臨床PCR檢驗的室內(nèi)質(zhì)控 李金明

1、臨床臨床PCR檢驗的室內(nèi)質(zhì)控檢驗的室內(nèi)質(zhì)控方法方法衛(wèi)生部臨床檢驗中心 李金明存在的問題存在的問題l概念不清l不知道具體怎么做l不會寫室內(nèi)質(zhì)控的SOPl不知道如何選擇室內(nèi)質(zhì)控物l不會分析室內(nèi)質(zhì)控的結(jié)果室內(nèi)質(zhì)控室內(nèi)質(zhì)控SOP存在的問題存在的問題l責任人不清。l質(zhì)控物的來源及濃度不清或不全，并且通常沒有說明陰性質(zhì)控物的來源。有些是自制，但制備方法不規(guī)范，沒有任何的質(zhì)量檢驗，定量結(jié)果沒有溯源性。l沒有明確所選用的質(zhì)控方法。對前20次的測定的室內(nèi)質(zhì)控沒有解決方法。l沒有明確的失控判斷標準，只是做了一些失控的含糊敘述。并且一般都沒有陰性失控的判斷方法。l沒有失控后的分析及處理措施。 室內(nèi)質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)量

2、控制（Internal Quality Control,IQC)的概念的概念l由由實驗室工作人員實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟，連，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度，旨在續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測和監(jiān)測和控制本實驗室工作的精密度控制本實驗室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗的一致性，以中批內(nèi)、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結(jié)確定測定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作。l可概括為可概括為: :(1)(1)執(zhí)行者執(zhí)行者：實驗室技術(shù)人員；：實驗室技術(shù)人員；(2)(2)目目的的：監(jiān)測實驗室

3、測定的重復性；：監(jiān)測實驗室測定的重復性；(3)(3)功能功能：決定：決定了當批測定的有效性，報告可否發(fā)出。是對實驗了當批測定的有效性，報告可否發(fā)出。是對實驗室測定的室測定的即時性評價即時性評價。 室內(nèi)質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）的基本內(nèi)容）的基本內(nèi)容l主要包括三個方面：（1）測定前的質(zhì)量控制；（2）統(tǒng)計學質(zhì)量控制；（3）質(zhì)量控制的評價。測定前的質(zhì)量控制l實驗室設施、儀器設備及管理l理想的試劑和操作方法 l人員培訓 實驗室設施、儀器設備及管理實驗室設施、儀器設備及管理l實驗室空間及工作流程的設計l實驗室環(huán)境條件的控制：溫濕度控制設備、穩(wěn)壓或不間斷電源理想的理想的PCR實驗室設計實驗室設計A產(chǎn)

4、物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊專用走廊工作流向工作流向擴增區(qū)擴增區(qū)標本制備區(qū)標本制備區(qū)試劑準備區(qū)試劑準備區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊專用走廊工作流向工作流向擴增區(qū)擴增區(qū)標本制備區(qū)標本制備區(qū)試劑準備區(qū)試劑準備區(qū)理想的理想的PCR實驗室設計實驗室設計B臨床PCR實驗室設計的一般原則l各區(qū)獨立l注意風向l因地制宜l方便工作“十六字口訣十六字口訣”產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向

5、空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊專用走廊工作流向工作流向擴增區(qū)擴增區(qū)標本制備區(qū)標本制備區(qū)試劑準備區(qū)試劑準備區(qū)傳遞窗傳遞窗傳遞窗臨床臨床PCR實驗室質(zhì)量管理的特點實驗室質(zhì)量管理的特點 l“無基因”概念 l實驗室要有嚴格的人員進入限制和程序 l使用合格的試劑和消耗品 PCR實驗室實驗室“污染污染”的主要來的主要來源源l臨床標本中存在的大量待測微生物l科研中得到的質(zhì)?？寺以前分析研究的特定微生物l大量存在于實驗環(huán)境中的特定微生物l以前擴增產(chǎn)物的殘留污染。這也是PCR實驗室最容易產(chǎn)生的將造成假陽性的“污染”。 PCR實驗室的重要防實驗室的重要防“污染污染”措措施施

6、l實驗室的嚴格分區(qū)及工作程序的嚴格遵守 l化學方法：實驗臺面可使用10的次氯酸鈉（漂白劑）清洗 ；有些物品比如放置擴增反應管的盤必須從污染區(qū)轉(zhuǎn)回到清潔區(qū)時，在轉(zhuǎn)回之前，應將其置于210的次氯酸鈉溶液中過夜，并充分沖洗。l紫外照射：實驗臺面、儀器設備、實驗室空間lUNG儀器設備及管理儀器設備及管理lPCR儀、離心機、加樣器、恒溫設備等應建立技術(shù)檔案，并定期維護;PCR儀、加樣器、恒溫設備應定期進行校準理想的試劑理想的試劑:試劑的質(zhì)檢試劑的質(zhì)檢l核酸提取或標本處理方法的抗干擾能力（能否 有效地去掉PCR抑制物）l測定下限(Detection limit)（定性測定）l測定準確性和線性范圍l批內(nèi)變異

