第三代測序技術(shù)單分子實時DNA測序與第二代測序技術(shù)高通量測序技術(shù)簡介

1、第三代測序技術(shù)（單分子實時DNA測0序）與第二代測序技術(shù)（高通量測序技術(shù)）簡介第三代測序技術(shù)（單分子實時DNA測序）與第二代測序技術(shù)（高通量測序技術(shù)）簡 介第三代測序技術(shù)簡介如果有人告訴你用顯微鏡實時觀測單分子DNA聚合酶復(fù)制DNA并用它來測序，你一定會認(rèn)為他異想天開，沒有一點生物的sense。我最初就是這樣認(rèn)為的，然而它不僅可以實現(xiàn)，而且已經(jīng)實現(xiàn)了這個就是被 稱為第三代的測序技術(shù)， Pacific Biosciences 公司推出的“ Single Molecule Real Time（SMRT DNA Sequencing ” （單分子實時 DNA測序）。我有幸在NIH聽到了這個技術(shù)發(fā)明人

2、Stephen Turner博士的講座，根據(jù)自己 粗淺的理解記錄整理一下。要實現(xiàn)單分子實時測序，有三個關(guān)鍵的技術(shù)。第一個是熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸。顯微鏡現(xiàn)在再厲害，也不可能真的實時看到 “單分子”。但是它可以實時記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻 入DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在 DNA鏈上探測到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵 的時候，它的熒光基團(tuán)就被 DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷 酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。第二個是納米微孔。因為在顯微鏡實時記錄 DNA鏈上的熒光的時候，DNA鏈周 圍的眾多的熒光

3、標(biāo)記的脫氧核苷酸形成了非常強(qiáng)大的熒光背景。這種強(qiáng)大的熒光背 景使單分子的熒光探測成為不可能。 Pacific Biosciences 公司發(fā)明了一種直徑只 有幾十納米的納米孔zero-mode waveguides (ZMWs)，單分子的DNA聚合酶被固 定在這個孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周圍的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸有限，而且 由于A，T，C, G這四種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸非?？焖俚貜耐饷孢M(jìn)入到孔內(nèi)又出 去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號。而當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻 入到DNA鏈時，這種特定顏色的熒光會持續(xù)一小段時間，直到新的化學(xué)鍵形成，熒 光基團(tuán)被DNA聚合酶切除為止(見圖)。1

4、第三個是共聚焦顯微鏡實時地快速地對集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時進(jìn)行記錄。由于我對顯微原理的物理知識匱乏，而Pacific Bioscie nces公司又沒有非 常強(qiáng)調(diào)在這方面的發(fā)明，不做進(jìn)一步探討他們還對這一技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。第一個是把雙鏈DNA環(huán)化反復(fù)測序。人們可以在雙鏈 DNA勺兩頭連上發(fā)夾結(jié)構(gòu) 的DNA adaptor，從而使DNA環(huán)化。而DNA聚合酶就能夠以環(huán)化的 DNA乍為模板滾環(huán)復(fù)制，反復(fù)測一段DNA序列。這種反復(fù)測序，糾正了偶爾出現(xiàn)的復(fù)制錯誤，從而 使測序精度非常高。第二個是激發(fā)光中斷測序法。DNA聚合酶雖然很穩(wěn)定，但是在強(qiáng)大的激發(fā)光作 用下酶也是有一定壽命的。如果把激發(fā)光

5、中斷一段時間，在這段時間內(nèi)DNA聚合酶繼續(xù)復(fù)制DNA當(dāng)激發(fā)光重新開啟以后，人們就可以測到長DNA鏈后面的序列。第三代測序技術(shù)非?？膳隆?、它實現(xiàn)了 DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個堿基，測序速度是化學(xué)法測序的 2萬倍。2、它實現(xiàn)了 DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（ 延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片2段），一個反應(yīng)就可以測非常長的序列。 二代測序現(xiàn)在可以測到上百個堿基， 但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常 好的條件。 3、它的精度非常高，達(dá)到 99.9999%。此外，它還有兩個應(yīng)用是二代測序所不具備的。第一個是直

