抗氧化酶活性等測(cè)定方法

1、葉綠體的提取一、試劑配置1、PBS 提取液：每 L 水依次加入 MES（195.2 X 0.05=9.76g）、山梨糖醇（0.33 X 182.2=60.126g）、NaCI（0.010 X 58.5=0.585g ）、MgCI（0.002 X 95=0.19g ）、EDT（ 292.25 X 0.002=0.5845g ）、KHPQ（ 200 X 0.0005=0.1g ）; 使用時(shí)加入 ASA-Na（198.1 X0.002=0.3962g ） ;2、 懸浮液：將 PBS提取液中的 MES換為 238.3 X 0.05=11.915g 的 HEPES（238.3 X 0.05=11.915

2、g ）;3、80%PercoI ： 80mI 原液 +20mI 水； 40%PercoI ： 40mI 原液 +60mI 水；實(shí)際配制：PBS提取液2000ml（3個(gè)處理*2個(gè)品種*3個(gè)重復(fù)*20mI*3次=1080mI）,懸浮液100ml （3個(gè)處理*2個(gè)品種*3個(gè)重復(fù)*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（ 3 個(gè)處理 *2 個(gè)品種 *3 個(gè)重復(fù) *3ml*3 次=162ml）二、提取步驟1、 10g 鮮樣加 20ml 提取 PBS（50mM MES PH6.1 含 0.33M 山梨糖醇，10mM NaCl, 2mM MgC2, 2m

3、M EDTA0.5 mMKHPQ, 2mM ASA-Na ASA-Na使用前現(xiàn)配現(xiàn)加）2、 快速研磨，使葉片碎成綠豆粒大小，4 層紗布過濾，去除殘?jiān)ㄗ⒁膺^濾時(shí)不可用力擠壓，以免葉綠體 膜破碎）3、 濾液2000g 3min,小心倒出上清液，將離心管放入離心機(jī)后，使離心機(jī)的加速很快上升到預(yù)定值（水平 轉(zhuǎn)頭，加速度調(diào)到 9），約經(jīng) 30s 后很快使其下降停止，整個(gè)離心持續(xù)大約 2-3min 左右完成；4、沉淀用 1ml 提取液漂洗表面懸浮物；5、 用 1ml 懸浮液（50mMHEPESpH7.6 ,含 0.33 mM山梨糖醇，10mMNaCl, 2mMMgCl2, 2mMEDTA 0.5 mMK

4、HPQ,2mMASA-Na ASA-Na使用前現(xiàn)配現(xiàn)加）將沉淀懸浮，在分散葉綠體時(shí)宜用毛筆輕輕刷，或者用手握住離心 管在冰塊之間攪動(dòng) 使葉綠體由于震動(dòng)分散開來 不要用棉球吸濾 以防被膜壓破。 葉綠體懸浮時(shí)要濃點(diǎn) 含葉綠素 2mg.ml-1 以上，這樣有利于保持活性。6、2000g 1min;7、沉淀再用懸浮液懸浮 ;（ 懸浮液同 5，可以不做 ）8、用 Percol 試劑進(jìn)行梯度離心（將 3ml 含有 80%Percol （原液按 100%算）鋪在 10ml 離心管下層，再把3ml 40%Percol 鋪在離心管中層，然后將 1ml 葉綠體懸浮液輕輕鋪在離心管上層） 1500g 2-3min

5、（用水平 離心頭的離心機(jī)，離心機(jī)加速要緩慢上升，加速度調(diào)到1 ） ，下降也要緩慢下降，否則會(huì)破碎 Percol 的濃度梯度層的形成， 取出會(huì)看到 3層綠色帶，最上層為破碎的葉綠體， 沉在地層的為粗顆粒， 40-80%的 Percol 之間的界面有一層綠色層為完整的葉綠體 ;9、 小心吸出，轉(zhuǎn)移到懸浮介質(zhì)中，使葉綠體濃度達(dá)到1mg.ml-1;（計(jì)算：取葉綠體懸浮液 0.1ml，加4.9 ml 80%勺丙酮，搖勻后于1000g離心2min，上清液置于1cm的比色杯，在625nm上比色，按照公式計(jì)算：0匡聞 X 50/34.5= 葉綠素 mg/ml）10、 測(cè)定葉綠體的完整性,完整率達(dá)到85-95%