7、和批間變異l試劑批間的一致性l有否污染l其他：外包裝、試劑的完整性、有效期、說明書等理想的操作方法l按照試劑盒說明書操作即可嗎?l操作中影響測定結(jié)果的關鍵環(huán)節(jié)l寫出具有可操作性的SOP人員培訓人員培訓l培訓所涉及的范圍:儀器設備使用、維護和校準；試劑、方法原理；質(zhì)量管理體系；相關法律法規(guī)、相關領域的新技術(shù)、新理念和新進展；實驗操作技能等。l如何培訓：講座、討論、自學和參加培訓班等。l培訓的評估：書面考試、實驗考核、討論心得、論文、綜述等。統(tǒng)計質(zhì)控方法l質(zhì)控物濃度的選擇l每次（批）測定質(zhì)控物的數(shù)量及放置l質(zhì)控規(guī)則lLevey-Jennings質(zhì)控圖方法 l“即刻法”質(zhì)控方法 l“假陽性”的統(tǒng)計質(zhì)

8、控方法質(zhì)控物濃度的選擇質(zhì)控物濃度的選擇l定量測定：測定線性范圍內(nèi)的高、中、低三種濃度l定性測定：接近方法測定下限的濃度l陰性質(zhì)控物每次（批）測定質(zhì)控物的數(shù)量及每次（批）測定質(zhì)控物的數(shù)量及放置放置l標本數(shù)量如小于30，弱陽性和陰性質(zhì)控各1份，標本數(shù)量增加，質(zhì)控物數(shù)量相應按比例增加l均勻分散于臨床標本中，與臨床標本一同處理（核酸提?。﹍擴增時的排列順序，可排于標準品或校準品之后，臨床樣本之前。但在擴增儀中的位置，不應永久性的固定的在一個孔，而應在每次擴增檢測時，進行相應的順延，以使在一定的時間內(nèi)，可以盡可能的監(jiān)測每一個孔的擴增有效性。陰性質(zhì)控樣本的種類陰性質(zhì)控樣本的種類l陰性原血清樣本l實驗過程中

9、帶入的空管l僅含擴增反應混合液的管陰性原血清樣本的功能陰性原血清樣本的功能l監(jiān)測實驗室的以前擴增產(chǎn)物的“污染”l由實驗操作所致的標本間的交叉污染。具體地說，如強陽性標本氣溶膠經(jīng)加樣器所致的污染、強陽性標本經(jīng)操作者的手所致的污染、使用翻蓋離心管核酸提取時在較高溫孵育時蓋子崩開等l擴增反應試劑的污染。 核酸提取過程中帶入的空管核酸提取過程中帶入的空管l監(jiān)測核酸提取過程中的實驗室“污染”的存在（在整個實驗過程中，開口放置于核酸提取的操作臺面區(qū)域內(nèi)，最后以水為基質(zhì)，進行擴增 ）僅含擴增反應混合液的管僅含擴增反應混合液的管l監(jiān)測試劑的“污染”質(zhì)控規(guī)則的表達方式及定義 l質(zhì)控規(guī)則的表達方式 l質(zhì)控規(guī)則的功

10、能 l常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義 質(zhì)控規(guī)則的表達方式l通常質(zhì)控規(guī)則以符號AL來表示，其中A為質(zhì)控測定中超出質(zhì)量控制限的測定值的個數(shù)，L為控制限，通常用均值或均值13SD來表示。 l當質(zhì)控測定值超出控制限L時，即可將該批測定判為失控。 l常用的13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值3s，其確切的含義為：在質(zhì)控測定值中，如果有一個測定值超出均值3s范圍，即可將該批測定判為失控。 質(zhì)控規(guī)則的功能 l簡單地說就是用于判斷測定批的失控還是在控。常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義 符符 號號 定定 義義l12S 一個質(zhì)控測定值超出2s控制限。l13S 一個質(zhì)控測定值超出3s控制限。l22S 兩

11、個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+2s或2s控制限。lR4S 同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間的 差值超出4s控制限。l41S 四個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+1s或1s控制限。l7T 七個連續(xù)的質(zhì)控測定值呈現(xiàn)一個向上或向下的趨勢變 化。l10X 十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（）的同一側(cè)。Levey-Jennings質(zhì)控圖方法l也稱Shewhart質(zhì)控圖，是由美國的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。l二十世紀五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗的質(zhì)量控制 。經(jīng)Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jennings

