Lecture 4 culture media

1、Lecture 4. Culture media培養(yǎng)基培養(yǎng)基 定義：定義：是提供微生物生長繁殖和生物合成各是提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物的所需要的，按一定比例配制的種代謝產(chǎn)物的所需要的，按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物，提供微生物所需能多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物，提供微生物所需能量，包括碳源、氮源、無機(jī)元素、生長因子量，包括碳源、氮源、無機(jī)元素、生長因子及水、氧氣等。及水、氧氣等。 培養(yǎng)基的類型培養(yǎng)基的類型 按營養(yǎng)物質(zhì)來源劃分按營養(yǎng)物質(zhì)來源劃分 天然：天然：是采用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分還不是采用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分還不恒定的各種動植物和動物組織或微生物的浸出物、恒定的各種動

2、植物和動物組織或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì)制成的水解液等物質(zhì)制成的 合成：合成：用化學(xué)成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制的用化學(xué)成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制的 半合成培養(yǎng)基：半合成培養(yǎng)基：采用一部分天然有機(jī)物作碳源、采用一部分天然有機(jī)物作碳源、氮源和生長因子的來源，再適當(dāng)加入一些化學(xué)藥氮源和生長因子的來源，再適當(dāng)加入一些化學(xué)藥品以補(bǔ)充無機(jī)鹽成分，使其更能充分滿足微生物品以補(bǔ)充無機(jī)鹽成分，使其更能充分滿足微生物對營養(yǎng)的需要對營養(yǎng)的需要 培養(yǎng)基的類型培養(yǎng)基的類型 按物理性狀劃分：按物理性狀劃分： 固體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基：適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也用于有子實(shí)體的真菌類（香

3、菇、白木存，也用于有子實(shí)體的真菌類（香菇、白木耳）的生產(chǎn)耳）的生產(chǎn)培養(yǎng)基的類型培養(yǎng)基的類型 按物理性狀劃分：按物理性狀劃分： 液體：液體：8090%是水，配有可溶性的或不溶是水，配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基養(yǎng)基培養(yǎng)基的類型培養(yǎng)基的類型 按物理性狀劃分：按物理性狀劃分： 半固體：半固體：在液體培養(yǎng)基中加入在液體培養(yǎng)基中加入0.50.8%的的瓊脂，用于鑒定細(xì)菌、觀察細(xì)菌運(yùn)動特征及瓊脂，用于鑒定細(xì)菌、觀察細(xì)菌運(yùn)動特征及噬菌體的效價滴度噬菌體的效價滴度培養(yǎng)基的類型培養(yǎng)基的類型 按用途劃分：按用途劃分： 孢子培養(yǎng)基：孢子培養(yǎng)基：是供菌

4、種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，要求能使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，營養(yǎng)不太豐要求能使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，營養(yǎng)不太豐富，常用的有麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米富，常用的有麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米碎屑培養(yǎng)基、瓊脂斜面培養(yǎng)基碎屑培養(yǎng)基、瓊脂斜面培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌絲體長得粗壯，成為活力強(qiáng)壯的使菌絲體長得粗壯，成為活力強(qiáng)壯的“種子種子”，一般采用營，一般采用營養(yǎng)豐富且完全的培養(yǎng)基養(yǎng)豐富且完全的培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基：供

5、菌體生長、繁殖和合成產(chǎn)物之用，組成除供菌體生長、繁殖和合成產(chǎn)物之用，組成除有菌體生長所必需的元素和化合物之外，還要有合成產(chǎn)物所有菌體生長所必需的元素和化合物之外，還要有合成產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進(jìn)劑等需的特定元素、前體和促進(jìn)劑等發(fā)酵培養(yǎng)基選擇的基本原則發(fā)酵培養(yǎng)基選擇的基本原則 基本原則：基本原則： 必須提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分必須提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分 有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗，即提高單位營養(yǎng)物質(zhì)所有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗，即提高單位營養(yǎng)物質(zhì)所合成產(chǎn)物數(shù)量或最大產(chǎn)率合成產(chǎn)物數(shù)量或最大產(chǎn)率 有利于提高培養(yǎng)基和產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵有利于提高培養(yǎng)基和