6、；參考： Takeda K, Qtaubo T,Konda N. Participation of hydrogen peroxide in the inactivation of Calvin-cycle SHenzyme in so2-furmugated spinach leaves. Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018.取上述制備的完整葉綠體進(jìn)行如下測(cè)定：1、用50mM PBS（保護(hù)酶或其他測(cè)定項(xiàng)目的緩沖液）稀釋 2-5倍，用于測(cè)定 SOD POD CAT APX2、 用冷丙酮稀釋2倍，取0.5ML提取液用于測(cè)定 H2Q;（本試驗(yàn)中用

7、0.2 mol/L HCIO 4稀釋）3、用5%勺TCA稀釋2-5倍，取1.5ml用于測(cè)定 MDA4、用乙醇：丙酮：水 =4.5：4.5：1 稀釋，用于測(cè)定葉綠素;抗氧化酶（SOD POD CAT APX活性測(cè)定方法一、超氧化物歧化酶（SOD活性測(cè)定（氮藍(lán)四唑光化還原法）1 、試劑的配制（ 1 ） 0.05mol/L 磷酸緩沖液 （PBS， pH7.8） ：A母液：0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液：取NstHPO 12H2O （分子量358.14 ） 71.7g ;B母液：0.2mol/L 磷酸二氫鈉溶液：取 NaHPQ 2HzO （分子量156.01 ） 31.2g。分別用蒸餾水定容到 10

8、00ml。0.05mol/L PBS（ pH7.8 ）的配制：分別取 A 母液（NazHPO） 228.75ml , B 母液（NafPQ） 21.25ml，用蒸 餾水定容至 1000ml。參考文獻(xiàn)：李合生主編：植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù).高等教育出版社，2000： 267268。（2） 14.5mM甲硫氨酸溶液：取 2.1637g Met用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至1000ml。（3） 30卩M EDTA-Na溶液：取 0.001gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至 100ml。（4） 60卩M核黃素溶液：取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。（5）2.25mM氮

9、藍(lán)四唑（NBT）溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。（上述試劑先配好，放到4度冰箱，用之前臨時(shí)按下面的方法配，然后放在4度冰箱中，不要在最上層，避免見光，第一組樣品加好后拿出來加，加完后放回冰箱，第二組的樣品加好后再拿出來加）酶液制備：取0.2g （可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，加入1.6ml50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在 4C、12000g下離心20min， 上清液即為酶液。2、酶活性測(cè)定（1） 反應(yīng)混合液配制（以60個(gè)樣為準(zhǔn)）：分別取Met溶液162ml，EDTA-Na溶液0.6m

10、l （加的量和前面 的濃度要核對(duì)），磷酸緩沖液5.4ml，NBT溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后搖勻；SOD反應(yīng)混合液：3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*3ml*3次測(cè)定=162ml（實(shí)際配置200ml）（2） 分別取3ml反應(yīng)混合液和30卩l(xiāng) （可視情況調(diào)整，最好先做一個(gè)濃度梯度，看加多少合適，如果 量太少，最好稀釋后再加，這樣精確）酶液于試管中（盡可能加到試管的底部，要靠著試管壁打下去先加 酶液，后加反應(yīng)液，加好后搖一搖，看看試管上是不是有霧氣，最好拿紗布把試管下邊擦一下，免得霧氣 擋住光線照過去） ;（3） 將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux光照下反應(yīng)20min ;（照光很重要，試

11、管要選擇相同規(guī)格的， 因?yàn)椴煌脑嚬芡腹饴适遣灰粯拥?，試管架不要選擇遮光的，這個(gè)最好分組做，同時(shí)幾組做相互之間會(huì)遮 光，每一組一個(gè)重復(fù)，就是每一組中都要有所有的處理，且都要有一個(gè)最大管，處理多的話，把根和葉分 開做，最大管放在中間）同時(shí)做兩支對(duì)照管，其中1支試管取3ml反應(yīng)混合液加入30卩I PBS （不加酶液）照光后測(cè)定作為最大光還原管，另 1 支只加緩沖液置于暗中測(cè)定時(shí)用于調(diào)零。（4） 以不照光的對(duì)照管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光測(cè)OD560（出現(xiàn)顏色即可測(cè)定）。（5） 酶活性計(jì)算：SOD活性單位以抑制 NBT光化還原50%所需酶量（測(cè)的樣品值要在最大管的一半 左右才合適，否則要調(diào)

