BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀簡易操作步驟corr_ZYH_

1、BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀簡易操作步驟一、開機(jī)1） 先打開凈化交流穩(wěn)壓電源，其次打開 110V 穩(wěn)壓輸出電源，再次打開流式細(xì)胞儀，最后打開計算機(jī)。2） 向前拉開儲液箱抽屜，檢查鞘液筒、廢液筒水量，如需充填鞘液，先將減壓閥（紅色箭頭所示）方向調(diào)在VENT 位置（箭頭方向），再加入超純水，保持水位在鞘液桶的3/4 左右，加好后擰緊桶蓋并將減壓閥方向調(diào)在RUN 位置。二、開啟CellQuest軟件、編輯實驗文件1）在屏幕下方點擊CELLQuest （第四個圖標(biāo)）啟動軟件。桌面會出現(xiàn)一Untitled實驗文件，可點擊實驗文件的左上角的放大鈕（綠色），將實驗文件窗口放大。2）從工具板中點擊散點

2、圖圖示。在實驗文件的空白區(qū)點擊，拖曳對角線至適當(dāng)大小，然后放開鼠標(biāo)。出現(xiàn)散點圖對話方框（當(dāng)所要編輯的圖窗口被選中時，會在其四角出現(xiàn)四個小黑塊）。3）在出現(xiàn)的散點圖對話方框中點擊PlotSource ，選擇 AcquisitionandAnalysis(收取、分析 )，確認(rèn) X 和 Y 軸參數(shù)預(yù)設(shè)為FSC-H1024 、 SSC-H1024 。4）從屏幕上方Plots 菜單中選擇DotPlot 功能，可復(fù)制一個同樣大小的散點圖，在出現(xiàn)的對話方框內(nèi)選擇X 軸： FL1-H1024 ；如果是雙標(biāo)，Y 軸選擇： FL2-H1024( 根據(jù)實驗檢測樣品確定所選通道，本步驟選FL1/FL2 來說明 )，如

3、果是單標(biāo)，Y 軸選擇： SSC-H 。點擊 OK ， FL1/FL2 的散點圖出現(xiàn)。完成后可將重制圖移至原圖右方。說明： 散點圖（ Dotplot ），又稱二維散點圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個獨立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中，橫坐標(biāo)X 軸和縱坐標(biāo)Y 軸參數(shù)分別設(shè)為FSC-H1024、SSC-H1024 ；雙熒光標(biāo)記時，第二圖X 和 Y 軸參數(shù)分別設(shè)為FL1-H1024 、FL2-H1024 ， X 軸為為熒光 1 強(qiáng)度的相對值，單位是道數(shù)，Y 軸則通常表示熒光2 或光散射強(qiáng)度的相對值。儀器使用者可因?qū)嶒炐枨髞硇薷乃袌D譜中顯示之參數(shù)。修改動作為輕擊圖譜上X和Y軸參數(shù)，并依需要選擇之（FSC

4、 ：細(xì)胞大小，SSC ：細(xì)胞折射率，F(xiàn)L1 ：FITC 綠色熒光，F(xiàn)L2 ： PE 橙色熒光， FL3 ： PerCP5）在工具板中選擇四象限工具，在紅色熒光）。FL1/FL2 散點圖上拖動Quadrant的中心將它設(shè)定在（x， y）（ 10 1，10 1）處，這些象限將指定陰性/陽性區(qū)域。6）從工具板中點擊直方圖圖示，在實驗文件的空白區(qū)點擊，拖曳對角線至適當(dāng)大小，然后放開鼠標(biāo)。單色熒光只需一個直方圖，和第二個散點圖一樣，橫坐標(biāo)選擇FL-1 ，縱坐標(biāo)默認(rèn)為Counts ；若是雙色熒光，需畫2 個直方圖，一個橫坐標(biāo)選擇FL-1-1024 ，另一個橫坐標(biāo)選擇 FL-2-1024 ；7）在上面直方圖

5、中畫出M1 和 M2 ，其中 M1 代表隱性數(shù)目（一般標(biāo)示是101）， M2 代表陽性數(shù)目（除 M1 以外所有的部分）。8 ）從 Stats 菜單中選擇QuadrantStats （象限統(tǒng)計） ,5 ）步驟中的點圖將分為四個象限。三、建立儀器和計算機(jī)之間通訊從 Acquire 菜單中選擇 ConnecttoCytometer( 快捷鍵 Win+b) ，此時會出現(xiàn)AcquisitionControl對話方框。四、儀器設(shè)置文件注意： 實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決于最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件（ Instrumentsett