6、產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力罐的生產(chǎn)能力 有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期 盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的分離純化盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的分離純化 原料價格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易原料價格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易 所用原料盡可能減少對發(fā)酵過程中通氣攪拌的影響，利所用原料盡可能減少對發(fā)酵過程中通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率，降低能耗于提高氧的利用率，降低能耗 有利于產(chǎn)品的分離純化，盡可能減少產(chǎn)生有利于產(chǎn)品的分離純化，盡可能減少產(chǎn)生“三廢三廢”的物的物質(zhì)質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源 碳源碳源 氮源氮源 無機(jī)鹽

7、及微量元素?zé)o機(jī)鹽及微量元素 水水 生長因子、前體、產(chǎn)物促進(jìn)劑和抑制劑生長因子、前體、產(chǎn)物促進(jìn)劑和抑制劑碳源碳源 為微生物菌種的生長繁殖提供能源和合成菌為微生物菌種的生長繁殖提供能源和合成菌體所必需的碳成分體所必需的碳成分 為合成目的產(chǎn)物提供所需的碳成分為合成目的產(chǎn)物提供所需的碳成分 分為：糖類、油和脂肪、有機(jī)酸、烴和醇類分為：糖類、油和脂肪、有機(jī)酸、烴和醇類糖類糖類 葡萄糖：葡萄糖：最容易利用的碳源最容易利用的碳源糖類糖類 木糖：木糖：？ 糖蜜：糖蜜：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜 淀粉糊精淀粉糊精 玉米、小麥、甘薯、木薯、菊芋、纖維素玉米、小麥、甘薯、木薯、菊芋、纖維素葡萄糖葡萄糖 g

8、lucose DE95-96玉米淀粉玉米淀粉 (30-35%, pH 6.0-6.5, Ca2+ 50 ppm)淀粉酶法水解生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶法水解生產(chǎn)葡萄糖杰能科公司杰能科公司液化液化Liquefaction Thermostable a a-Amylase (105C, 5 min) 淀粉液化液淀粉液化液 DE 10-15糖化糖化Saccharification， Glucoamylase (60C, pH 4.0-4.5, 24-72 h)油和脂肪油和脂肪 油或脂肪被脂肪酶作用，水解為甘油和脂肪酸油或脂肪被脂肪酶作用，水解為甘油和脂肪酸 豆油、菜油、葵花子油、豬油、魚油、棉子油豆油、菜油、

9、葵花子油、豬油、魚油、棉子油l 脂肪代謝需要更多的氧氣，因此發(fā)酵時要供給比糖代謝更多脂肪代謝需要更多的氧氣，因此發(fā)酵時要供給比糖代謝更多的氧，否則脂肪酸的積累及有機(jī)酸的積累，會引起的氧，否則脂肪酸的積累及有機(jī)酸的積累，會引起pH下降。下降。l油脂類比較粘稠微生物采用脂肪作為碳源時，發(fā)酵液易變粘油脂類比較粘稠微生物采用脂肪作為碳源時，發(fā)酵液易變粘稠。（油脂有消泡作用）稠。（油脂有消泡作用）有機(jī)酸有機(jī)酸 乳酸乳酸 檸檬酸檸檬酸 乙酸乙酸 CH3COONa + O2 2CO2 + H2O + NaOH烴和醇類烴和醇類 正烷烴正烷烴 甲醇甲醇 乙醇乙醇氮源氮源 用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物用于構(gòu)成

