結(jié)核病疫苗的研究進(jìn)展

1、結(jié)核病疫苗的研究進(jìn)展力的分支桿菌中而在bcg減毒和反復(fù)傳代時(shí)缺失。rd1區(qū)是所有缺失 域中最具特征性的。該基因片段在所有bcg亞株和大部分環(huán)境分支桿菌中 缺失，但在結(jié)核桿菌復(fù)合群的各菌株屮存在。另外，環(huán)境分支桿菌致敏也 是影響bcg效力的一個(gè)重要因素。接觸環(huán)境分支桿菌可獲得不同水平的抗 結(jié)核病感染的保護(hù)作用，但不足以控制以后毒力更強(qiáng)的結(jié)核桿菌的攻擊, 卻完全阻斷了由bcg正常提供的抗結(jié)核桿菌攻擊的保護(hù)作用。除效力不 一致外，標(biāo)化不足也是其主要缺點(diǎn)之一。同時(shí)，bcg作為一種減毒的活疫 苗，如果應(yīng)用于免疫功能有缺陷的患者如hiv感染者，可能會使bcg在患 者體內(nèi)播散而導(dǎo)致患者死亡。bcg的局限性推

2、動了抗結(jié)核病新疫苗的開發(fā)。 發(fā)展安全、高效的新型結(jié)核病疫苗勢在必行。1997年以來，美國國立衛(wèi)生研究院(nih)orme等建立了小劑量氣溶 膠攻擊的原發(fā)性肺結(jié)核病小鼠和豚鼠模型，并利用這些模型對170多種候 選疫苗進(jìn)行了試驗(yàn)。該院用于結(jié)核病研究的經(jīng)費(fèi)，從1990年的340萬美 元，增加到2000年的近8000萬美元。目前世界范圍內(nèi)正在開發(fā)的結(jié)核病 疫苗包括減毒或增強(qiáng)的活疫苗、全菌體滅活疫苗、亞單位疫苗、dna疫苗、 初免加強(qiáng)疫苗等。一、減毒或增強(qiáng)的活疫苗活疫苗的優(yōu)點(diǎn)是可使機(jī)體免疫系統(tǒng)受到更接近口然感染途徑的刺激，而不會引起病理損害。但同bcg-樣，影響以ppd為抗原的結(jié)核病血清學(xué)免疫診斷結(jié)果。

3、減毒活疫苗沿用了構(gòu)建bcg的思路。一是通過基因置換和轉(zhuǎn)座子誘變使單個(gè)基因位點(diǎn)失活來制備疫苗。使用這 種方法已生產(chǎn)出營養(yǎng)缺陷型候選疫苗株。這種營養(yǎng)缺陷型株能導(dǎo)致哺乳動 物宿主感染，但復(fù)制時(shí)間有限，與bcg有相同的保護(hù)作用。這預(yù)示著免疫 功能抑制人群有了較為安全的活疫苗的希望。二是誘導(dǎo)菌體突變，導(dǎo)致毒 力減低來構(gòu)建減毒活疫苗。由t bcg傳代過程丟失了 rd1區(qū)，導(dǎo)致保護(hù) 力下降，因此重新改造結(jié)核桿菌，使其rd1區(qū)缺失，用結(jié)核桿菌rd1缺 失株來驗(yàn)證它是否減毒，在人體存在的時(shí)間是否足以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答, 誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是否比bcg強(qiáng)。另一種減毒方法是前細(xì)胞凋亡法，設(shè)計(jì)用 作疫苗候選株的結(jié)核桿菌或

4、bcg突變株的超氧化物歧化酶活性減弱，感染 細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡加速，經(jīng)mhci類抗原遞呈增加，從而增強(qiáng)cd8+介導(dǎo) 的殺菌作用。這些理論已得到初步驗(yàn)證。增強(qiáng)活疫苗的通常方法是，在bcg中引入傳代過程中丟失的保護(hù)性抗原，或者引入哺乳動物細(xì)胞因子、 熒光素酶等，以增強(qiáng)bcg的免疫原性。在bcg中引入能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細(xì) 胞免疫的結(jié)核桿菌分泌性蛋白保護(hù)抗原ag85b,免疫結(jié)果顯示，其肺和脾 內(nèi)的細(xì)菌數(shù)與bcg免疫組相比，顯著減少。由rd1區(qū)基因編碼的結(jié)核分 支桿菌早期分泌性抗原性靶(esat- 6),是從結(jié)核桿菌短期培養(yǎng)濾液(st - cf)中純化分離 的一種低分子量分泌性蛋白，具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫活性，

