淺談基質(zhì)效應(yīng)

1、淺談基質(zhì)效應(yīng)n基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的原因和影響n基質(zhì)效應(yīng)的確認方法n基質(zhì)效應(yīng)的消除淺談基質(zhì)效應(yīng)淺談基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生原因基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生原因基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生原因基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生原因n所謂基質(zhì)，指標本中除分析物以外的一切組成。以測定血中紅霉素的濃度為例，除了紅霉素之外的蛋白、磷脂及其他內(nèi)源性物質(zhì)皆為基質(zhì)?；|(zhì)效應(yīng)，按美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）文件的定義為標本中除分析物以外的其他成分對分析物測定值的影響；基質(zhì)對分析方法準確測定分析物的能力的干擾。廣義說來，基質(zhì)效應(yīng)也應(yīng)包括已知的干擾物（如紅霉素測定中磷脂、血紅蛋白、抗壞血酸等都是干擾物），但目前只將基質(zhì)效應(yīng)限于生物材料中未知或未定性的物質(zhì)或因素

2、（如粘度、pH等）的影響。基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生原因基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生原因n主要針對使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析生物樣品中的化合物所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)進行討論。n而在生物樣品（以血漿為例）中，引起基質(zhì)效應(yīng)的主要是磷脂、膽固醇等內(nèi)源性物質(zhì)。他們隨同待測物從色譜柱上一起被洗脫出來，經(jīng)離子源氣化，進入質(zhì)譜進行檢測分析。而就在液滴氣化、發(fā)生庫倫爆炸變成小液滴直至產(chǎn)生氣體離子的過程中，這些內(nèi)源性的物質(zhì)由于極性較大，會同待測物離子競相競爭液滴表面，從而導(dǎo)致待測物的離子化效率降低或增強，引起響應(yīng)降低或增高，這就產(chǎn)生所謂的基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強效應(yīng)。n根本原因是什么？n基質(zhì)效應(yīng)會產(chǎn)生哪些不好的影響基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生原因基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)

3、生原因n標準曲線法n柱后灌注法n監(jiān)控法基質(zhì)效應(yīng)的確認方法基質(zhì)效應(yīng)的確認方法n樣品配制方法：配制三種不同的標準曲線（每條標準曲線7個點，每一種配制方法五樣本）1、藥物+內(nèi)標：用流動相稀釋到一定濃度2、藥物+內(nèi)標：用含有5種不同來源的空白生物樣品的流動相稀釋3、正常配制的生物樣品標準曲線法標準曲線法n評價方法：通過比較3組標準曲線待測組分的絕對響應(yīng)值、待測組分與內(nèi)標的響應(yīng)值比值和標準曲線的斜率，可以確定基質(zhì)效應(yīng)對定量的影響。標準曲線法標準曲線法絕對響應(yīng)值比較n第1組測定結(jié)果可評價色譜系統(tǒng)和檢測器的性能以及整個系統(tǒng)的重現(xiàn)性。n第2組測定結(jié)果同第1組測定結(jié)果相比，若待測組分響應(yīng)值的相對標準偏差明顯增加

4、，表明存在基質(zhì)效應(yīng)的影響。n第3組測定結(jié)果，若待測組分響應(yīng)值的相對標準偏差明顯增加，表明存在基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率因血漿來源不同而不同的共同影響。標準曲線法標準曲線法絕對響應(yīng)值比較n如果將第1組、第2組和第3組測得的相應(yīng)的響應(yīng)值分別用A、B、C表示，可按下列公式分別計算基質(zhì)效應(yīng)(ME)，提取回收率(RE)和方法效率(PE)：nME( )=BA100 (1)nRE()=CB100 (2)nPE()=CA100=(MERE)100 (3)n公式(1)計算得到的ME為絕對基質(zhì)效應(yīng)。相對基質(zhì)效應(yīng)通過對不同來源樣品間的B值進行比較獲得。當ME值等于或接近100時，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)的影響；當ME值大于10