6、接測RNA勺序列。既然DNA聚合酶能夠?qū)崟r觀測，那么以 RNA為模 板復(fù)制DNA勺逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。RNA勺直接測序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生 的系統(tǒng)誤差。第二個是直接測甲基化的 DNA序列。實際上DNA聚合酶復(fù)制A T、C G的速 度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時間不同。根 據(jù)這個不同的時間，可以判斷模板的 C是否甲基化。Pacific Biosciences 公司預(yù)計 2010年或者 2011 年就會推出商業(yè)化的測序儀 器。在不遠(yuǎn)的將來，如果他們能和二代測序一樣集成100萬個納米微孔，那么一臺儀器 15分鐘就能夠準(zhǔn)確地測出一個人的基因組。以后每個人的基因組

7、測序成本將 變成 100美元，人人都可以消費得起。想想人類基因組計劃耗資 30億美元，費時 十幾年，無數(shù)科學(xué)家參與其中，技術(shù)的革新意義是多么重大啊高通量測序技術(shù)一一第二代測序技術(shù)illumma*4545 EQ UENC tNGApptied BlosyStems高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條 DNA分子進(jìn)行序列測定，因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測序技術(shù)(nextgen eration seque ncin g)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。自從

8、2005年454 Life Sciences 公司(2007年該公司被Roche正式收購)推出 了 454 FLX焦磷酸測序平臺(454 FLX pyrosequencing platform)以來，曾推出過33730x1 DNA 測序儀(3730x1 DNA Analyzer) 的 Applied BioSystem(ABI) 這家一 直占據(jù)著測序市場最大份額的公司的領(lǐng)先地位就開始動搖了，因為他們的拳頭產(chǎn)品 毛細(xì)管陣列電泳測序儀系列(series capillary array electrophoresis seque ncing machi nes)遇到了兩個強(qiáng)有力的競爭對手，一個就是羅

9、氏公司 (Roche)的454測序儀(Roch GS FLX sequencer)，另一個就是2006年美國Illumina 公司推出的Solexa基因組分析 平臺(Ge nome An alyzer platform)，為此，2007年ABI公司推出了自主研發(fā)的 SOLiD測序儀(ABI SOLiD sequencer)。這三個測序平臺即為目前高通量測序平臺 的代表。(見表一)公司名稱技術(shù)原理技術(shù)開發(fā)者商業(yè)模式Apply基于磁珠的大規(guī)美國Agencourt私人基上市公司：Biosystems(ABI)模并行克隆連接因組學(xué)公司(APG)銷售設(shè)備和試劑獲DNAW序法取利潤川umina 合成測序法

10、 英國Solexa公司首席科上市公司學(xué)家 David Bentley 銷售設(shè)備和試劑獲取利潤 Roche 大規(guī)模并行焦磷美國 454 Life Sciences 上市公司 :酸合成測序法 公司的創(chuàng)始人 Jonathan 銷售設(shè)備和試劑獲Rothberg 取利潤 Helicos 大規(guī)模并行單分美國斯坦福大學(xué)生物工上市公司 :2007 年 5子合成測序法 程學(xué)家 Stephen Quake 月首次公開募股(IPO) Complete DNA 納米陣列與美國 Complete 私人公司 : 投資額為 Genomics 組合探針錨定連Genomics公司首席科學(xué)4650萬美元接測序法 家 radoje

