重組結(jié)核分枝桿菌Mr38000蛋白的表達(dá)、純化和鑒定

1、重組結(jié)核分枝桿菌mr38000蛋白的表達(dá)、純化和鑒定摘要從h37rv基因組中擴增m138000蛋白基因并高效 表達(dá)和純化。用pcr技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌it37rv基因組中 擴增壯38000蛋白序列，將其與pgem-t-easy載體連接轉(zhuǎn) 化dh5a ,構(gòu)建重組克隆載體pgem-t-easy/mr38000，測序 正確后將目的基因片斷克隆入pqe-80l原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn) 化dh5a, iptg誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。經(jīng)west ern-blot鑒定 目的基因與(his) 6融合表達(dá)，將已表達(dá)的蛋白質(zhì)通過ni-n ta親和色譜柱進(jìn)行純化。pcr得到結(jié)核分枝桿菌mr38000 蛋白基因，測序結(jié)果與geban

2、k中報道的完全一致。sds-p age顯示，在mr為x103處有相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，wes ernblot鑒定為(his)6融合表達(dá)蛋白。經(jīng)ni-nta親和色譜 柱進(jìn)行純化后可得到純化的蛋白。成功克隆了鐵調(diào)節(jié)蛋白 基因mr38000蛋白序列，并在dh5 a高效表達(dá)，親和層析后 獲得了純化目的蛋白。關(guān)鍵詞mr3800 0蛋白；表達(dá);純化;結(jié)核分枝桿菌；c loning, exp ressionand purificati onofmr3800 oproteinfrommycoba cteriumtub erculosiszhangming , lijin-che ng, linhang(dep

3、artm entofinter nalneurolo gy, 2. emergencydepart merit, thefu zhougeneralhospital,fuzhou, 350 025, p. r. ch ina)abs tracttoob tainmycoba cteriumtub erculosismr38000prot entlyine c ooproteins dbypcrfrom easyeinfromh37rv-dna, expressefficioliandpurifythemr380mr38000proteingenewasamplifiethegenomeo fh

4、37rvandc lonedintop gem-t-vector. aftersequence d, mr38000proteingenewasrecombi restrictio mr38000. th sformedint roteinexpr confirmedb abagainst ( nticalwith ooovectore eculeweighnatedexprenenzymedigeplasmidpqodh5 a an dinessionwasaywesternblhis)6.mr38gebankrepoxpressedprtaboutkd, wssionvectoestion

5、, name-80l-mr38rpqe-80lbyedpqe80l-ooowastranducedbylpt nalyzedbys otwithmice oooprotein rted.thepqg.mr38000pds-pageand -specificm genewasidee-80l-mr38oteinwithrhichcouldbelativemolecaughtby(his)6mabt heexpresse dproteinco uldbepurif iedbyni-nt asystemkit withdenati veconditio n. mr38000p roteingene

6、hadbeensuc cessfullyc lonedandef ficientlye xpressedin ,theresult sestablishedthebasisforfurthetstudyofthefunctionofmr38000pro tein.ke ywordsmr3 8000protei n;expressi onjpurific ation;myco bacteriumt uberculosi s (mtb)結(jié)核分枝桿菌(mycob acteriumtu berculosis , mtb) 是結(jié)核病(tuberculos is, tb)的病原體。其在患者體內(nèi)主要 為細(xì)胞

7、內(nèi)生長。診斷方法的欠缺是結(jié)核病流行的重要原因。 目前常用的ppd試驗，常使bc g疫苗接種者被誤檢為陽性 1,且對后期結(jié)核患者敏感性較低，存在明顯不足。近年 來，有研究發(fā)現(xiàn)mr38 000蛋白具有強的免疫原性，而成為 結(jié)核分枝桿菌抗原的研究熱點2,3,可能成為結(jié)核病血清 學(xué)診斷試劑和疫苗研究的候選抗原之一。為此，我們在原 核表達(dá)載體中表達(dá)結(jié)核分枝桿菌mr3800 0蛋白并對其進(jìn)行 了純化，為進(jìn)一步研究其抗原性和主要功能提供方便。1材料和方法材料mtb毒株h37 rv、dh5 a由本室保存;pgem-t-easy 及 wizar dpluspurif icationsys tem 購自 prom