5、0時，表明存在離子增強作用；當ME值小于100時，表明存在離子抑制作用。標準曲線法標準曲線法n待測組分與內(nèi)標的響應(yīng)值比值和標準曲線的斜率nStandard line slopes as a measure of a relative matrix effecting quantitative HPLCMS bioanalysisnThe results of these studies indicated that the variability of standard line slopes in different lots of a bio fluid precision of stan

6、dard line slopes expressed as coefficient of variation, CV (%) may serve as a good indicator of a relative matrix effect and, it is suggested, this precision value should not exceed 34% for the method to be considered reliable and free from the relative matrix effect liability.標準曲線法標準曲線法n另外，有學(xué)者建議使用低

7、、中、高三濃度的質(zhì)量控制樣品（QC）來評價基質(zhì)效應(yīng)的大??；有人建議使用定量下限（LLOQ）水平的6個個體的基質(zhì)來評價。標準曲線法標準曲線法n將空白生物樣品的提取液和空白溶劑分別進樣進行液質(zhì)分析，同時利用注射泵將含相同濃度待測物的標準溶液通過色譜柱與質(zhì)譜接口之間的三通注入到色譜柱流出液中。如果同空白溶劑的萃取離子圖譜相比，空白提取液的萃取離子圖譜的響應(yīng)信號明顯減弱或增強，則表明存在基質(zhì)效應(yīng)的影響。柱后灌注法柱后灌注法(Post-column infusion method) 柱后灌注法柱后灌注法n樣品配制：分別用液液萃?。ㄕ和?異丙醇）、固相萃取、沉淀蛋白（乙腈沉淀和高氯酸沉淀）1、正常配制空

8、白樣品2、用水代替血漿配制樣品3、流動相柱后灌注法柱后灌注法液液萃取ESI固相萃取乙腈沉淀高氯酸沉淀液液萃取固相萃取乙腈沉淀高氯酸沉淀APCIn由于基質(zhì)效應(yīng)是無法監(jiān)測的，所以消除困難。如果能夠用一種物質(zhì)代表基質(zhì)效應(yīng)，那么我們就能夠直觀的看到基質(zhì)的具體保留行為，從而分離基質(zhì)與待測物，消除基質(zhì)效應(yīng)。監(jiān)控法監(jiān)控法nSystematic and comprehensive strategy for reducing matrix effects in LC/MS/MS analysesErin Chambers , Diane M. Wagrowski-Diehl, Ziling Lu, Jeffre

9、y R. Mazzeo監(jiān)控法監(jiān)控法nInourstudies,weevaluateseveralsamplepreparationmethods,includingproteinprecipitation(PPT),liquidliquidextraction(LLE),silica-basedsolid-phaseextraction(SPE)andpolymericSPE.Becauseendogenouphospholipidshavebeenidentifiedasamajorsourceofmatrixeffectsbymultipleresearchers,wemonitorthe

10、levelsofthevariousphospholipidsinthesamplestocomparerelativecleanlinessoffinalplasmaextracts.監(jiān)控法監(jiān)控法監(jiān)控法監(jiān)控法n選擇合適的樣品制備方法n優(yōu)化色譜條件n質(zhì)譜條件的選擇n內(nèi)標物的選擇基質(zhì)效應(yīng)消除基質(zhì)效應(yīng)消除選擇合適的樣品制備方法選擇合適的樣品制備方法總體來講，基質(zhì)效應(yīng)是與生物樣品處理不干凈密切相關(guān)的。我們可以通過稀釋處理后的溶液或者降低進樣量，來降低基質(zhì)效應(yīng)對測定的影響，但這是治標不治本，背景噪音在降低的同時，待測物的響應(yīng)也降低，對改善我們的測定靈敏度沒有太大好處。其實，更為關(guān)鍵的是選擇合適樣品前處