11、 drmanac表一: 主流測序平臺一覽 這些平臺共同的特點是極高的測序通量，相對于傳統(tǒng)測序的 96道毛細(xì)管測 序，高通量測序一次實驗可以讀取 40 萬到 400萬條序列。讀取長度根據(jù)平臺不同 從425bp到450bp,不同的測序平臺在一次實驗中，可以讀取1G到14G不等的堿基數(shù)，這樣龐大的測序能力是傳統(tǒng)測序儀所不能比擬的。盡管如此，在這項新的劃 時代的測序技術(shù)剛出現(xiàn)的時候，科學(xué)界對這項新技術(shù)卻并不熱衷。許多習(xí)慣用桑格 技術(shù)的科學(xué)家懷疑新技術(shù)的準(zhǔn)確度、閱讀能力、成本消費、實用性。代理 Sanger 型測序硬件的經(jīng)銷商害怕其投資失敗而首先提出了這些懷疑。UUWi? *4K止* iI1!i CHN

12、3 4嶼* |MTIflflfl rkiiim- jphh iM " KJ haHBw、euLm finr -e-itjrpvjtfjrc" 1r d口H MR 也Anij；#|! 44 ,*rr" .jt.e圖一：在芯片上進(jìn)行的測序：lllumina測序平臺然而大多數(shù)人卻忽略了一個事實，即桑格技術(shù)的普及最初也遇到同樣的阻礙。桑格技術(shù)剛開發(fā)出來時，閱讀能力很難超過25bp,即使在Fred San ger雙脫氧終止法發(fā)明后也只達(dá)到80bp,如今卻達(dá)到了 750bp;而新發(fā)展的合成測序技術(shù)，應(yīng)用 焦磷酸測序方法，其閱讀能力最初只有100bp,推向市場16個月后增加至2

13、50bp,隨著技術(shù)的不斷完善，目前已達(dá)到了400bp,很快就接近桑格技術(shù)目前的水平。除了閱讀能力外，能否以有限的成本用一臺儀器產(chǎn)生足夠數(shù)量的序列標(biāo)記也是另一個 需要改善的重要問題。這個問題已經(jīng)被Roche公司解決了，應(yīng)用他們的系統(tǒng)，僅花費閱讀35bp或者更小片段的成本就能產(chǎn)生比35bp多10倍的序列標(biāo)記。5I «ti I I in nKrii!'i圖二:GS FLX高通量測序方法原理示意圖一、高通量測序的應(yīng)用高通量測序可以幫助研究者跨過文庫構(gòu)建這一實驗步驟，避免了亞克隆過程中 引入的偏差。 依靠后期強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析能力，對照一個參比基因組 (reference genom

14、e) 高通量測序技術(shù)可以非常輕松完成基因組重測序 (resequence) ， 2007年 van Orsouw 等人結(jié)合改進(jìn)的 AFLP 技術(shù)和 454 測序技術(shù)對玉 米基因組進(jìn)行了重測序，該重測序?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)的超過75%勺SNP位點能夠用SNPWave技術(shù)驗證，提供了一條對復(fù)雜基因組特別是含有高度重復(fù)序列的植物基因組進(jìn)行多 態(tài)性分析的技術(shù)路線。 2008年 Hillier 對線蟲 CB4858 品系進(jìn)行 Solexa 重測序， 尋找線蟲基因組中的SNP位點和單位點的缺失或擴(kuò)增。但是也應(yīng)該看到，由于高通 量測序讀取長度的限制，使其在對未知基因組進(jìn)行從頭測序 (novo sequencing) 的

15、 應(yīng)用受到限制，這部分工作仍然需要傳統(tǒng)測序 (讀取長度達(dá)到 850 堿基)的協(xié)助。 但是這并不影響高通量測序技術(shù)在全基因組mRN表達(dá)譜，microRNA表達(dá)譜，ChlP-chip以及DNA甲基化等方面的應(yīng)用。2008年Mortazavi等人對小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進(jìn)行了 RNA深度測序， 這項工作展示了深度測序在轉(zhuǎn)錄組研究上的兩大進(jìn)展，表達(dá)計數(shù)和序列分析。對測 得的每條序列進(jìn)行計數(shù)獲得每個特定轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量，是一種數(shù)碼化的表達(dá)譜檢 測，能檢測到豐度非常低的轉(zhuǎn)錄本。分析測得的序列，有大于90%的數(shù)據(jù)顯示落在已知的外顯子中，而那些在已知序列之外的信息通過數(shù)據(jù)分析展示的是從未被報道 過的RNA剪切