8、e ga 公司； x-gal ,限制性內(nèi)切酶bam h 1 , ecor i及t 4-dna連接酶, t aqdna聚合酶均為takara公司產(chǎn)品;iptg, dtt, dte,小量 質(zhì)粒提取試劑盒均為sigma公司產(chǎn)品，膠回收試劑盒為 vitagene公司產(chǎn)品。方法引物的設(shè)計與合成根據(jù)己發(fā)表的mtbh37r v全基因組 mr380 00蛋白基因序列設(shè)計引物。上游引物pl:5'- aggggat ccgcgaaaat tcgtttgcat acgct-3，含陥mh i 酶切 位點和起始密碼子，下游引物p2:5，-gatg aattcacgga ggttgctgtc gcgtggtg-3

9、，中加入ecor i酶切位點。引物由 上海生工生物技術(shù)有限公司合成。mr3800 0片段的擴增取保存于改良羅氏培養(yǎng)基的mt bh37rv接種于7 h9液體培養(yǎng)基，37 °c間或振蕩培養(yǎng)23w ko 取5ml液體培養(yǎng)物的菌體沉淀重懸于5 opl裂解液(10x pcr 綬沖液 5 u l, 45g/l 吐溫，5 u l, 45g/l, np -405 nl, 20g /l蛋白酶kpl及水ul)中。于55°c水浴lh,沸水浴 10m in滅活蛋白酶k,離心取上清，用酚/氯仿抽提，無水 乙醇沉淀，溶于50 h lte中，作為dna模板。pc r反應(yīng)體 系為:loxbuffer5 u

10、 l, dntps5 u l(/l) > dna 模板為 1 ul, pl, p2 引物各 1 ul(25nmo l/l)及 taq 酶 1 ul,加水至 50ul o pcr 條件：94°c變性 40s, 60°c復(fù)性 30s, 72°c延 伸min, 30個循環(huán)。pcr產(chǎn)物的克隆與鑒定pcr產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳回收 dn a條帶。取純化的pc r產(chǎn)物與質(zhì)粒pgem -easy進(jìn)行連 接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)dh5a，均勻涂布于含有x-gal (33 n l) 和異丙基b-d硫代半乳糖昔iptg(20pl)的培養(yǎng)皿中， 37°c培養(yǎng)16 h,挑取白色菌

11、落進(jìn)行酶切鑒定，所獲陽性克 隆命名為pgem-t -easy-mr38 000,送至上海生工生物工程 有限公司進(jìn)行序列測定。目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)bam hi和ecor i雙酶切后與經(jīng) 同樣酶切的p qe-80l載體進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)dh5 a , 挑取的陽性克隆命名為pqe-8 0l-mr38000。在含有氨節(jié)青 霉素（100mg/l）的l b培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)p qe-80l-mr3 8000o按10%的接種量進(jìn)行轉(zhuǎn)接，37 °c搖菌3h,加入異丙 基b -d硫代半乳糖昔（iptg）至終濃度為mmol/l, 37 °c繼續(xù) 培養(yǎng)45h0取ml細(xì)菌培養(yǎng)物，80 00g離

12、心30s收集菌體， 加入2x樣品緩沖液劇烈振蕩混勻，1 00°c,5min; 8 000g 離心5min ；取上清進(jìn)行sds-page電泳檢測。目的蛋白的west ernblot分析將經(jīng)誘導(dǎo)的pqe-80 l- mr38000和dh5a分別制樣,進(jìn)行12%sdspa ge后以ma恒 流電轉(zhuǎn)2h至硝酸纖維素膜上，用50g/l脫脂奶封閉2h, pbs洗滌后加抗his的單克隆抗體（1:5000稀釋）4°c過夜， pbs洗滌后加入hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg抗體，37°c孵育lh。 pb s洗滌后dab顯色觀察結(jié)果。目的蛋白的可溶性分析大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，誘導(dǎo)表達(dá)目 的蛋白，收集

13、細(xì)菌，超聲破菌。離心后將上清和沉淀分別 制樣，進(jìn)行s ds-page分析。目的蛋白的純化根據(jù)ni-nta試劑盒的說明書，將融合 蛋白與ni-nta結(jié)合，用不同ph值咪卩坐溶液進(jìn)行洗脫，得 到純化產(chǎn)物。2結(jié)果mr3 8000蛋白片段的擴增及序列測定經(jīng)30個循環(huán)pcr 擴增，可得與預(yù)計長度相等的片斷（圖1）。將dna回收后 插入pgem-t -easy載體，經(jīng)測序證實所擴增的mr3 8000序 列與geb ank數(shù)據(jù)庫所收錄的mr38000序列完全一致。m:dnam arkerdl200 0;l:mr3800 0 基因 pcr 產(chǎn)物；圖1pcr擴增mr 38000蛋白基因產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 （10

