DNA修復(fù)、促進(jìn)DNA損傷固定為突變等。助癌物的作用特點和機制與促長劑不同，對人類癌癥的發(fā)生同樣具有重要的意義。第四節(jié) 哺乳動物致癌試驗 哺乳動物致癌

40、試驗是鑒定化學(xué)致癌物的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)試驗。哺乳動物致癌試驗用來確定受試物對試驗動物的致癌性、劑量反應(yīng)關(guān)系及誘發(fā)腫瘤的靶器官。在下列情況下，一般應(yīng)考慮進(jìn)行致癌性評價：人體可能長期暴露于該化學(xué)物；該化學(xué)物或其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與已知致癌物相似；反復(fù)染毒毒性試驗提示該化學(xué)物可能產(chǎn)生癌前病變。此外，研究結(jié)果表明，如在3種遺傳毒理學(xué)短期試驗均得到陽性結(jié)果，可預(yù)測為遺傳毒性致癌物；如在3種遺傳毒理學(xué)短期試驗均得到陰性結(jié)果，可預(yù)測為非遺傳毒性非致癌物；如經(jīng)5種遺傳毒理學(xué)短期試驗仍不能預(yù)測其致癌性的化學(xué)品，應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行哺乳動物致癌試驗。 ICH(1995)根據(jù)已知的危險因素、擬定的適應(yīng)癥和用藥時間，提出下列進(jìn)行新藥致癌

41、性研究的范圍，避免不必要的試驗。 臨床上連續(xù)應(yīng)用6個月以上的藥品；對慢性或復(fù)發(fā)性疾病需間斷性長期反復(fù)治療的藥品；造成長期暴露的給藥系統(tǒng)。 已知屬于對人具有潛在致癌性的同類化合物；構(gòu)效關(guān)系提示具有致癌危險性的物質(zhì)；長期毒性試驗發(fā)現(xiàn)癌前病變；原型或代謝產(chǎn)物在組織內(nèi)長期蓄積，引起局部組織反應(yīng)或其他病理生理反應(yīng)的物質(zhì)。 具有遺傳毒性的物質(zhì)往往具有致癌性，如擬長期使用，應(yīng)進(jìn)行慢性毒性試驗(1年)，檢測早期致癌反應(yīng)。 擬用于病人預(yù)期壽命少于3年的藥品不必進(jìn)行致癌試驗，如腫瘤治療藥等。 局部使用吸收很差的藥物不必進(jìn)行經(jīng)口致癌試驗。 已具有致癌性資料的藥物的各種酸、堿、鹽應(yīng)提供其在藥物動力學(xué)、藥效學(xué)或安全性方

42、面沒有明顯改變的證據(jù)，對于酯和復(fù)雜的衍生物在確定是否需要進(jìn)行致癌試驗時也應(yīng)有類似的資料，并應(yīng)個案討論。 基本作為替代治療的內(nèi)源性物質(zhì)不需要進(jìn)行致癌試驗。但對生物技術(shù)制品，下列情況可考慮進(jìn)行致癌試驗：生物學(xué)作用明顯不同于天然相應(yīng)物質(zhì)的制品；結(jié)構(gòu)明顯不同于天然相應(yīng)物質(zhì)的制品；在人體引起局部或全身濃度明顯增加的制品。一、試驗動物 物種和品系：要求用兩種實驗動物，常規(guī)選用大鼠和小鼠，也可用倉鼠。嚙齒類動物對多數(shù)致癌物易感性較高，壽命相對較短，費用也較低，生理和病理資料較完備，因此使用最廣泛。在選擇品系時應(yīng)選擇較敏感、自發(fā)腫瘤率低、生活力強及壽命較長的品系。美國國立癌癥研究所(NCl)推薦Fischer