16、形式，3'端非翻譯區(qū)，變動的啟動子區(qū)域以及潛在的小RNA前體，發(fā)現(xiàn)至少有 3500 個基因擁有不止一種剪切形式。而這些信息無論使用芯6片技術(shù)還是SAGE文庫測序都是無法被發(fā)現(xiàn)的。高通量測序另一個被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子 RNA或非編碼RNA(ncRNA研究。 測序方法能輕易的解決芯片技術(shù)在檢測小分子時遇到的技術(shù)難題 (短序列，高度同 源)，而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測序的長度，使得數(shù)據(jù)“不浪費”，同時測序方法還能在實驗中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA在衣藻、斑馬魚、果蠅、線蟲、人和黑猩猩中都已經(jīng)成功地找到了新的小分子 RNA在線蟲中獲得了 40萬 個序列，通過分析發(fā)現(xiàn)了 18個新的

17、小RNA分子和一類全新的小分子 RNA在DNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究上，染色質(zhì)免疫沉淀一深度測序(ChlP-seq)實驗也展示了其非常大的潛力。染色質(zhì)免疫沉淀以后的DNA直接進(jìn)行測序，對比refseq可以直接獲得蛋白與DNA吉合的位點信息，相比ChlP-chip，ChlP-seq可以檢 測更小的結(jié)合區(qū)段、未知的結(jié)合位點、結(jié)合位點內(nèi)的突變情況和蛋白親合力較低的區(qū)段。圖 三：Independent Flow Cells(SoLidTM System)二、高通量測序的前景目前，大多分析家都無法相信新一代測序技術(shù)能完全取代目前的芯片測序技術(shù)。不過，有些分析家也的確認(rèn)為芯片測序技術(shù)正面臨著挑戰(zhàn)，他們認(rèn)為

18、到了2012年新一代的測序技術(shù)將會帶來高達(dá) 2。15億美元的產(chǎn)值。2006年，整個芯片測序市場大概價值 8億美元，其中65%勺市場份額都是有關(guān) 基因表達(dá)譜分析產(chǎn)品的，剩下35%勺市場份額則由基因型分析芯片占據(jù)。不過美國 哈佛大學(xué)(Harvard University)遺傳學(xué)教授George Church認(rèn)為，這部分市場也會受到新一代測序技術(shù)的沖擊。重測序芯片 (resequencing arrays) 、單核 苷酸多態(tài)性分析芯片以及基因拷貝數(shù)目變異分析芯 (copy number variant array) 市場也會受到影響。也有分析家不贊同這個觀點，他們認(rèn)為即使新一代測序技術(shù)很 便宜，還是

19、有不少人會選擇傳統(tǒng)的測序儀的。新一代測序技術(shù)相對傳統(tǒng)芯片測序技術(shù)的優(yōu)勢，最終還得依靠廣告和市場營銷 手段的推廣才能獲得大眾的認(rèn)可。去年夏天，由 Frost & Sullivan 公司對學(xué)術(shù)科 研機(jī)構(gòu)和私人研究團(tuán)體進(jìn)行的一項調(diào)查研究結(jié)果表明，在實際應(yīng)用領(lǐng)域，例如進(jìn)行 表達(dá)譜分析時，人們還是傾向于選擇傳統(tǒng)的芯片產(chǎn)品，而并非青睞新一代的測序產(chǎn) 品。新一代測序儀推廣困難可能由其價格昂貴導(dǎo)致。平均采購一臺新一代測序儀大 約要花費 50 萬美元，除非該實驗室測序的工作量非常大，否則是不會考慮購買 的。即使像 Polonator 這樣的新一代測序儀也需要花費 15 萬美元左右，這筆費用 對于一個小實