10、菌體細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物 有機(jī)氮源有機(jī)氮源 無機(jī)氮源，又稱快速氮源無機(jī)氮源，又稱快速氮源有機(jī)氮源有機(jī)氮源 在微生物分泌的蛋白酶作用下，消解成氨在微生物分泌的蛋白酶作用下，消解成氨基酸，被菌體吸收后再進(jìn)一步分解代謝基酸，被菌體吸收后再進(jìn)一步分解代謝 有機(jī)氮源營養(yǎng)豐富，還含有少量的維生素有機(jī)氮源營養(yǎng)豐富，還含有少量的維生素和生長因子和生長因子 花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟玉米漿（玉米漿（CSL） 價廉、玉米淀粉生產(chǎn)中的副產(chǎn)物價廉

11、、玉米淀粉生產(chǎn)中的副產(chǎn)物 營養(yǎng)豐富，固含量在營養(yǎng)豐富，固含量在50%50%，pHpH為為4 4左右左右 注意來源與質(zhì)量注意來源與質(zhì)量無機(jī)氮源無機(jī)氮源 銨鹽、硝酸鹽和氨水等銨鹽、硝酸鹽和氨水等 生理酸性物質(zhì)與生物堿性物質(zhì)生理酸性物質(zhì)與生物堿性物質(zhì) (NH4)2SO4、NaNO3(NH4)2SO4 2NH3 + H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O +NaOH無機(jī)鹽及微量元素?zé)o機(jī)鹽及微量元素 鎂、磷、鈉、鉀、硫、鈣和氯鎂、磷、鈉、鉀、硫、鈣和氯 鈷、銅、鐵、錳、鋅、鉬鈷、銅、鐵、錳、鋅、鉬 MgSO4、NaCl 、NaH2PO4、K2HPO4 TMS：trace metal s

12、olution 無機(jī)鹽成分一般所用的濃度范圍無機(jī)鹽成分一般所用的濃度范圍成分成分濃度濃度g/L成分成分濃度濃度g/LKH2PO4MgSO47H2OKClCaCO3FeSO4 4H2O1.04.00.25 3.00.5 12.05 170.01 0.1ZnSO4 8H2OMnSO4 H2OCuSO4 5H2ONa2MoO4 2H2O0.1 1.00.01 0.10.003 0.010.01 0.1pPATP，磷酸化酶，能促進(jìn)糖代謝。，磷酸化酶，能促進(jìn)糖代謝。 許多許多次級代謝次級代謝過程對磷酸鹽濃度的承受限度比生長繁殖過程低，故過程對磷酸鹽濃度的承受限度比生長繁殖過程低，故必須嚴(yán)格控制。必須嚴(yán)格

13、控制。pS硫存在于細(xì)胞的蛋白質(zhì)中，硫存在于細(xì)胞的蛋白質(zhì)中， 是含硫氨基酸的組分和某些輔酶的活性是含硫氨基酸的組分和某些輔酶的活性基，如輔酶基，如輔酶 A (coenzyme A), 谷胱甘肽等谷胱甘肽等。硫是某些產(chǎn)物如青霉素、頭孢菌素等分子的組成部分，在培養(yǎng)基中硫是某些產(chǎn)物如青霉素、頭孢菌素等分子的組成部分，在培養(yǎng)基中加入加入Na2SO4等含硫化合物作硫源。等含硫化合物作硫源。p Fe 鐵鐵(iron)是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過氧化氫酶的成是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過氧化氫酶的成分，因此鐵是菌體有氧氧化必不可少的元素。分，因此鐵是菌體有氧氧化必不可少的元素。pCl 一些產(chǎn)含氯代謝物如金霉

14、素和灰黃霉素等的發(fā)酵中，除一些產(chǎn)含氯代謝物如金霉素和灰黃霉素等的發(fā)酵中，除天然含有外，通常還需加入天然含有外，通常還需加入0.1%氯化鉀。氯化鉀。 在啤酒生產(chǎn)中，在啤酒生產(chǎn)中，2060mg/ml 的的氯對酶和酵母有一定的氯對酶和酵母有一定的促進(jìn)作用。促進(jìn)作用。 pK，Na，Ca 鈉、鉀離子與維持細(xì)胞的滲透壓有關(guān)。鉀離子是鈉、鉀離子與維持細(xì)胞的滲透壓有關(guān)。鉀離子是許多酶的激活劑，能促進(jìn)糖代謝。許多酶的激活劑，能促進(jìn)糖代謝。 鈣是某些酶鈣是某些酶(如蛋白酶如蛋白酶)的激活劑，還參與細(xì)胞膜的激活劑，還參與細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)。通透性的調(diào)節(jié)。培養(yǎng)基中鈣鹽過多時，容易形成磷酸鈣沉淀。培養(yǎng)基中鈣鹽過多時，容