43、344大鼠和B6C3F1小鼠。 性別：為接近人類情況，應(yīng)使用同等數(shù)量的雌雄兩種性別的動物。 年齡：使用剛離乳的動物，以保證有足夠長的染毒和發(fā)生癌癥的時間，而且幼年動物解毒酶及免疫系統(tǒng)尚未完善，對致癌作用比較敏感。二、劑量選擇和動物數(shù)量 致癌試驗一般設(shè)三個試驗組。美國NCI推薦以最大耐受劑量(MTD)為高劑量。最大耐受劑量是由90天毒性試驗來確定的，此劑量應(yīng)使動物體重減輕不超過對照組的10，并且不引起死亡及導(dǎo)致縮短壽命的中毒癥狀或病理損傷。ICH(1995)提出，高劑量選擇可以根據(jù)：毒性終點，即最大耐受劑量(MTD)；藥代動力學(xué)終點，嚙齒動物血漿AUC(時量曲線下面積)為人的25倍；選擇吸收飽和

44、劑量；藥效學(xué)終點，不應(yīng)產(chǎn)生生理學(xué)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂；最大可行劑量，受試物在飼料中最高含量為5。限制劑量為1500mg(kg體重·d)。中及低劑量組則按等比級數(shù)下推，如分別為上一個劑量水平的12或13。低劑量組應(yīng)不影響動物的正常生長、發(fā)育和壽命，即不產(chǎn)生任何毒性效應(yīng)。但低劑量組應(yīng)高于人的接觸劑量，一般不低于高劑量的10。中劑量組介于高、低劑量之間，如有可能按受試物的毒物動力學(xué)性質(zhì)來確定。對照組除不給受試物外，其他條件均與試驗組相同。同時應(yīng)設(shè)陰性(溶劑或賦形劑)對照組。必要時可設(shè)陽性對照組，陽性致癌物最好與受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相近。每組至少有雌雄各50只動物，希望在出現(xiàn)第一個腫瘤時，每組還有不少于

45、25只動物。如果有兩種以上的受試物同時試驗，可共用對照組，對照組動物數(shù)為雌雄各50 ×。試驗動物數(shù)與試驗組動物腫瘤發(fā)生率、對照動物腫瘤自發(fā)率及要求的統(tǒng)計學(xué)顯著性水平有關(guān)。表9-4是當(dāng)試驗結(jié)果有顯著性(P<0.05)時腫瘤發(fā)生率和所需每組最低動物數(shù)之間的關(guān)系，可供試驗設(shè)計及結(jié)果評定時參考。從此表可見，各組動物數(shù)為100只時(雌雄各50只)，當(dāng)腫瘤自發(fā)率為1，則試驗組腫瘤發(fā)生率超過自發(fā)率15在統(tǒng)計學(xué)上才有顯著性。腫瘤自發(fā)率越高，則要求試驗組腫瘤發(fā)生率超過自發(fā)腫瘤率越高。由此可見，選擇腫瘤自發(fā)率低的實驗動物品系是很重要的。表9-4 為保證假陰性率在5以下所需每組最低動物數(shù) 腫瘤自發(fā)率

46、()腫瘤發(fā)生率超過自發(fā)率 1 10 20 0.1 226747 1958629 3471874 1 3310 20530 35471 5 295 979 1645 10 121 289 423 15 74 147 202 20 52 92 121 25 40 65 82基于Fisher精確檢驗(P<0.05)三、染毒途徑 應(yīng)盡可能模擬人體可能的暴露途徑，主要途徑有經(jīng)口、經(jīng)皮和吸入三種，應(yīng)根據(jù)受試物的理化性質(zhì)和接觸方式選擇確定。 經(jīng)口染毒是將受試物給予實驗動物的常用途徑，一般把受試物摻入飼料或飲水中連續(xù)給予動物(57天周)。若摻入后的適口性不良，可用灌胃法。摻入濃度要定期監(jiān)測，觀察其均勻性