11、理方法。基質(zhì)效應(yīng)消除基質(zhì)效應(yīng)消除基質(zhì)效應(yīng)消除基質(zhì)效應(yīng)消除n我們在生物分析中主要用到沉淀蛋白法（PPT）、液液提取法（LLE）和固相萃取法（SPE）。PPT適應(yīng)于絕大多數(shù)化合物，對蛋白結(jié)合率的高低沒有要求，操作步驟相對簡捷，缺點就是處理后的樣品不是很干凈，內(nèi)源性物質(zhì)較多，從而產(chǎn)生較強的基質(zhì)效應(yīng)；LLE適于極性相對小、蛋白結(jié)合率低的化合物，提取步驟相對繁瑣，但處理后的樣品尤為潔凈；而SPE根據(jù)填料的不同，適于分析的化合物的種類也有所差別，目前市面上有SPE小柱和SPE 96-well板，該方法特點是樣品處理后干凈，操作裝置簡單，絕大數(shù)的內(nèi)源性物質(zhì)被去除，使待測物濃縮，提高檢測的靈敏度。優(yōu)化色譜條件

12、優(yōu)化色譜條件n基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生，是由于內(nèi)源性物質(zhì)與待測物一同流出色譜柱，從而產(chǎn)生競爭抑制引起的。優(yōu)化色譜條件，改變內(nèi)源性物質(zhì)與待測物在色譜柱上的保留時間，使其流出的速度不同，從而進入質(zhì)譜的時間不同，這樣就可以去除或降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。比如待測物易離子化，那么調(diào)節(jié)樣品或溶液中的pH值，會對它的保留、選擇性和靈敏度產(chǎn)生很大的影響。n如果有切換閥，最好把樣品峰出峰前一分鐘之前的都切換調(diào)。基質(zhì)效應(yīng)消除基質(zhì)效應(yīng)消除請看下面兩圖，色譜條件優(yōu)化前 基質(zhì)效應(yīng)消除基質(zhì)效應(yīng)消除色譜條件優(yōu)化后 基質(zhì)效應(yīng)消除基質(zhì)效應(yīng)消除n從優(yōu)化后的色譜圖中，可以看出在4.2min左右有部分內(nèi)源性物質(zhì)的小峰出現(xiàn)，這說明如果化合物在這時候

13、被洗脫下來，那么內(nèi)源性物質(zhì)就會一同下來，同時進入離子源，從而產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。為了避免這個問題，我們優(yōu)化了色譜條件，將洗脫程序變緩，使內(nèi)源性物質(zhì)和待測得化合物分開，這樣就減小了基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)消除基質(zhì)效應(yīng)消除質(zhì)譜條件的選擇質(zhì)譜條件的選擇n眾所周知，基質(zhì)效應(yīng)在液質(zhì)檢測中有所體現(xiàn)，但在液相-紫外檢測中卻沒有，這跟它們檢測的原理是相關(guān)的。在液質(zhì)分析中，我們經(jīng)常使用的是電噴霧離子源（ESI）和大氣壓化學(xué)電離源（APCI）。ESI源由于其電離原理是液相離子化，內(nèi)源性物質(zhì)與待測物競相競爭液滴表面，從而基質(zhì)效應(yīng)比較明顯。所以我們在實際應(yīng)用中，如果遇到使用ESI源基質(zhì)效應(yīng)較大，可以考慮換用APCI源嘗試一下，看

14、看響應(yīng)是否能夠滿足要求，基質(zhì)效應(yīng)是否有所降低。n同時，我們還可以考察一下正離子檢測模式和負離子檢測模式下基質(zhì)效應(yīng)的大小，一般情況下，負離子的背景噪音要低于正離子的?；|(zhì)效應(yīng)消除基質(zhì)效應(yīng)消除內(nèi)標物的選擇內(nèi)標物的選擇n在生物分析中，由于樣品處理過程復(fù)雜，為了保證其操作的準確性，要使用內(nèi)標來校正操作的誤差。內(nèi)標的選擇，主要從同位素標記物和待測物的同系物里尋找。實際上，同位素標記物是最為理想的內(nèi)標物，它與待測物的化學(xué)性質(zhì)極為相似，基質(zhì)效應(yīng)、操作中的環(huán)境變化等對他們的影響也一致，這樣就可以出去基質(zhì)效應(yīng)的影響。但是由于同位素標記物價格昂貴，而且不易獲得，使這種優(yōu)越性大打折扣，在不得已的條件下，還需要選擇同系物來做為