5、可致結(jié)核桿菌再 感染小鼠的記快效應(yīng)t細(xì)胞增殖及ifn-r早期大量產(chǎn)生，在bcg各菌株 中缺乏其編碼基因。把rd1區(qū)重新導(dǎo)入bcg,表達(dá)的蛋白質(zhì)同有毒力的牛 型分支桿菌和結(jié)核桿菌幾乎完全相同。與bcg的免疫效果相比，可產(chǎn)牛更 多高效價(jià)的特異性抗體和更為強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此從rd1-rd16 中選擇基因重新導(dǎo)入bcg ,可能是增強(qiáng)現(xiàn)有bcg保護(hù)效力的更為有效的 途徑。murray等分別構(gòu)建了能分泌il2、il4、il6、ifnr、gm-csf等細(xì) 胞因子的rbcg。通過免疫小鼠證明，在bcg中加入有免疫增強(qiáng)作用的細(xì) 胞因子，可增加bcg的免疫效果。bcg雖有不足，但有使用廣泛、價(jià)格低、穩(wěn)定性好

6、、便于保存等優(yōu)點(diǎn)， 所以rbcg正越來越受到研究者的重視。二、滅活的全菌體疫苗以前已對滅活的全菌體疫苗的預(yù)防作用有所認(rèn)識。在意大利10萬名 兒童中接種了全菌體分支桿菌滅活疫苗，顯示有一定的預(yù)防和降低死亡率 的作用。滅活疫苗的最大優(yōu)點(diǎn)是安全。但接種后在機(jī)體內(nèi)不復(fù)制，需反復(fù) 接種，但用量大。目前，對耗牛分支桿菌滅活疫苗的研究表明，在動物模 型中能預(yù)防結(jié)核病，并能誘導(dǎo)分支桿菌特異性細(xì)胞毒性應(yīng)答。在健康人和感染hiv的bcg初免者中能誘導(dǎo)產(chǎn)生分支桿菌 特異性抗體、淋巴細(xì)胞增殖和inf-r產(chǎn)生。2001年在坦桑尼亞開始評價(jià)該 疫苗預(yù)防hiv感染者結(jié)核桿菌菌血癥的效力。三、亞單位疫苗由于組成亞單位疫苗的蛋

7、白質(zhì)或多肽，是以天然蛋白氨基酸或多肽的 堿基為基礎(chǔ)，利用基因工程方法生產(chǎn)的，故與天然成分具有近似的性質(zhì)， 且產(chǎn)量大、純度高，可以進(jìn)行質(zhì)量控制和標(biāo)化，制成“雞尾酒”式的復(fù)合 疫苗，其安全性也較高。研究表明，結(jié)核桿菌保護(hù)性抗原基因多屬分泌蛋 白，具有重要的細(xì)胞免疫功能，有很強(qiáng)的cd4+ thl和cd8+細(xì)胞毒性應(yīng)答特性，能產(chǎn)生ifn-r,使動物產(chǎn)生保護(hù)性免疫?，F(xiàn)已知亞單位疫苗中有明顯 作用及部分作用的分泌蛋白有ag85、esat6、mpt32、mpt- 64以及熱休 克蛋白hsp65、hsp70等，其屮最有希望的是分泌型蛋白ag85和esat-6 , 二者成為近年來研究的熱點(diǎn)。ag85是結(jié)核分支桿

8、菌主要的分泌性蛋口復(fù)合物，是由ag85a、ag85b 和ag85c 3個(gè)組分組成的蛋白質(zhì)o ag85a是結(jié)核桿菌抗巨噬細(xì)胞的重耍成 分，可引起結(jié)核桿菌感染者強(qiáng)烈的t細(xì)胞增殖和inf-r釋放。ag85a能誘 導(dǎo)結(jié)核病人的t細(xì)胞應(yīng)答，因此是誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性免疫機(jī)制的重要抗 原蛋白。小鼠的研究結(jié)果顯示，以ag85a為基礎(chǔ)的亞單位疫苗能成功地增強(qiáng)bcg接種后減弱的免疫應(yīng)答，與活疫苗(bcg) 相反，用選擇的幾種抗原制備的亞單位疫苗可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性免疫應(yīng)答。esat-6蛋白有多個(gè)t、b細(xì)胞表位，在bcg各菌株中缺乏其編碼基因， 能廣泛被感染結(jié)核菌的不同種屬動物及不同遺傳背景的個(gè)體細(xì)胞所識別。 這種識

9、別發(fā)生在感染早期階段，在保護(hù)性細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，且能 介導(dǎo)長期持久的免疫記憶。人類不同hla型接種者的淋巴細(xì)胞也可能識別 共同的表位而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而能部分克服由于人群的遺傳差異所造成 的原有bcg在不同地區(qū)保護(hù)效果不同的問題。用合適的佐劑配方免疫接種 esat - 6可以誘導(dǎo)高水平保護(hù)作用。同時(shí)用編碼esat-6的dna疫苗接種也 可激發(fā)保護(hù)性的應(yīng)答。甚至從esat-6獲得的單一表位與dda/mpl佐劑免 疫也能提供有效的、與bcg相仿的保護(hù)作用。用ag85b和esat-6融合蛋 白的亞單位疫苗免疫小鼠，誘導(dǎo)的保護(hù)水平優(yōu)于單個(gè)組分，保護(hù)作用比單 用ag85b+esat-6和bcg強(qiáng)；

