實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析及常見問題分析

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析及常見問題分析一、數(shù)據(jù)分析p定量PCR擴(kuò)增曲線的各種概念一、數(shù)據(jù)分析p什么是基線 基線是擴(kuò)增曲線的水平部分。一、數(shù)據(jù)分析p基線扣除一、數(shù)據(jù)分析p什么是閾值 閾值是一個(gè)熒光強(qiáng)度值，穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線。一、數(shù)據(jù)分析p什么是Ct值 Ct值是閾值線與擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)對(duì)應(yīng)在X軸上的值。一、數(shù)據(jù)分析p基線一、數(shù)據(jù)分析p基線一、數(shù)據(jù)分析p基線一、數(shù)據(jù)分析p基線一、數(shù)據(jù)分析p閾值線一、數(shù)據(jù)分析p閾值線二、常見問題分析1、PCR擴(kuò)增抑制（以Bio-CFX96為例）擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度大小及Ct值大小可提示存在抑制。H07存在擴(kuò)增抑制；解決方法：將樣本稀釋后進(jìn)行擴(kuò)增。（抑制物的

2、影響可通過稀釋樣本消除）二、常見問題分析pPCR抑制物l 黑色素 l 多糖類l 血紅蛋白l 尿素l 其他l 乙醇 l 蛋白酶Kl 胍鹽l 苯酚二、常見問題分析p血液中PCR抑制物的作用機(jī)制及對(duì)策抑制物抑制物作用原理作用原理對(duì)策對(duì)策肝素可結(jié)合于DNA和RNA上；對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶有抑制作用。肝素酶或氯化鋰血紅蛋白含有鐵，釋放鐵離子至PCR混合物，干擾DNA合成。1）DNA-瓊漿糖凝膠珠的相互混合；2）加入0.6%（wt/vol）的BSA（牛血清白蛋白）；3）NaOH處理。乳鐵蛋白含有鐵，釋放鐵離子至PCR混合物，干擾DNA合成。同上免疫球蛋白IgG與單鏈DNA相互作用同上亞鐵血紅素與DNA、RN

3、A結(jié)合，后續(xù)的提取過程中不能被去除；抑制聚合酶活性。加BSA，結(jié)合亞鐵血紅素二、常見問題分析p檢查樣本質(zhì)量 用分光光度計(jì)測(cè)量樣本260/280比值 DNA純度：OD260/OD280=1.8 RNA純度：OD260/OD280=2.0二、常見問題分析2、自動(dòng)基線有問題二、常見問題分析p手動(dòng)設(shè)置基線 點(diǎn)擊右鍵，選擇Baseline Threshold二、常見問題分析p手動(dòng)設(shè)置基線 將Baseline End設(shè)置為“擴(kuò)增信號(hào)出現(xiàn)的前一個(gè)循環(huán)” 即，原始為26，將其設(shè)置為20，點(diǎn)擊OK二、常見問題分析p手動(dòng)設(shè)置基線 設(shè)置完成后問題曲線恢復(fù)正常二、常見問題分析3、重復(fù)性1個(gè)樣本4個(gè)復(fù)孔重復(fù)性好二、常見

4、問題分析3、重復(fù)性1個(gè)樣本4個(gè)復(fù)孔重復(fù)性差二、常見問題分析p造成重復(fù)性差的原因 基線、閾值的設(shè)置 加樣誤差（操作？移液器？） 沒有將試劑和樣本充分混勻 低拷貝的樣本泊松分布 沒有使用ROX校準(zhǔn)（ABI7500）二、常見問題分析p基線、閾值的設(shè)置 根據(jù)曲線的具體情況進(jìn)行設(shè)置：閾值：大部分曲線熒光強(qiáng)度/20基線：開始2/3（根據(jù)儀器和試劑） 結(jié)束擴(kuò)增信號(hào)出現(xiàn)的前一個(gè)循環(huán) 如果基線、閾值設(shè)置無問題，則是其它原因造成重復(fù)性差。二、常見問題分析p加樣誤差（操作？移液器？）p沒有將試劑和樣本充分混勻 有時(shí)候在制備PCR反應(yīng)混合液時(shí)（包括Goldstar/PCR Mix反應(yīng)液、引物探針、樣本、水），在分裝入

5、反應(yīng)板（管）前沒有充分混勻。 結(jié)果加入到每個(gè)孔中的試劑成分就有所不同。 解決方法： 在分裝反應(yīng)混合液前，要將其充分混勻（振蕩、吹打）離心。 同時(shí)上機(jī)之前，要將PCR反應(yīng)板（管）離心，使所有液體都在反應(yīng)管底部。二、常見問題分析p低拷貝的樣本泊松分布 泊松分布：是一種統(tǒng)計(jì)與概率學(xué)里常見到的離散機(jī)率分布（discrete probability distribution）。 在30ul中有9個(gè)模板，每個(gè)反應(yīng)管均勻的分配到3個(gè)模板的幾率有多高？如果30ul中有9000個(gè)模板呢，又會(huì)怎么樣？二、常見問題分析pROX校準(zhǔn)：參比熒光（ABI7500）二、常見問題分析pROX設(shè)置 ABI7500儀器軟件自動(dòng)進(jìn)

6、行ROX校準(zhǔn)。 ROX校準(zhǔn)為可選步驟，如果使用的PCR試劑沒有添加ROX參比熒光，或者ROX添加濃度不適合，請(qǐng)將ROX校準(zhǔn)關(guān)閉（None）。二、常見問題分析4、“可疑的” 擴(kuò)增曲線（以ABI7500為例） 由于PCR擴(kuò)增形成的真正的擴(kuò)增曲線通常很容易確認(rèn)。 有特征的形狀：首先有背景信號(hào)（基線期），然后是三個(gè)增長(zhǎng)階段（指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期）二、常見問題分析p指數(shù)增長(zhǎng)期內(nèi)擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性二、常見問題分析p是什么原因造成平臺(tái)期很低呢？ 可能是目標(biāo)樣本的濃度太低。 通常如果模板的起始濃度太低，反應(yīng)體系中會(huì)形成大量的引物二聚體。 大量引物二聚體的形成使得引物很快消耗完，從而造成擴(kuò)增曲線的

7、平臺(tái)期很低。二、常見問題分析p引物和模板比例二、常見問題分析p是否可以調(diào)整引物和模板的比例？ YES。 低引物濃度會(huì)導(dǎo)致高Ct值（靈敏度低）。 所以對(duì)于低濃度的樣本，反應(yīng)體系中引物的濃度卻不能太低。二、常見問題分析p如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？ 首先看對(duì)數(shù)圖譜，和同一反應(yīng)中的其它曲線相比，這些曲線的形狀不相同。二、常見問題分析p如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？ 同時(shí)這些曲線沒有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期。二、常見問題分析p如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？ 最后看線性圖譜。 曲線一直沒有上升的趨勢(shì)，提示不存在擴(kuò)增。二、常見問題分析p如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？ 案例： 先看對(duì)數(shù)圖譜 右側(cè)的曲線形狀和擴(kuò)增曲線很相似，但曲線不光滑。二、常見問題分析p如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？ 案例： 再看下線性圖譜，可以看到曲線有一定的上升。二、常見問題分析p如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？ 案例： 分析： 形成這類曲線的原因可能是模板可能是模板的質(zhì)量差（PCR抑制物；模板濃度低），也有可能是引物探針有問題。 試劑原因： 如果使用的試劑背景信號(hào)太強(qiáng)，熒光的增長(zhǎng)將會(huì)很小，導(dǎo)致擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長(zhǎng)期會(huì)變得很短，或