12、整酶量）為 1 個(gè)酶活單位（ u）。SOD總活性=（A ck-AE ） X V/ （1/2AckX W Vt）SOD比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（ u/g FW）;比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對(duì)照管的吸光度；A為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml,1.6ml，加入PBS的體積）;Vt為測(cè)定時(shí)的酶液 用量（ml, 30ul ）; W為樣品鮮重（g，測(cè)定時(shí)應(yīng)換算為葉綠體的質(zhì)量 mg）；蛋白質(zhì)含量單位為 mg/g。二、POD CATW活性的測(cè)定粗酶液制備同 SOD。1、 過氧化物酶（POD活性測(cè)定（愈創(chuàng)木酚法）（ 1 ）試劑配制：0.2mol

13、/L磷酸緩沖液（pH6.0）:分別取A母液（NazHPO） 123ml和B母液（NafPQ ） 877ml混勻即為1000mlPBS（0.2M， pH6.0） ；（ 2）反應(yīng)混合液配制（以 60 個(gè)樣為準(zhǔn)）：取 200ml PBS（0.2M， pH6.0） ，加入 0.076ml 液體（原液）愈創(chuàng)木酚（ 2-甲氧基酚）加熱攪拌溶解，冷 卻后加入0.112ml 30 %的HQ,混勻后保存于冰箱中備用。POD反應(yīng)混合液：3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*3ml*3 次測(cè)定=162ml（實(shí)際配置 200ml, 0.076ml,0.112ml）（ 3）樣品測(cè)定：取3ml反應(yīng)液并加入30卩l(xiāng)酶液，以PBS為

14、對(duì)照調(diào)零，而后測(cè)定OD470值（測(cè)定40秒）。（邊加樣邊測(cè)定，測(cè)定前等待 5 秒，動(dòng)作要快，如果慢的話，要保證每個(gè)樣品從加好樣到開始記時(shí)的時(shí)間相差不大）（4）酶活性計(jì)算：以每 min OD值變化（升高）0.01為1個(gè)酶活性單位（u）。POD=（A A470X Vt） / （WX VsX 0.01 X t ） （u/g min） A470：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重（g） ； t為反應(yīng)時(shí)間（min） ； Vt為提取酶液總體積（ml, （1.6ml ）； Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（ ml, 30ul ）。2、過氧化氫酶（CAT活性測(cè)定（ 1 ）試劑配制：0.15mol/L 磷酸緩沖液（

15、pH7.0 ）:取 A 母液（NazHPO）457.5 ml 和 B 母液（NafPO） 292.5 ml 混合后 用蒸餾水定容至 1000ml。（2） 反應(yīng)液配制：取 200ml PBS （0.15M , pH7.0 ）,加入0.3092ml 30%的HzQ （原液）搖勻即可。CAT反應(yīng)液：3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*3ml*3次測(cè)定=162ml（實(shí)際配置200 ml, 0.3092ml ）（3） 樣品測(cè)定：取3ml反應(yīng)液加入0.1ml （可視情況調(diào)整） 酶液，以PBS為對(duì)照調(diào)零，測(cè)定OD240（紫 外）（測(cè)定40s ）。（4） 酶活性計(jì)算：以每 min OD值減少0.01為1個(gè)酶活性單位

16、（u）。CAT=A A240X Vt /（W VsX 0.01 X t） （u/g min） A240：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重（g） ; t為反應(yīng)時(shí)間（min） ; Vt為提取酶液總體積（ml,1.6ml ）; Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（ ml, 0.1ml ）。三、抗壞血酸過氧化物酶（APX活性的測(cè)定（緩沖液為K）1、試劑配制（按 50個(gè)樣計(jì)算）：（1）0.05 mol/L K zHPOKWPO緩沖液（pH7.0 ）的配制:（A）&HPO 3H2O: 228.22 X 0.05 X 0.61=6.9607g（B） KHPQ:136.09 X 0.05 X 0.39=2

17、.6538g，以上兩者混合起來用去離子水定容到1L。（2） 0.1 mM EDTA-Na2：取 0.01861g EDTA-Na 2 用 PBS 溶液定容到 500 ml （372.24 g/M X 0.1mMX 500ml=0.01861 g ）;（3） 5 mMAsA：取 0.044g 抗壞血酸用 PBS溶液定容到 50ml （現(xiàn)用現(xiàn)配，176.13g/M5mMX 50ml=0.044 g）;（4） 20mM2O2:取 0.2ml,30%H2Q 用去離子水稀釋到100ml （30% H2Q 為 550gX 30%/（34.01g/M X 0.5L）=9.703M ）。實(shí)際配置0.1 mME