14、g/l）結(jié)果表達(dá)載體的構(gòu)建pqe-80l經(jīng)bamhi和ecor i雙酶切后 與mr38000基因目的片斷進(jìn)行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)dh5 a o挑取的克隆子進(jìn)行酶切鑒定，切出約115 lbp大小片段 的為陽性克隆子（圖2）,命名為pqe-80l-mr38000om:dnamarke rdl2000; 1, 2:pqe-80l 一 mr38000;圖 2pqe-80l-mr38000 重組質(zhì)粒 bamhi 和 eco r i 雙酶 切鑒定結(jié)果mr38000蛋白在pqe-80l表達(dá)載體中的誘導(dǎo)表達(dá)將p qe-80l-mr3 8000經(jīng)37°c活化過夜，經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)后做 sds-pa

15、 ge分析，從電泳圖中可以看出在mr為x1 03 一致 處出現(xiàn)了一條表達(dá)帶，表達(dá)量約占菌體總蛋白的20%（圖3）。m：蛋白分子量marker: 1 :未誘導(dǎo)的pqe8 0l-mr38000質(zhì)量重組菌dh5c（；2-4:誘導(dǎo)的p qe-80l-mr3 8000質(zhì)量重組菌dh5a ；圖3(h is) 6-mr380 00融合蛋白的sds -page分析目的蛋白的鑒定所構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)的mr3 8000蛋 白以帶有6個組氨酸的融合蛋白的形式出現(xiàn)，使用鼠抗( his)6mab驗證mr38000蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示在mr為x 103處有一顯色帶，而對照無相應(yīng)條帶(圖4)。m :蛋白分子量 marker

16、 ; 1: (his) 6- mr38000pro teinexpres sion2. dh5 a圖4(his)6 -mr38000融合蛋白的western blot分析結(jié) 果目的蛋白的可溶性分析將上清和沉淀分別所制樣品， 進(jìn)行sds-p age分析表明表達(dá)產(chǎn)物主要在細(xì)菌裂解后的沉淀 中，而上清中則很少(圖5)。m：蛋白分子量marke r; 1:未誘導(dǎo)的pq e-80lmr38 000 質(zhì)量重組菌dh5a ；2：誘導(dǎo)菌超聲裂解后沉淀;3:誘導(dǎo)菌超聲裂解后上清；圖5(his)6-mr38000融合蛋白的可溶性分析目的蛋白的純化純化的產(chǎn)物經(jīng)sds-pa ge分析可在mr 為x103處得到一條清晰

17、的條帶(圖6)。m：蛋白分子量mar ker;l:未誘導(dǎo)的pqe-80l-mr 38000 質(zhì)量重組菌dh5c(；2:誘導(dǎo)的pqe-80l- mr38000質(zhì)量重組菌dh5 a ； 3, 4 : (his) 6-mr 38000 純化蛋白圖6(his)6-mr38000融合蛋白的表達(dá)及純化3討論mr38000蛋白是一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，含有對結(jié)核分枝 桿菌特異單克隆抗體定位的7個表位，具有較強的抗原性, 已經(jīng)得到了結(jié)核病研究學(xué)者們的一致認(rèn)可。1992年， bothamley4等認(rèn)為mr380 00蛋白是研究菌陰性肺結(jié)核最 有用的抗原之一。xx年mark5等通過蛋白質(zhì)基因芯片和 病人血清篩選，發(fā)現(xiàn)

18、mr38000蛋白是空洞性肺結(jié)核所特有 的蛋白抗原。本實驗中應(yīng)用的pqe-80l表達(dá)載體為47 51bp,起始碼 下游接有6個組氨酸，雙鏈環(huán)狀，amp抗性，多克隆位點有 17個單一限制性酶切位點。pc r產(chǎn)物共有約1150 bp,與 mr3800 0蛋白基因大小相符合。mr38000克隆入pqe-80l載 體中與6個組氨酸融合，可產(chǎn)生共約390個氨基酸的融合 蛋白，mr為x103左右，實驗結(jié)果與理論值相符合。融合 蛋白有(his) 6的表達(dá)，因此通過檢測組氨酸的表達(dá)，可間 接證明mr38000蛋白表達(dá)，同時(hi s)6的表達(dá)為進(jìn)一步純 化蛋白提供了親和位點，它可與ni+特異性結(jié)合，通過ni- n ta親和色譜柱可得到純化的目的蛋白。我們在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的 mr38000蛋白，并進(jìn)行了初步鑒定和純化，為下一步深入研% mr38000蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)l br ittonwj, pa lengira im provingvac cinesagain sttubercul osis j. im munalcellb iol, xx:81 (1) : 34一45.2 worldh ealthorgan izationglo