10、并在豚鼠中顯示具有與bcg同樣的抵抗體質(zhì) 量減輕和存活率低的作用。在環(huán)境分支桿菌致敏小鼠中接種2種不同亞單 位疫苗提供的保護(hù)效力，與曾經(jīng)接觸過環(huán)境分支桿菌無關(guān)。這表明，亞單 位疫苗可不受致敏作用的影響而能刺激保護(hù)性t細(xì)胞應(yīng)答，而bcg的活性 依賴于最初的增殖。亞單位疫苗要經(jīng)過基因克隆、表達(dá)和蛋口純化等復(fù)雜的生產(chǎn)過程，有的重組蛋口不能真實(shí)地反映抗原蛋 白的高級空間結(jié)構(gòu)。此外亞單位疫苗主耍誘導(dǎo)體液免疫而不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒 性t淋巴細(xì)胞(ctl)應(yīng)答，因而限制了它的應(yīng)用。四、dna疫苗dna疫苗由編碼引起機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原體抗原基因和真核表達(dá)載體構(gòu)建而成，可誘導(dǎo)全面的免疫反應(yīng)，特別是特異性ctl識

11、別、殺 傷、破壞被感染的細(xì)胞及清除細(xì)胞內(nèi)的病原體。這對于消除寄生于巨噬細(xì) 胞內(nèi)的結(jié)核桿菌非常重要。用結(jié)核分支桿菌ag85a、ag85b和ag85c dna 疫苗分別肌內(nèi)注射免疫小鼠，在其脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中，il2、inf-r和tnfa 水平比bcg免疫鼠顯著增高，能產(chǎn)生顯著的ctl活性。用ag85a dna疫 苗接種c57bl/ 6鼠，可產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫，對靜脈注射和吸 入的活結(jié)核桿菌h37rv株的攻擊可提供明顯的保護(hù)作用。denis等證實(shí)，ag85 adna免疫優(yōu)于其他二種疫苗，可產(chǎn)生更強(qiáng)、更廣泛的t細(xì)胞反應(yīng)和 ctl活性。morris等用編碼結(jié)核桿菌分泌抗源的esat6、mpt6

12、4、mpt63、 katg基因構(gòu)建的dna疫苗聯(lián)合免疫，可產(chǎn)生針對每一抗原成分的特異性 體液和細(xì)胞免疫，其保護(hù)作用與bcg相當(dāng)。kamath等用質(zhì)粒載休構(gòu)建 mpt64、ag85b和esat-6的dna疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)ag85b dna疫苗效 力最高,esat-6 dna疫苗次之，mpt64dna疫苗最弱，但三者均比bcg差。3種dna疫苗聯(lián)合免疫效力優(yōu) 于單個(gè)dna疫苗。因此多單位dna疫苗聯(lián)合免疫可能是未來預(yù)防結(jié)核病 的實(shí)用措施。但用dna疫苗免疫的潛在危險(xiǎn)是，轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)的外源基 因有可能整合到宿主染色體基因組dna上，使宿主細(xì)胞腫瘤抑制基因失活 或腫瘤基因活化，使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞

13、。另外，特定結(jié)構(gòu)和序列的外 源dna可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗dna抗體，理論上有引起自身免疫應(yīng)答的問題。 這也是dna疫苗接種應(yīng)該考慮的安全因素之一。五、初免一加強(qiáng)疫苗連續(xù)給予由兩種相同或不同抗原進(jìn)行免疫。一種方法是用兩種不同疫 苗載體表達(dá)相同的抗原組分，先用一種肌內(nèi)注射免疫，再用另一種作皮內(nèi) 免疫。另一種方法是先用bcg免疫，再用另一種增強(qiáng)免疫。mcshane正 在結(jié)核菌素皮試陽性和陰性的人群中，探討bcg初免后，用痘苗病毒株表 達(dá)的結(jié)核桿菌分泌抗原ag85a加強(qiáng)免疫的效力。也有人研究發(fā)現(xiàn)，以ag85a 為基礎(chǔ)的亞單位疫苗能成功地增強(qiáng)bcg接種后減弱的免疫應(yīng)答。六、展望除上述幾種疫苗的研究外，有學(xué)者對結(jié)核病的轉(zhuǎn)基因植物疫苗進(jìn)行了 研究，還有學(xué)者利用不同免疫途徑研究人體對bcg的免疫應(yīng)答，觀察改變 疫苗接種途徑后bcg是否更有效。理想的結(jié)核病疫苗是在出生時(shí)接種即可獲得終生的保護(hù)性免疫。盡管 近5年來結(jié)核病疫苗的研究有了很大的進(jìn)展，但