20、驗室來說是無法承受的。這時，只需要 150 美元一塊的芯片就非常有 競爭力了。以基因芯片產(chǎn)品享譽業(yè)界的美國 Affymetrix 公司市場部副總裁 Jay Kaufma n認(rèn)為，新一代測序技術(shù)對于芯片市場來說的確會帶來一定的沖擊，不過要 完全取代表達(dá)譜分析芯片還需要一定的時間。但是，基因芯片也有其自身的缺點，就在于它是一個“封閉系統(tǒng)”，它只能檢 測人們已知序列的特征 ( 或有限的變異 ) 。而高通量測序的強(qiáng)項， 就在于它是一個 “開放系統(tǒng)”， 它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力，從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。 研究者可以充分享受這兩個平臺的比較優(yōu)勢，在獲取新信息的基礎(chǔ)上，利用芯片的 強(qiáng)項， 即對已知信息

21、的高通量、低成本 ( 相對)的檢測能力， 對大量樣品進(jìn)行快速 檢測，短時間內(nèi)獲得有大量有效的數(shù)據(jù)。作為兩個高通量的基因組學(xué)研究技術(shù)，在應(yīng)用的某些方面存在重疊和競爭，但 是在更多方面是優(yōu)勢互補(bǔ)，兩種方法聯(lián)合使用，將解決以前的單種技術(shù)難以解決的 問題。三、結(jié)語 新一代測序已顯示出巨大的潛力。也正是因為科學(xué)的不斷進(jìn)步，在給測序技術(shù) 提出新要求的時候，也給這項技術(shù)帶來了新的增長點 :82008年 4月 Helico BioScience 公司的 Timothy 等人在 Science 上報道了他們 開發(fā)的真正的單分子測序技術(shù)，也被稱為第三代測序技術(shù)，并利用該技術(shù)對一個 M13病毒基因組進(jìn)行重測序。這項

22、技術(shù)之所以被稱為真正的單分子測序，是因為它 完全跨過了上述3種高通量測序依賴的基于PCRT增的信號放大過程，真正達(dá)到了 讀取單個熒光分子的能力，向 1 000美元測定一個人類基因組的目標(biāo)邁出了一大 步?；诎雽?dǎo)體技術(shù)的納米孔測序技術(shù)技術(shù)在新型測序技術(shù)中的重要作用。新一代測序技術(shù)，即第三代測序技術(shù)，不同于前兩代測序，第一代測序技術(shù)是 雙脫氧鏈末端終止法根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機(jī)在某一個特定的堿 基處終止，產(chǎn)生A, T，C, G四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的 PAGE交上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得 DNA序列。第二代測序技術(shù)是焦磷酸測序法一 由 4 種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級

23、聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，適于對已知的短序列的 測序分析。而第三代測序技術(shù)則是基于納米孔的單分子讀取技術(shù)，這種方法讀取數(shù)據(jù)更 快、有望大大降低測序成本，改變個人醫(yī)療的前景。這一技術(shù)的研發(fā)是系統(tǒng)工程， 涉9及生物、半導(dǎo)體、計算機(jī)、化學(xué)、光學(xué)等多個領(lǐng)域，需要不同學(xué)科頂尖力量的 合作。Scie nee文章重點提到了其中的半導(dǎo)體技術(shù)，離子激流公司(Ion Torre nt) 的測序儀就是一種硅芯片，是利用與半導(dǎo)體一樣的方式構(gòu)建的，利用這種技術(shù)，科學(xué)家 們在Scienee雜志上公布了三個低成本的完整人類基因組序列。這種高質(zhì)量，低成本(文章還報道了不同樣本的測序成本，包括了從 $8,005(87x coverage)至U $1,726(45x coverage)的范圍)的基因組測序方法能幫助研究人員對成千上百個某 種疾病患者的完整基因組序列進(jìn)行分析，從而獲得對這種疾病的深入了解，最終找 出預(yù)防和治療的方法?；诎雽?dǎo)體技術(shù)的納米孔測序技術(shù)，DNA分子依靠被稱