12、質(zhì)控圖。質(zhì)控圖Levey-Jennings質(zhì)控圖質(zhì)控圖基本的統(tǒng)計學含義基本的統(tǒng)計學含義l穩(wěn)定條件下，在20個IQC結(jié)果中不應有多于1個結(jié)果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個測定結(jié)果中超過3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個。l如以3s為失控限，假失控的概率為0.3%。 “即刻法”質(zhì)控方法l“即刻法”質(zhì)控方法的實質(zhì)是一種統(tǒng)計學方法，即Grubs異常值取舍法 ；l只要有3個以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在?！凹訇栃约訇栃浴钡慕y(tǒng)計學室內(nèi)質(zhì)控方法的統(tǒng)計學室內(nèi)質(zhì)控方法l基于日常檢驗的陽性率比值(呈正態(tài)分布)l直接概率計算方法（不呈正態(tài)分布）基于日常檢驗的陽性率比值基于日常檢驗的陽

13、性率比值l半Levey-Jennings質(zhì)控圖法 質(zhì)控規(guī)則質(zhì)控規(guī)則l當陰性質(zhì)控樣本為陽性時,不管陽性率測定比值為何，均為失控，所有陽性標本須重新測定，并增加一倍陰性質(zhì)控樣本。l如果陰性質(zhì)控樣本為陰性，某次測定陽性比值超出+3SD,則為失控,為1+3S規(guī)則。本次結(jié)果陰性結(jié)果根據(jù)陽性質(zhì)控樣本的情況,決定是否可以發(fā)出,所有陽性樣本結(jié)果不能發(fā)出，需查找出現(xiàn)陽性率增高的原因，并在增加一倍陰性質(zhì)控樣本的情況下重新檢測?？赡艿膸追N失控表現(xiàn)可能的幾種失控表現(xiàn) l曲線向上漂移：提示出現(xiàn)污染，污染可能是由于某一天操作上的失誤導致實驗室被污染如標本泄漏，產(chǎn)物泄漏，試劑被污染等l向上的趨勢性變化：可能存在累積性的產(chǎn)物

14、污染，實驗室擴增產(chǎn)物逐漸累積，從而使病人結(jié)果的陽性率逐漸增高。此時實驗室需要進行徹底清潔。直接概率計算法直接概率計算法l按統(tǒng)計學規(guī)律，一個事件發(fā)生的概率小于5%被稱為小概率事件，即發(fā)生的可能性很小。l當一個小概率事件發(fā)生時，則可能有誤差存在，有必要對其發(fā)生的原因進行分析。l對每天的日常病人結(jié)果中陽性率出現(xiàn)的概率進行計算，如果這種結(jié)果出現(xiàn)的概率小于5%時，則可判為失控。 根據(jù)二項式分布的概率計算根據(jù)二項式分布的概率計算l在一個實驗室中某檢測項目結(jié)果的陽性率為p,計算在n個血液樣本中有k個陽性結(jié)果的概率。根據(jù)二項式分布的概率計算公式如下： P(X=k)=n!/k!(n-k)!pk(1-p)n-k

15、(1) 其中n為當次實驗檢測標本數(shù)，k為陽性個數(shù)，p為陽性率。lP(X=k)5%為失控。此時，陰性標本可以發(fā)出報告，所有陽性標本在查清原因后重做。根據(jù)二項式分布的概率計算根據(jù)二項式分布的概率計算l如果一個實驗室檢測HBV DNA，平常病人結(jié)果的陽性率為10%，即p=0.1, 在某一次檢測25個樣本出現(xiàn)6個陽性結(jié)果，19個陰性結(jié)果，則檢測過程中是存在污染的可能性可通過下述方法計算。即計算在25個樣本中出現(xiàn)6個或6個以上陽性結(jié)果的概率，此時的概率為1-（獲得0個或1個或2個或3個或4個或多5個陽性結(jié)果的概率）即：l1-P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)=1-(1-0.1)25+25(

16、1-0.1)240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1)220.13+12650(1-0.1)210.14+53130(1-0.1)200.15=0.0334l則在這個實驗室一次檢測25個標本獲得6個或6個以上陽性結(jié)果的概率為3.34%，小于5%，屬于小概率事件，即發(fā)生的可能性很小，可能有污染所致假陽性結(jié)果的可能。根據(jù)泊松分布的概率計算根據(jù)泊松分布的概率計算l在血液篩查檢測中，許多實驗室或檢測項目如HCV RNA 、CT、結(jié)核桿菌、淋球菌的陽性結(jié)果率均較低，這時雖然可以使用公式（1）計算概率，但如果標本量很大，使用泊松分布來估計二項式分布是一種更為簡便的方法。根據(jù)泊松分