47、和穩(wěn)定性，摻入的濃度一般不超過5。 經(jīng)皮染毒，涂敷受試物的面積一般不少于動物體表總面積的10。必須保證受試物與皮膚良好接觸，并防止動物舔食。每天涂抹一次，每周37次。 吸人染毒，每天染毒4小時，每周57天。染毒柜內(nèi)受試物濃度應(yīng)定期或連續(xù)監(jiān)測，其分布應(yīng)均勻、恒定。其他注射途徑可根據(jù)需要采用。四、試驗期限 ICH(1997)建議參考下面幾條準(zhǔn)則： (1) 一般情況下，試驗期限小鼠和倉鼠應(yīng)為18個月，大鼠為24個月；然而對于某些生命期較長或自發(fā)腫瘤率低的動物品系，小鼠和倉鼠可持續(xù)24個月，大鼠可持續(xù)30個月。 (2) 當(dāng)最低劑量組或?qū)φ战M存活的動物只有25時，也可以結(jié)束試驗，對于有明顯性別差異的試驗

48、，則試驗結(jié)束的時間對不同的性別應(yīng)有所不同，在某種情況下因明顯的毒性作用，只造成高劑量組動物過早死亡，此時不應(yīng)結(jié)束試驗。 一個合格的陰性對照試驗應(yīng)符合下列標(biāo)準(zhǔn)：因自溶、同類自食，或因管理問題所造成的動物損失在任何一組都不能高于10。小鼠和倉鼠在18個月，大鼠在24個月時各組存活的動物不能少于50。五、觀察和結(jié)果分析 1. 一般觀察 每天觀察受試動物一次，主要觀察其外表、活動、攝食情況等。在實驗最初三個月每周稱體重一次，以后每兩周稱體重一次。經(jīng)飼料或飲水給以受試物時，應(yīng)記錄食物消耗量或飲水量，以計算受試物的攝人量。觀察時要注意有無腫瘤出現(xiàn)、腫瘤出現(xiàn)時間及死亡時間。老年動物多病易死，應(yīng)加強巡視，防止

49、動物死亡后未及時剖驗，發(fā)生尸體組織自溶。 2. 病理檢查 動物自然死亡或處死后必須及時進(jìn)行病理檢查，包括肉眼和組織切片檢查。組織切片檢查應(yīng)包括已出現(xiàn)腫瘤或可疑腫瘤的器官和肉眼檢查有明顯病變的器官，應(yīng)注意觀察癌前病變。通過病理檢查確定腫瘤的性質(zhì)和靶器官。 3. 結(jié)果分析 統(tǒng)計各種腫瘤的數(shù)量(包括良性和惡性腫瘤)及任何少見的腫瘤的動物數(shù)、每只動物的腫瘤數(shù)及腫瘤潛伏期。 腫瘤發(fā)生率()=(實驗結(jié)束時患腫瘤動物總數(shù)有效動物總數(shù))×100式中，有效動物總數(shù)指最早發(fā)現(xiàn)腫瘤時存活動物總數(shù)。腫瘤潛伏期即從攝人受試物起到發(fā)現(xiàn)腫瘤的時間，因為內(nèi)臟腫瘤不易覺察，通常將腫瘤引起該動物死亡的時間定為發(fā)生腫瘤的

50、時間。應(yīng)對試驗結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)的統(tǒng)計學(xué)分析，并研究劑量反應(yīng)關(guān)系。 致癌試驗陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)為WHO提出的標(biāo)準(zhǔn)。WHO(1969)提出機體可以對致癌物有下列一種或多種反應(yīng)： (1) 對于對照組也出現(xiàn)的一種或數(shù)種腫瘤，試驗組腫瘤發(fā)生率增加； (2) 試驗組發(fā)生對照組沒有的腫瘤類型； (3) 試驗組腫瘤發(fā)生早于對照組； (4) 與對照組比較，試驗組每個動物的平均腫瘤數(shù)增加。 在進(jìn)行試驗的兩個物種兩種性別動物中，有一種結(jié)果為陽性，即認(rèn)為該受試物有致癌性。兩個物種兩種性別動物試驗結(jié)果均為陰性時，方能認(rèn)為未觀察到致癌作用。 在結(jié)果報告中，應(yīng)著重報告發(fā)現(xiàn)腫瘤的部位、數(shù)量、性質(zhì)、癌前病變，以及其他毒性效應(yīng)；應(yīng)報告劑