6、ings ），含信號器高壓（ Detector/Amps ），閾值（ Threshold ），熒光補(bǔ)償（ Compensation）等儀器條件的組合。一般而言，儀器設(shè)定的順序為Detector/Amps-Threshold-Compensation。1）檢查現(xiàn)有儀器條件，從 Cytometer 菜單中選擇 Detectors/Amps 。出現(xiàn) Detectors/Amps 窗口。在 Detectors/Amps 窗口確認(rèn) FSC 與 SSC （根據(jù)實驗樣品確定，一般細(xì)胞選擇 LIN ，細(xì)菌選擇 LOG ），其它 FL1-3 為LOG （對數(shù)放大），將其拖至空白區(qū)。2）從 Cytometer菜單

7、中選擇Threshold ，出現(xiàn) Threshold窗口在 Threshold窗口：確認(rèn)FSC 為設(shè)閾參數(shù)，初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52。將其拖至空白區(qū)。3）從 Cytometer 菜單中選擇 Compensation ，確認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其拖至空白區(qū)。五、上樣品、設(shè)置儀器使儀器處于HighRUN ，樣品管支撐架左移，上陰性對照管樣品，支撐架回位。確認(rèn)AcquisitionControl窗口中Setup 前需打叉或打勾(即不儲存數(shù)據(jù)，用于儀器設(shè)置) ，點擊 Acquire 。1 、調(diào)節(jié) FSC/SSC探測器（電壓）觀察 FSC/SSC 圖的變化。 FSC 電壓 (Voltage) 預(yù)設(shè)為 E0

8、0 ，可調(diào)節(jié)AmpGain從 1.00 9.99FSC使主要細(xì)胞群得以清楚顯示（如細(xì)胞較大，將FSC 電壓設(shè)置于E-1 ；較小細(xì)胞，將電壓設(shè)置于E01 ）。調(diào)節(jié)SSC 電壓使主要細(xì)胞群得以清楚呈現(xiàn)。調(diào)節(jié)FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨立離散的細(xì)胞族群，該細(xì)胞群不與其它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。調(diào)整定位后，點擊 AcquisitionControl 窗口中的 Pause 。2 、 Gating圈選細(xì)胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。我們常用前方散射（FSC ）與側(cè)方散射（ SSC ）的二維位圖，即散射光圖譜（ScatterPlot ），來圈選出不同細(xì)胞群的范圍，選擇性顯示出有意

9、義的細(xì)胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。1）在工具板中選擇多邊形的Region ，在 FSC/SSC散點圖上劃定淋巴細(xì)胞R1 區(qū)域（如下圖）。分析樣品時，區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會呈現(xiàn)成紅色，可移動或改變形狀來圈選有意義的細(xì)胞。如果要刪除R1 區(qū)域，您可以在工具列中點選Gates Regionlist，以鼠標(biāo)點選R1 ，再按Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1 區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1 。2） 選取希望 Gate 話方框內(nèi)，將的 FL1/FL2NoGate 改選散點圖，從Plots 菜單中選擇G1=R1 。點擊 OK 。Formatdotplot。在出現(xiàn)的對3 、調(diào)節(jié) FL1 、 FL2 的

10、探測器（電壓）1 ）點擊 AcquisitionControl窗口中的Restart 。在 Detector/Amps窗口中調(diào)節(jié)FL1 、 FL2的電壓，使NegativeControl細(xì)胞群著落在所選直方圖或散點圖之100 -10 1 處。2）在 Threshold 窗口，適當(dāng)?shù)靥岣?FSC 閾值 >52 ，以去除碎片或低階噪音。唯需注意不要切掉主要細(xì)胞族群。3）點擊 AcquisitionControl窗口中的 Pause 、 Abort 。移去陰性對照管，我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光，不要再改動Detector/Amps、 Threshold等數(shù)值。4 、調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償說明：最