18、DTA-Na：3 個(gè)處理 *2 個(gè)品種 *3 次重復(fù) *1.7ml*3 次測(cè)定=91.8ml;（實(shí)際配置 250 ml,0.009305g ）5 mM的AsA: 3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.1ml*3次測(cè)定=5.4ml;（實(shí)際配置50 ml,0.044g ）20mM HQ: 3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.1ml*3 次測(cè)定=5.4ml;（實(shí)際配置50 ml,0.1ml ）2、酶活性的測(cè)定（以 2 ml體系測(cè)定）（1 ）取 0.10 ml 酶液（可視情況調(diào)整），加入 1.70 ml 含 0.1 mMEDTA-Na> 的 PBS（ 0.05 mol/L , pH7.0）, 再加入0

19、.10 ml 5 mM 的AsA，最后加入 0.10 ml 20mM H 2Q,立即在20C下測(cè)定 D290 （紫外）值在 40s內(nèi)（測(cè)定時(shí)間內(nèi)變化大可測(cè)定的時(shí)間短點(diǎn)，否則長點(diǎn)）的變化，計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)AsA減少量和酶活性（室溫下測(cè)定，緩沖液調(diào)零）。計(jì)算公式： OD/A t X Vr X VTAX dX Vt x W OD為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化（40秒吸光度一0秒吸光度）； t為反應(yīng)時(shí)間（40秒）；Vr為反應(yīng) 液體積（2mL ; VT提取液體積（1.6mL） ; A為消光系數(shù)（2.8mM1.cm-1）; d為比色杯厚度（1cm） ; Vt測(cè)定 液體積（0.1mL） ; W為樣品鮮重（0.2g

20、）。四、超氧陰離子自由基（Q-）產(chǎn)生速率的測(cè)定（羥胺氧化法）1、試劑的配制(1) 1mM鹽酸羥胺溶液：稱取 0.02085g鹽酸羥胺用蒸餾水定容至 300ml;(2) 17mM對(duì)氨基苯磺酸溶液：稱取 1.1776g對(duì)氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液(冰醋酸：水 =1 : 3 配制)加熱溶解后定容至 400ml；(3) 7mMa -萘胺溶液：稱取0.4008g a -萘胺用冰醋酸水溶液 (冰醋酸：水=3: 1配制)定容至400ml。實(shí)際配置PBS( 0.05M, pH7.8) : 3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.5ml*3 次測(cè)定=27ml;(實(shí)際配置100 ml )1mM鹽酸羥胺溶液：3個(gè)處理*

21、2個(gè)品種*3次重復(fù)*1ml*3次測(cè)定=54ml;(實(shí)際配置100 ml,0.00695g ) 17mM寸氨基苯磺酸：3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*1ml*3次測(cè)定=54ml;(實(shí)際配置100 ml,0.2944g ) 7mMa -萘胺溶液： 3 個(gè)處理 *2 個(gè)品種 *3 次重復(fù) *1ml*3 次測(cè)定 =54ml; (實(shí)際配置 100 ml,0.1004g )2、O2.- 含量的測(cè)定(1) 樣品液提取方法同 SOD測(cè)定；(2) 取0.5ml提取液(酶液)(可視情況調(diào)整用量)中加入 0.5ml PBS (0.05M , pH7.8) , 1ml 1mM鹽 酸羥胺溶液后搖勻。(3) 在25C下保溫

22、1小時(shí)；(4) 依次先加入1ml 17mM對(duì)氨基苯磺酸，再加入 1ml 7mM a -萘胺，混合后快速搖勻；(5) 在25C下保溫20min后在3000X g下離心3min后馬上進(jìn)行測(cè)定(或置于冰箱待測(cè));(6) 以對(duì)照管調(diào)零(用水調(diào)零)，取粉紅色水相液測(cè)定 OD530直(測(cè)定);(7) O.-含量的計(jì)算：由測(cè)得的 OD53Q查NO-標(biāo)準(zhǔn)曲線得到NO2-;根據(jù)羥胺與 Q.-的反應(yīng)式：NHOH + 2Q+ H+ NO 2- + H2O2 + HO計(jì)算OJ ，即NO2 X 2=。2-;再根據(jù)樣品與羥胺反應(yīng)的時(shí)間和樣品中 的蛋白質(zhì)含量，求得 O2.- 產(chǎn)生速率(以 nmol min -1mg-1 蛋