15、易形成磷酸鈣沉淀。p Zn，Mg，Co，Mn 鋅鋅、鎂鎂、鈷鈷、錳錳等是某些酶的輔基或等是某些酶的輔基或激活劑激活劑。鎂離子還可提高抗。鎂離子還可提高抗生素生產(chǎn)菌對自己所產(chǎn)生抗生素的耐性；鈷既是一些酶的生素生產(chǎn)菌對自己所產(chǎn)生抗生素的耐性；鈷既是一些酶的激活劑激活劑，又是又是VB12的組成元素，發(fā)酵中加入一定量的鈷鹽，能使的組成元素，發(fā)酵中加入一定量的鈷鹽，能使VB12的產(chǎn)的產(chǎn)量提高數(shù)倍。錳對于羧化作用是必需的，糖代謝中許多酶的活性量提高數(shù)倍。錳對于羧化作用是必需的，糖代謝中許多酶的活性都與錳有關(guān)。都與錳有關(guān)。水水 良好的溶劑，溶解營養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)胞的滲透、良好的溶劑，溶解營養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)胞的滲透、分泌

16、、排泄等作用都是以水為媒介，并且分泌、排泄等作用都是以水為媒介，并且水直接參與代謝作用中的許多反應(yīng)水直接參與代謝作用中的許多反應(yīng) 水的比熱高，是熱的良導(dǎo)體，調(diào)節(jié)細(xì)胞的水的比熱高，是熱的良導(dǎo)體，調(diào)節(jié)細(xì)胞的溫度溫度 恒定的水源是發(fā)酵工廠的關(guān)鍵，水源質(zhì)量恒定的水源是發(fā)酵工廠的關(guān)鍵，水源質(zhì)量很重要很重要生長因子生長因子 氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等 有機(jī)氮源是生長因子的重要來源有機(jī)氮源是生長因子的重要來源 玉米漿中生長因子含量豐富玉米漿中生長因子含量豐富前體前體 指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)

17、物分子中去，而生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高卻因加入前體而有較大的提高 青霉素：苯乙酸、苯乙胺青霉素：苯乙酸、苯乙胺在青霉素生產(chǎn)中加入玉米漿，青霉素產(chǎn)量可從在青霉素生產(chǎn)中加入玉米漿，青霉素產(chǎn)量可從20u/mL20u/mL增加到增加到100u/mL100u/mL，研究發(fā)現(xiàn)玉米漿中的苯乙胺被有限結(jié)合到青霉素分子中，從而提高了青研究發(fā)現(xiàn)玉米漿中的苯乙胺被有限結(jié)合到青霉素分子中，從而提高了青霉素霉素G G的產(chǎn)量。的產(chǎn)量。H2CCOHNNOSCOOHCH3CH3H2CCOOH前體一般

18、都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利 如苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加如苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%。前體添加前體添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化，分解等。過多，容易引起揮發(fā)和氧化，分解等。 因此因此，前體在使用過程中，常采用流加方法。前體在使用過程中，常采用流加方法。用法用法：前體普遍采用流加的方法，：前體普遍采用流加的方法， 流加有利于提高前體的轉(zhuǎn)化率。流加有利于提高前體的轉(zhuǎn)化率。發(fā)酵過程中所用的一些前體物質(zhì)發(fā)酵過程中所用的一些前體物質(zhì)產(chǎn)品產(chǎn)品前體前體產(chǎn)品產(chǎn)品前體前體青霉素青霉素G G青霉素青霉素V V金霉素金霉素灰黃霉素灰黃霉素紅霉素紅霉素苯乙