51、量反應(yīng)關(guān)系及統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果。如在動物組織中觀察到良性和惡性腫瘤，并有良性腫瘤向惡性化進(jìn)展的證據(jù)，在進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析之前將良性和惡性腫瘤合并是適宜的，但仍希望分別對良性和惡性腫瘤分別進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。評價該試驗不同劑量良性腫瘤和惡性腫瘤的相對數(shù)量可有助于確定該受試動物對受試物的劑量反應(yīng)關(guān)系。另一方面，如果僅觀察到良性腫瘤，并無惡性化進(jìn)展的證據(jù)，則將此受試物認(rèn)為是致癌物是不適宜的，此僅提示在該試驗條件下需要進(jìn)一步研究。第五節(jié) 與研究致癌作用有關(guān)的其他試驗 哺乳動物致癌試驗是標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)試驗，對于鑒定哺乳動物致癌物是關(guān)鍵性的試驗，但其實驗條件要求較高，人力、經(jīng)費及時間耗費巨大，難以滿足化學(xué)品安全性評價的要求

52、。為此，發(fā)展了一些與研究致癌作用有關(guān)的其他試驗。一、用于致癌物篩選的短期試驗 用于致癌物篩選的短期試驗如下：基因突變試驗：鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(Ames試驗)，培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞TK或HPRT正向突變試驗；染色體畸變試驗：體外細(xì)胞系細(xì)胞遺傳學(xué)分析，小鼠骨髓微核試驗，大鼠骨髓染色體畸變試驗；原發(fā)性DNA損傷：DNA加合物，鏈斷裂，DNA修復(fù)誘導(dǎo)(細(xì)菌SOS反應(yīng)，大鼠肝UDS誘導(dǎo))，SCE試驗；體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化：敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞，Balbc 3T3細(xì)胞。 哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗是體外試驗，是一種遺傳毒理學(xué)試驗。在第六章中介紹的遺傳毒理學(xué)試驗的遺傳學(xué)終點為基因突變、染色體畸變、DNA原發(fā)性損傷和非整

53、倍體，而體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化則是另一個重要的遺傳學(xué)終點。 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化是一個多階段的過程，具有體內(nèi)致癌過程的某些特點，最終產(chǎn)生在形態(tài)學(xué)、生長方式和生物化學(xué)上發(fā)生改變的細(xì)胞克隆。例如，成纖維細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化的表型改變有：在等基因宿主或裸鼠體內(nèi)形成腫瘤；細(xì)胞的估計壽命無限長(永生化)；核型改變；細(xì)胞形態(tài)改變；生長雜亂；失去錨基依賴性生長特性，可在軟瓊脂中形成集落；能在低血清培養(yǎng)液生長；丟失某些表面蛋白；具有纖維蛋白溶解活性；可為刀豆球蛋白A及麥胚芽酯酶凝集；在半固體培養(yǎng)基中集落形成；細(xì)胞表面微絨毛增加等。其中最重要的特征是在敏感宿主中的成瘤性，在半固體培養(yǎng)基中形成集落及細(xì)胞交叉重疊、成雜亂生長。目前，還特別著重發(fā)展上皮細(xì)胞特別是在人體上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化試驗。體外轉(zhuǎn)化試驗的終點仍屬形態(tài)轉(zhuǎn)化或惡性前期轉(zhuǎn)化，此種轉(zhuǎn)化可能發(fā)展為真正的腫瘤，也可能停滯在此階段，不進(jìn)一步惡化。因此對體外轉(zhuǎn)化試驗陽性結(jié)果的解釋應(yīng)慎重，陽性結(jié)果僅提示受試物有致癌可能性。二、哺乳動物短期致癌試驗 哺乳動物短期致癌試驗又稱為有限體內(nèi)試驗，指時間有限(數(shù)月)，靶器官有限。較受重視的短期致