23、白表示，也可以 nmol min -1g-1 鮮重表示)。Q.-產(chǎn)生速率=(CX V) / (t X W(nmol min-1g-1 鮮重)C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃度(umol/L) ; V為測(cè)定時(shí)所取提取液用量(葉綠體稀釋后的體積)；t為反應(yīng)時(shí) 間(60min) ; W為樣品鮮重(葉綠體實(shí)際質(zhì)量g)參考文獻(xiàn)：王愛國，羅廣華.植物生理學(xué)通訊，1990, ( 6)： 5557五、可溶性蛋白含量的測(cè)定(考馬斯亮藍(lán)染色法)1、試劑的配制(1) 考馬斯亮藍(lán)溶液配制： 稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)，溶于50 ml 90%乙醇中，加入100 ml 85% (W/V) 的磷酸，再用蒸餾水定容到1L。在過夜后過濾

24、并貯于棕色瓶中，常溫下可在暗中保存一個(gè)月。(2) 100卩g/ml牛血清蛋白(BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取 25mg BSA加水溶解后定容至 100 ml，再從中吸 取40ml用蒸餾水定容至100 ml (也可取10mg BSA定容至100ml即為100卩g/ml標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液)。實(shí)際配置0.05M， pH7.8 磷酸緩沖液： 3 個(gè)處理 *2 個(gè)品種 *3 次重復(fù) *0.08ml*3 次測(cè)定 =0.3456ml; (實(shí)際配置 100 ml,)考馬斯亮藍(lán)溶液 : 3 個(gè)處理 *2 個(gè)品種 *3 次重復(fù) *2.9ml*3 次測(cè)定 =156.6ml; （實(shí)際配置 200 ml， 20mg）2、樣品可溶性蛋

25、白含量的測(cè)定（1 ）樣品可溶性蛋白含量測(cè)定：取 20卩I提取液（酶液）加入 80卩I , 0.05M, pH7.8磷酸緩沖液（即 稀釋成0.1ml提取液），再加入2.9ml考馬斯亮藍(lán)溶液，反應(yīng) 2min后測(cè)OD595（以100卩I緩沖液加2.9ml 考馬斯亮藍(lán)為對(duì)照調(diào)零） 。（2）蛋白質(zhì)含量計(jì)算：可溶性蛋白質(zhì)含量（ mg/g） =（C x VT）/（W x VsX 1000）C為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的蛋白質(zhì)含量（卩g）; Vt為提取液總體積（稀釋后的體積 ml）； Vs為測(cè)定時(shí)所用提取液體積（ml, 20卩l(xiāng) ） ； W為樣品鮮重（g）。過氧化氫（H2Q）含量的測(cè)定一、試劑配制：1、0.2 mol/L

26、 HClO 4：取 10.05g HClO 4溶解于 0.5L 的水中；2、4 mol/L KOH ：取 112 g KOH 溶解于 0.5L 的水中；3、 0.1 mol/L , pH6.5 的磷酸緩沖液：NstHPO 12HO5.6407g+NaHPQ 2H2O5.3433g 用去離子水定容到 500ml;4、 顯色液：100mL、0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液+25卩L N,N-二甲基苯胺+10 mg 4-氨基氨替吡啉；5、過氧化物酶溶液（ 250 U/mL）二、測(cè)定步驟：稱取植株根和葉片組織各 0.5g，分別置于研缽中，加入 1.6 mL預(yù)冷至4C的0.2 mol/L H

27、ClO 4,冰浴 勻漿，于10 000 x g離心5 min （4C）,取上清液，加 4 mol/L KOH調(diào)pH值為7.5后，再于10 000 x g離 心5 min （4C）,取上清液1 mL力口 0.4 mL顯色液和0.1mL過氧化物酶溶液（250 U/mL）,用島津 UV-1601 分光光度計(jì)測(cè)定波長 550 nm （可見）處光密度值的變化，HO含量以卩mol/gFW表示。（用什么調(diào)零？）三、計(jì)算方法： （ 要做標(biāo)線？ ）參考：過氧化氫（HQ）含量的測(cè)定參照 Uchida等（2002）方法并加以改進(jìn)。還原型谷胱苷肽 GSH2 試劑配制（1）1mM GS標(biāo)準(zhǔn)液10mL（現(xiàn)用現(xiàn)配）：稱3.