17、布，可使用下式計算概率： P(X=k) =(np)ke-np/k! (2)l P(X=k)5%為失控。此時，陰性標本可以發(fā)出報告，所有陽性標本在查清原因后重做。根據(jù)泊松分布的概率計算根據(jù)泊松分布的概率計算l一個實驗室中，某項目每次檢測結(jié)果的陽性率約為2%，則在100個樣本中出現(xiàn)8個陽性結(jié)果的概率。l根據(jù)泊松分布，可使用公式（2）計算概率，此時n=100,p=0.02,k=8, np=2代入公式（2）計算得 P(X=10) =28e-2/8!=0.0009。標本間交叉污染的概率計算l如果所有陽性結(jié)果的出現(xiàn)是連續(xù)性的，則可能存在標本間的交叉污染，即陽性樣本污染了它鄰近的陰性樣本，這種情況的概率計算

18、公式如下： P=(n-r+1)/n!/r!(n-r)! （3） 其中n為當次實驗檢測標本數(shù)，r為連續(xù)出現(xiàn)陽性的個數(shù)。l 當某次實際測定標本連續(xù)陽性的概率大于所計算的概率，則判為失控。陰性標本結(jié)果可以發(fā)出，陽性標本要考慮標本間交叉污染的問題。標本間交叉污染的概率計算l如在一次檢測100個標本的HBV DNA檢測中，所有兩個陽性結(jié)果連續(xù)出現(xiàn)的概率為： P=(100-2+1)/100!/2!(100-2)!=99/4950=0.02 概率為2.0%。 因此，如在100個標本中，連續(xù)出現(xiàn)兩個為陽性次數(shù)有3次，即概率為3.0%，則為失控。l而在一次檢測100個標本，所有三個陽性結(jié)果連續(xù)出現(xiàn)的概率為： P

19、=(100-3+1)/100!/3!(100-3)!=98/161700=0.0006 概率為0.06%。 因此，如果如在100個標本中，連續(xù)出現(xiàn)三個為陽性次數(shù)有1次，即概率為1.0%，為失控。室內(nèi)質(zhì)量控制的評價lIQC是一個集體活動，不光是對實驗室一次測定的有效性的判斷，也反應了實驗室測定趨勢的變化。lIQC的失控不能做為處罰的依據(jù)，應建設性的找出失控的原因，針對其采取措施加以改進。l對IQC應定期進行評價。陽性質(zhì)控樣本失控的常見原因陽性質(zhì)控樣本失控的常見原因l核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中的丟失、有機溶劑的去除不徹底、標本中擴增抑制物的殘留、所用耗材如離心管有PCR抑制物等。l儀器的問

20、題。如擴增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。l試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標記效率和核酸提取試劑的效率等。陽性質(zhì)控樣本測定結(jié)果偏低或為陰性陽性質(zhì)控樣本測定結(jié)果偏低或為陰性結(jié)果偏低結(jié)果偏低陰性陰性臨床標本中臨床標本中無強陽性無強陽性臨床標本中臨床標本中有較強陽性有較強陽性臨床標本臨床標本中有陽性中有陽性臨床標本臨床標本全為陰性全為陰性觀察臨床標本情況觀察臨床標本情況所用離所用離心管含心管含抑制物抑制物Taq酶酶活性降活性降低低核酸提核酸提取試劑取試劑效率低效率低更換進更換進口離心口離心管管更換更換Taq酶酶再檢測再檢測更換核更換核酸提取酸提取試劑試

21、劑所有標本重新檢測所有標本重新檢測核酸提核酸提取中靶取中靶核酸丟核酸丟失失核酸提核酸提取中抑取中抑 抑物殘抑物殘留留核酸提核酸提取試劑取試劑混入混入擴增儀擴增儀孔間溫孔間溫度差異度差異隨機誤差檢測質(zhì)控樣本及檢測質(zhì)控樣本及35份已份已知陽性樣本知陽性樣本質(zhì)控樣本質(zhì)控樣本測定正常測定正常且陽性樣且陽性樣本有些值本有些值增加增加質(zhì)控及已質(zhì)控及已知陽性樣知陽性樣本測定仍本測定仍異常異常按系統(tǒng)誤按系統(tǒng)誤差途徑分差途徑分析析重新提取或已知濃度重新提取或已知濃度DNA在同一孔內(nèi)擴增在同一孔內(nèi)擴增結(jié)果正常結(jié)果正常結(jié)果仍低結(jié)果仍低進行擴增進行擴增儀孔溫度儀孔溫度校準后再校準后再檢測檢測Taq酶或酶或逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶失活失活避免假陰性的措施避免假陰性的措施l純化核酸l標本重復雙份測定 l稀釋標本 l使用“內(nèi)質(zhì)控”（Internal Control,IC) 陰性質(zhì)控樣本的常見失控原因陰性質(zhì)控樣本的常見失控原因 l擴增產(chǎn)物的“污染”l臨床標本的核酸提取過程中發(fā)生的標本間的交叉 “污染” 陰