19、酸苯乙酸苯氧乙酸苯氧乙酸氯化物氯化物氯化物氯化物正丙醇正丙醇核黃素核黃素類胡蘿卜素類胡蘿卜素L-L-異亮氨酸異亮氨酸L-L-色氨酸色氨酸L-L-絲氨酸絲氨酸丙酸鹽丙酸鹽- -紫羅酮紫羅酮a a- -氨基丁酸氨基丁酸鄰氨基苯甲酸鄰氨基苯甲酸甘氨酸甘氨酸產(chǎn)物促進(jìn)劑是指那些非細(xì)胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前產(chǎn)物促進(jìn)劑是指那些非細(xì)胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。 產(chǎn)物促進(jìn)劑產(chǎn)物促進(jìn)劑 促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的機(jī)制還不完全清楚，其原因是多方面促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的機(jī)制還不完全清楚，其原因是多方面的（機(jī)理不詳）。的（機(jī)理不詳）。 有些促進(jìn)劑本身是酶的誘導(dǎo)物；

20、有些促進(jìn)劑本身是酶的誘導(dǎo)物； 有些促進(jìn)劑是表面活性劑，可改善細(xì)胞的透性，改善有些促進(jìn)劑是表面活性劑，可改善細(xì)胞的透性，改善 細(xì)胞與氧的接觸從而促進(jìn)酶的分泌與生產(chǎn)；細(xì)胞與氧的接觸從而促進(jìn)酶的分泌與生產(chǎn)； 也有人認(rèn)為表面活性劑對酶的表面失活有保護(hù)作用；也有人認(rèn)為表面活性劑對酶的表面失活有保護(hù)作用； 有些促進(jìn)劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。有些促進(jìn)劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。產(chǎn)物促進(jìn)劑產(chǎn)物促進(jìn)劑抑制劑抑制劑n 抑制劑：在發(fā)酵過程中加入抑制劑會抑制某些代謝途徑的抑制劑：在發(fā)酵過程中加入抑制劑會抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時會使另外一些代謝途徑活躍，從而獲得人們所需進(jìn)行，同時會使另外一些代

21、謝途徑活躍，從而獲得人們所需要的某種產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間物積累起來要的某種產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間物積累起來。 例如：微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油中，例如亞硫酸氫鈉，它與代謝過程中的乙例如：微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油中，例如亞硫酸氫鈉，它與代謝過程中的乙醛生成加成物。醛生成加成物。其它條件其它條件 溫度溫度: :中溫菌、嗜熱菌、嗜冷菌中溫菌、嗜熱菌、嗜冷菌 pHpH:大多為大多為4-94-9，少數(shù)在，少數(shù)在pHpH低于低于2 2或高于或高于1010的的環(huán)境中生長環(huán)境中生長 氧氣氧氣: :專性好氣菌、專性厭氣菌、兼性好氣專性好氣菌、專性厭氣菌、兼性好氣菌或兼性厭氣菌菌或兼性厭氣菌 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)

22、基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 其配方如下：其配方如下： 牛肉膏牛肉膏3g3g，蛋白胨，蛋白胨10g10g，NaCl5gNaCl5g，瓊脂，瓊脂151520g20g，水，水1000mL1000mL，pH 7.0pH 7.07.2(7.2(后調(diào)后調(diào)) )高氏高氏1 1號培養(yǎng)基號培養(yǎng)基 高氏高氏1 1號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基。 其配方如下：其配方如下： 可溶性淀粉可溶性淀粉20g20g，KNOKNO3 3 1g 1g，NaCl