28、0733mgGSH加蒸餾水至10mL。（不要）（2）5%磺基水楊酸 500mL 25g溶于500mL水中。（3）6mM DTNB稱取 0.118905g DTNB 溶于 50mL PBS （0.1M, pH7.5 ）中。（4）2mM NADPH18.1mg NADPH溶于 10mL PBS中。（5）1mMGSSG準(zhǔn)液 10mL 6.126mg GSSG加 PBS至 10mL。（不要）實(shí)際配置0.1M PBS（pH 7.5）:3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.5ml*3 次測(cè)定=27ml;（實(shí)際配置50 ml ）6mMDTNB:3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.2ml*3次測(cè)定=10.8ml;（

29、實(shí)際配置50 ml，實(shí)際用量0.1189g ） 2mMNADPH:3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.1ml*3次測(cè)定=5.4ml;（實(shí)際配置50 ml,實(shí)際用量18.1mg）（1U）GR川：3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.1ml*3次測(cè)定=5.4ml;（實(shí)際配置50 ml,實(shí)際用量10ml） 5%磺基水楊酸：3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.01ml*3次測(cè)定=0.54ml;（實(shí)際配置10ml）（實(shí)際用量 0.5g/10ml）0.5mM PBS: 3 個(gè)處理 *2 個(gè)品種 *3 次重復(fù) *1.5ml*3 次測(cè)定 =81ml; （實(shí)際配置 100 ml ） 乙醚（二乙醚） : 3 個(gè)處理 *2

30、 個(gè)品種 *3 次重復(fù) *10ml*3 次測(cè)定 =540ml; （實(shí)際配置 1000 ml ） PBS Buffer 0.5mM: 3 個(gè)處理 *2 個(gè)品種 *3 次重復(fù) *1.5ml*3 次測(cè)定 =81ml; （實(shí)際配置 150 ml ） 2- 乙烯吡啶 : 3 個(gè)處理 *2 個(gè)品種 *3 次重復(fù) *0.2ml*3 次測(cè)定 =10.8ml; （實(shí)際用量 20 ml ） 乙醚 : 3 個(gè)處理 *2 個(gè)品種 *3 次重復(fù) *10ml*3 次測(cè)定 =540ml; （實(shí)際用量 1000 ml ）1標(biāo)線制作：配制濃度為 0, 0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12

31、mM的標(biāo)準(zhǔn) GSH溶液（吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液各 O.ImL ）力口入 0.5mL 0.1M 磷酸鈉 Buffer （ pH7.5 ）（含 5mM EDTA）, 0.2mL 6mM DTNB,0.1mL 2mM NADPH,0.1mL（1U）GRH（谷胱甘肽還原酶）（sigma）,從 0.1mL GSH啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定 650s 的 A412（ OD412，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以 PBS代替DTNB乍空白。3 GSH（ 還原型谷胱甘肽） 及 GSSH（ 氧化型谷胱甘肽）（1 ）取1g新鮮葉片，加入10卩L （可以取0.2g鮮樣，加1.6ml提取液）5%磺基水楊酸，研磨后在 14000g離心10分鐘，取1mL上

32、清液，加入 1.5mL,0.5mM PBS （pH7.5 ）中，再用 5mL乙醚（二乙醚）抽 取二次（雜質(zhì)會(huì)融到乙醚層中，而乙醚處于整個(gè)反應(yīng)體系得上層，你直接用槍吸取上層乙醚丟棄即可，反 復(fù)進(jìn)行兩次即為抽取兩次） ，此提取液用于分析總谷胱苷肽含量。各取1mL上清液，加入 1.5mL PBS Buffer 0.5mM （pH7.5）,0.2mL 2-乙烯吡啶（原裝試劑濃度）混合至乳膠狀，在25C反應(yīng)1小時(shí)，再用5mL乙醚（原裝試劑濃度）抽提2次，此提取液用于分析 GSSGSSG-氧化型谷胱甘肽，GSH-還原型谷胱甘肽不能夠直接測(cè)出，需測(cè)出氧化型和還原型谷胱甘肽含量，即總的谷胱甘肽含量，然后減去氧化型谷胱甘肽（GSSG含量得到還原型谷胱甘肽含量（GSH）（2）取反應(yīng)混合液（