11、適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭。（如是單色熒光實驗可跳過此步驟）如是樣本，必要時需調(diào)節(jié)FL2-%FL1 ，F(xiàn)L1-%FL2 （若 3 色樣本，必要時需調(diào)節(jié)FL2-%FL1FL1-%FL2 、 FL3-%FL2 、 FL2-%FL3的補(bǔ)償）。2 色、1）HighRUN窗口中的 FL1/FL2，換上單染CD3-FITC管。點擊AcquisitionControlAcquire 。調(diào)節(jié) FL2-%FL1使 FITC 陽性細(xì)胞在散點圖的右下象限。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過點擊來選擇或直接拖動滑標(biāo)上下移動。調(diào)節(jié)完畢，點擊窗口中的 Pause 。AcquisitionControl2）移去單染CD3 ，換上單染CD19

12、-PE管。點擊AcquisitionControl細(xì)胞在 FL1/FL2窗口中的 Restart 。調(diào)節(jié) FL1-%FL2 散點圖的左上象限。調(diào)節(jié)完畢，點擊使PE+AcquisitionControl窗口中的Pause 。3.）最后以CD3-FITC/CD19-PE雙染樣本上機(jī)，點擊AcquisitionControl窗口中的 Restart ，確定三群細(xì)胞工整垂直。當(dāng)您已完成2 色熒光之光譜重迭時，點擊AcquisitionControl窗口中的 Pause 、 Abort 。4）移去樣本管，換上dH2O 管，讓儀器暫且處于Standby狀態(tài)。關(guān)閉Compensation窗口。您已完成2 色

13、熒光之最適化。六、收集實驗數(shù)據(jù)1）決定儲存細(xì)胞總數(shù)：預(yù)設(shè)之儲存細(xì)胞總數(shù)為 10000 中選擇 Acquisition&Storage ，并在出現(xiàn)的窗口功，確認(rèn)。如需修改，從AcquireCollectionCriteria從菜單10000ofAll，再點擊OK 。2 ） 找個檔案匣準(zhǔn)備儲存數(shù)據(jù)，本機(jī)所有數(shù)據(jù)都貯存在D 盤 data 盤中，按實驗日期編排 。 從 Acquire 菜單中選擇ParameterDescription，出現(xiàn) ParameterDescription對話方框。點擊Folder ，并在隨后出現(xiàn)之對話方框，選擇YourFolder 或新建活頁夾，點擊此對話方框的Se

14、lect YourFolder（一般用實驗日期來命名Folder ）。3）命名即將儲存之文件名：點擊ParameterDescription對話方框的File ，出現(xiàn)文件名編輯窗口，輸入文件名（根據(jù)實驗來決定），點擊此對話方框的OK。4）Optional ：如有需要，可選擇或在P1-P5 后的空格中輸入相關(guān)參數(shù)名。如P1 ：Size,P2： Granularity,P3：CD3FITC。輸入?yún)?shù)名會存入實驗檔案中，顯示在圖譜上。5 ）計數(shù)器 Counters ：從 Acquire 菜單中選擇 Counters. 窗口會顯示樣品分析速率、與總數(shù)進(jìn)度6 ）開始收集實驗數(shù)據(jù)。 LOWRUN （根據(jù)C

15、ounters來調(diào)節(jié)速度，一般保持在700-800/Second ），將第一管樣品放到檢測區(qū)，在AcquisitionControl窗口中，將Setup改成Setup ，此時CellQuest會自動顯示YourFolder文件名為資料文件名。點擊“ Acquire ”便可啟動樣品之分析測定與數(shù)據(jù)儲存。當(dāng)計算機(jī)成功地收取足夠數(shù)據(jù)，會自動儲存數(shù)據(jù)文件文件名.001 ，并會以“嘟”聲告知，CellQuest會自動升冪附加檔名成文件名 .002 。等待下一指示。7）換上超純水，清洗管路，直到Counters 持續(xù)顯示 0/Second30s(約為 10-20s) ，換上下一管樣品，點擊“Acquire ”啟動樣品之分析測定與數(shù)據(jù)儲存。可繼續(xù)分析直到所有檢品都分析完畢。七、退出軟件并關(guān)機(jī)1）. 檢品分析完畢后，記得從屏幕上方File指令欄選擇SaveAs，儲存實驗文件，以備日后使用，不需每次重新編輯。2）檢品分析完畢后，用鼠標(biāo)從屏幕上方Acquire 指令欄中，選取以斷絕計算機(jī)與儀器間之聯(lián)機(jī)。之后如不分析數(shù)據(jù)，您可退出軟件“DisconnecttoCytometerFile ”“ Quit ”(遇有選項永遠(yuǎn)選擇“Don tsave”