23、NaCl 0.5g 0.5g，K K2 2HPOHPO4 43H3H2 2O 0.5gO 0.5g，MgSOMgSO4 47H7H2 2O 0.5gO 0.5g，F(xiàn)eSOFeSO4 47H7H2 2O 0.01gO 0.01g，瓊脂，瓊脂151520g20g，水，水1000mL1000mL，pH7.4pH7.47.67.6。 查氏合成培養(yǎng)基查氏合成培養(yǎng)基 查氏合成培養(yǎng)基是用來分類和培養(yǎng)霉菌的查氏合成培養(yǎng)基是用來分類和培養(yǎng)霉菌的培養(yǎng)基培養(yǎng)基 其配方如下：其配方如下： NaNO3 3g,K2HPO4 1g, KCl 0.5g, MgSO4.7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖蔗糖 30

24、g, H2O 1000ml,pH自然自然麥芽汁培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基 用來培養(yǎng)酵母菌用來培養(yǎng)酵母菌, ,干麥芽粉加干麥芽粉加4 4倍水倍水, ,在在50-50-6060保溫糖化保溫糖化3-43-4小時，用碘液試驗(yàn)檢查至小時，用碘液試驗(yàn)檢查至糖化完全為止糖化完全為止, ,調(diào)整糖液濃度調(diào)整糖液濃度, ,煮沸后，過煮沸后，過濾，調(diào)濾，調(diào)pHpH為為6.06.0。LB培養(yǎng)基培養(yǎng)基 胰蛋白胨胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L 酵母提取物酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化鈉氯化鈉(NaCl) 5g/L 另外根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值用另外根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值用NaOH調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH,使其達(dá)

25、到使其達(dá)到7.4(該該pH適合目前使用最廣的適合目前使用最廣的原核表達(dá)菌種原核表達(dá)菌種E.coli的生長的生長) Fed-batch culture of Pseudomonas putida for MCL-PHA production Strain: Pseudomonas putida KT2442 Medium: MR-1 medium The MR-1 medium contains per liter: 22 g KH2PO4, 3.0 g (NH4)2HPO4, 1.4 g MgSO47H2O, 0.8 g citric acid, 10 ml trace metal solut

26、ion. The trace metal solution contained per L of 5 M HCl: 10.0 g FeSO47H2O, 2.0 g CaCl2, 2.2 g ZnSO47H2O, 0.5 g MnSO44H2O, 1.0 g CuSO45H2O, 0.1 g (NH4)Mo7O244H2O and 0.02 g Na2B4O710H2O. Fed-batch cultivation Seed culture MR-1 medium plus 10 g/L oleic acid（油酸）（油酸） 30 oC, 250 rpm Fed-batch culture 6.

27、6 L jar fermenter (Bioflo 3000, New Brunswick) initial medium: 1.4 L of MR-1 medium + 15 g/L of oleic acid pH 7.0 controlled by adding 28% of ammonia water DOC: controlled as desired 30% of air saturation until the cell mass of 120 g/L, and at 10% afterwards Feeding solution:oleic acid and 250 g/L M

28、gSO47H2O solution 目的明確目的明確 何菌？何菌？ 何產(chǎn)物？何產(chǎn)物？ 何種規(guī)模？何種規(guī)模？細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基放線菌：高氏一號培養(yǎng)基放線菌：高氏一號培養(yǎng)基酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基霉菌：查氏培養(yǎng)基霉菌：查氏培養(yǎng)基主流代謝主流代謝支流代謝支流代謝實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)基的設(shè)計中應(yīng)注意的基本問題培養(yǎng)基的設(shè)計中應(yīng)注意的基本問題營養(yǎng)協(xié)調(diào)營養(yǎng)協(xié)調(diào)H2O C N P、S Mn、Co 生長因子生長因子1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 培養(yǎng)基的設(shè)計中應(yīng)注意的基本問題培養(yǎng)基的設(shè)計中應(yīng)注意的基本

29、問題培養(yǎng)基的設(shè)計中應(yīng)注意的基本問題培養(yǎng)基的設(shè)計中應(yīng)注意的基本問題 合適的合適的C/NC/N比例比例 氮源過多，會使菌體生長過于旺盛，容易形成較高的氮源過多，會使菌體生長過于旺盛，容易形成較高的pHpH，不利于代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足，菌體量少，不利于代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足，菌體量少，也影響產(chǎn)量。也影響產(chǎn)量。 碳源過多，容易形成較低的碳源過多，容易形成較低的pHpH；若碳源不足則容易引；若碳源不足則容易引起菌體的衰老和自溶。起菌體的衰老和自溶。 種子培養(yǎng)基中種子培養(yǎng)基中C/NC/N低，而發(fā)酵培養(yǎng)基中低，而發(fā)酵培養(yǎng)基中C/NC/N高。高。(1)控制控制pH值值 細(xì)菌：細(xì)菌： 7.07.5 放線菌

30、：放線菌： 7.07.5 霉菌：霉菌： 4.05.8 酵母菌：酵母菌： 4.05.8 物理化學(xué)條件適宜物理化學(xué)條件適宜(2)培養(yǎng)基培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)方式值調(diào)節(jié)方式 緩沖液緩沖液內(nèi)源性內(nèi)源性 備用堿備用堿 : CaCO3 外加調(diào)節(jié)：直接加酸、堿外加調(diào)節(jié)：直接加酸、堿(工業(yè)適用工業(yè)適用)KH2PO4K2HPO4(3)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)O2和和CO2濃度濃度好氧菌：空氣、通氣好氧菌：空氣、通氣厭氧菌：加入還原劑等厭氧菌：加入還原劑等培養(yǎng)基的設(shè)計中應(yīng)注意的基本問題培養(yǎng)基的設(shè)計中應(yīng)注意的基本問題培養(yǎng)基的設(shè)計中應(yīng)注意的基本問題培養(yǎng)基的設(shè)計中應(yīng)注意的基本問題 原材料的質(zhì)量原材料的質(zhì)量：穩(wěn)定性，原材料的產(chǎn)地、：穩(wěn)定性，原

31、材料的產(chǎn)地、批次與加工處理方法批次與加工處理方法 原材料的預(yù)處理：原材料的預(yù)處理：谷物或山芋等農(nóng)產(chǎn)品，谷物或山芋等農(nóng)產(chǎn)品，要去皮、去雜物；糖蜜各含大量無機(jī)鹽，要去皮、去雜物；糖蜜各含大量無機(jī)鹽，要去鹽；鐵罐。要去鹽；鐵罐。培養(yǎng)基的設(shè)計中應(yīng)注意的基本問題培養(yǎng)基的設(shè)計中應(yīng)注意的基本問題 發(fā)酵液性的影響發(fā)酵液性的影響 大規(guī)模發(fā)酵時，淀粉濃度過高會使發(fā)酵液大規(guī)模發(fā)酵時，淀粉濃度過高會使發(fā)酵液粘稠，溶氧不足粘稠，溶氧不足l滅菌滅菌 氨基酸氨基酸 維生素避免滅菌維生素避免滅菌 碳源與氮源常分開滅菌碳源與氮源常分開滅菌 沉淀沉淀 培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)基優(yōu)化 目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計算出適目前還

32、不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方。合某一菌種的培養(yǎng)基配方。 只能用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等的基本理論，只能用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等的基本理論，參照他人所使用的比較適合某一類菌種、某一類產(chǎn)品發(fā)酵參照他人所使用的比較適合某一類菌種、某一類產(chǎn)品發(fā)酵的的經(jīng)驗(yàn)配方。經(jīng)驗(yàn)配方。 采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計和實(shí)驗(yàn)方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。和實(shí)驗(yàn)方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的設(shè)計與確定方法培養(yǎng)基的設(shè)計與確定方法 首先根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定可能的培養(yǎng)基成分（書首先根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定可能的培養(yǎng)基成

33、分（書籍與文獻(xiàn)閱讀）籍與文獻(xiàn)閱讀） 通過單因子實(shí)驗(yàn)確定最為適宜的培養(yǎng)基成通過單因子實(shí)驗(yàn)確定最為適宜的培養(yǎng)基成分與濃度范圍分與濃度范圍 培養(yǎng)基成分很多，采用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計方培養(yǎng)基成分很多，采用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計方法優(yōu)化培養(yǎng)基成分：正交實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面分法優(yōu)化培養(yǎng)基成分：正交實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面分析法析法正交正交實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)均勻均勻設(shè)計設(shè)計神經(jīng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò)其他其他方法方法聚類聚類分析分析響應(yīng)面響應(yīng)面分析分析單因子單因子實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)成本成本發(fā)酵單位發(fā)酵單位方法方法結(jié)果結(jié)果 培養(yǎng)基優(yōu)化的基本方法培養(yǎng)基優(yōu)化的基本方法例：酵母產(chǎn)例：酵母產(chǎn)-氨基丁酸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化氨基丁酸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，11（

34、3）：）：482-484- 氨基丁酸（GABA）是人體和動植物生命活動中一種非常重要的非蛋白質(zhì)氨基酸。植物抵御逆境脅迫反應(yīng)及對病、蟲害有保衛(wèi)反應(yīng)等過程都涉及GABA 的參與。GABA 作為動物中樞的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，不僅具有鎮(zhèn)靜、降血壓、抗驚厥等生理作用，在非神經(jīng)的組織中還能發(fā)揮激素或營養(yǎng)因子的功能，對 動 物 機(jī) 體 正 常 的 生 理 功 能 起 著 重 要 的 調(diào) 節(jié) 作 用 。本實(shí)驗(yàn)以高產(chǎn)GABA的酵母突變株為材料，采用單因素和正交設(shè)計實(shí)驗(yàn)對菌株產(chǎn)- 氨基丁酸的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，以期提高GABA的產(chǎn)率。碳源選擇碳源選擇有機(jī)氮源的選擇有機(jī)氮源的選擇無機(jī)氮源的選擇無機(jī)氮源的選擇無機(jī)鹽無機(jī)鹽正

35、交試驗(yàn)設(shè)計（正交試驗(yàn)設(shè)計（L9(3L9(34 4) )極差分析結(jié)果表明（表極差分析結(jié)果表明（表7），四個因素對發(fā)酵液中），四個因素對發(fā)酵液中GABA 含量的影響是含量的影響是A B C D , 即培養(yǎng)基中碳源量對即培養(yǎng)基中碳源量對GABA 的生成影響最顯著的生成影響最顯著,蛋白胨次之蛋白胨次之, 硫酸銨和硫酸銨和KH2PO4影響程度相差不大。由表可知四個因素的最佳組合為影響程度相差不大。由表可知四個因素的最佳組合為A2B2C3D1。在最。在最佳培養(yǎng)基配方條件下連續(xù)佳培養(yǎng)基配方條件下連續(xù)3次發(fā)酵，次發(fā)酵，-氨基丁酸含量可達(dá)氨基丁酸含量可達(dá)1.690g.L-1。例：響應(yīng)面法優(yōu)化丁二酸生產(chǎn)培養(yǎng)基例：

36、響應(yīng)面法優(yōu)化丁二酸生產(chǎn)培養(yǎng)基表表3-4 N=12的的PlackettBurman實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果果表表3-3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因子水平及編碼實(shí)驗(yàn)因子水平及編碼序序號號X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11SA(gL-1)11-11-1-1-1111-1157.46211-11-1-1-1111-158.433-111-11-1-1-111156.4641-111-11-1-1-11157.70511-111-11-1-1-1157.676111-111-11-1-1-158.747-1111-111-11-1-156.068-1-1111-111-11-155.189-1-1-1111-111-1154.41101-1-1-1111-111-157.4811-11-1-1-1111-11155.1212-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-154.02序號序號變量變量符號符號編碼水平編碼水平-111葡萄糖葡萄糖X170802酵母膏酵母膏 X27.5103玉米漿玉米漿X310154MgCO3X456645 乙酸鈉乙酸鈉 X501.56K2HPO4 X6037NaH2PO4X701.68NaCl