胰島素基因工程

1、l/o/g/o基因工程法基因工程法獲取人胰島素獲取人胰島素 胰島素概況胰島素概況 胰島素是一種蛋白質(zhì)類激素胰島素是一種蛋白質(zhì)類激素, ,體內(nèi)胰島素是由胰島體內(nèi)胰島素是由胰島細胞分泌的。在人體十二指腸旁邊，有一條長細胞分泌的。在人體十二指腸旁邊，有一條長形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布著許許多多形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布著許許多多的細胞群，叫做胰島。胰島素是由胰島的細胞群，叫做胰島。胰島素是由胰島細胞受細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素激素 胰島素

2、是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。作用同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。作用機理屬于受體酪氨酸激酶機制機理屬于受體酪氨酸激酶機制人工合成胰島素的必要性人工合成胰島素的必要性 胰島素這類活性蛋白多肽和細胞因子居有胰島素這類活性蛋白多肽和細胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立體結(jié)構(gòu)異高度生物活性，分子量很大，立體結(jié)構(gòu)異常復雜，體外難以人工合成。所以過去糖常復雜，體外難以人工合成。所以過去糖尿病患者只能服用從牛、豬體中提取的胰尿病患者只能服用從牛、豬體中提取的胰島素來治療；但牛、豬胰島素結(jié)構(gòu)上與人島素來治療；但牛

3、、豬胰島素結(jié)構(gòu)上與人胰島素有差別，如與豬胰島素胰島素有差別，如與豬胰島素b鏈第鏈第30個基個基酸殘基不同，長期服用會引起腎和眼的疾酸殘基不同，長期服用會引起腎和眼的疾病，故必需要用基因工程方法獲得重組人病，故必需要用基因工程方法獲得重組人胰島素進行治療。胰島素進行治療。 胰島素結(jié)構(gòu)胰島素結(jié)構(gòu)胰島素由胰島素由a、b兩個肽鏈組成。人胰島素兩個肽鏈組成。人胰島素a鏈有鏈有11種種21個氨基酸，個氨基酸，b鏈有鏈有15種種30個氨基酸個氨基酸，共，共26種種51個氨基酸組成。其中個氨基酸組成。其中a7(cys)-b7(cys)、a20(cys)-b19(cys)四個半胱氨酸中的四個半胱氨酸中的巰基巰基

4、形成形成兩個兩個二硫鍵二硫鍵，使，使a、b兩鏈連接起來。此外兩鏈連接起來。此外a鏈中鏈中a6(cys)與與a11(cys)之間也存在一個之間也存在一個二硫鍵二硫鍵 胰島素立體結(jié)構(gòu)胰島素立體結(jié)構(gòu)胰島素的性質(zhì)胰島素的性質(zhì) 化學本質(zhì)化學本質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子式分子式c257h383n65o77s6分子量分子量5807.69性狀性狀白色或類白色的結(jié)晶粉末白色或類白色的結(jié)晶粉末熔點熔點233（分解）（分解）比旋度比旋度-648(c=2,0.003mol/l naoh)溶解性溶解性在水、乙醇、氯仿或乙醚中幾乎不溶；在礦酸（無機酸）在水、乙醇、氯仿或乙醚中幾乎不溶；在礦酸（無機酸）或氫氧化堿溶液中易溶或氫氧化

5、堿溶液中易溶酸堿性酸堿性兩性，等電點兩性，等電點pi5.35-5.45 胰島素的英文縮寫，胰島素的英文縮寫，ins. （insulin）胰島素的發(fā)現(xiàn)胰島素的發(fā)現(xiàn) 胰島素于胰島素于1921年由加拿大人年由加拿大人f.g.班廷和班廷和c.h.貝斯特首先發(fā)貝斯特首先發(fā)現(xiàn)現(xiàn) 1955年英國年英國f.桑格小組測定了牛胰島素的全部氨基酸序列桑格小組測定了牛胰島素的全部氨基酸序列 1965年年9月月17日，中國科學家人工合成了具有全部生物活日，中國科學家人工合成了具有全部生物活力的結(jié)晶牛胰島素，它是第一個在實驗室中用人工方法合力的結(jié)晶牛胰島素，它是第一個在實驗室中用人工方法合成的蛋白質(zhì)成的蛋白質(zhì) 胰島細胞根

6、據(jù)其分泌激素的功能分為以下幾種：胰島細胞根據(jù)其分泌激素的功能分為以下幾種： b細胞細胞(細胞細胞)，約占胰島細胞的，約占胰島細胞的60%80%，分泌胰島素，胰島素分泌胰島素，胰島素可以降低血糖?？梢越档脱?。 a細胞細胞(細胞細胞)，約占胰島細胞的，約占胰島細胞的24%40%，分泌胰升糖素，胰升，分泌胰升糖素，胰升糖素作用同胰島素相反，可增高血糖。糖素作用同胰島素相反，可增高血糖。 d細胞，約占胰島細胞總數(shù)的細胞，約占胰島細胞總數(shù)的6%15%，分泌生長激素抑制激素。，分泌生長激素抑制激素。 胰島素生物合成胰島素生物合成 胰島素生物合成的控制基因在胰島素生物合成的控制基因在第第1111對染色體短

7、臂對染色體短臂上。在上。在細胞的細胞核中，第細胞的細胞核中，第1111對染色體短臂上對染色體短臂上胰島素基因區(qū)胰島素基因區(qū)dnadna向向mrnamrna轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄，mrnamrna從細胞核移向從細胞核移向細胞漿的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，轉(zhuǎn)譯成由細胞漿的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，轉(zhuǎn)譯成由105105個氨基酸殘基構(gòu)成個氨基酸殘基構(gòu)成的的前胰島素原前胰島素原。前胰島素原經(jīng)過蛋白水解作用除。前胰島素原經(jīng)過蛋白水解作用除其前肽，生成其前肽，生成8686個氨基酸組成的長肽鏈個氨基酸組成的長肽鏈胰島胰島素原素原。胰島素原隨細胞漿中的微泡進入高爾基體，。胰島素原隨細胞漿中的微泡進入高爾基體，經(jīng)蛋白水解酶的作用，切去經(jīng)蛋白水解酶的作用，切去3

8、131、3232、6060三個精氨三個精氨酸連接的鏈，斷鏈生成沒有作用的酸連接的鏈，斷鏈生成沒有作用的c c肽，同時生成肽，同時生成胰島素，分泌到胰島素，分泌到細胞外，細胞外，進入血液循環(huán)中進入血液循環(huán)中。未。未經(jīng)過蛋白酶水解的胰島素原，一小部分隨著胰島經(jīng)過蛋白酶水解的胰島素原，一小部分隨著胰島素進入血液循環(huán)素進入血液循環(huán) 胰島素的分類胰島素的分類 動物胰島素：從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相動物胰島素：從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有1 1個氨基酸不個氨基酸不同，牛胰島素中有同，牛胰島素中有3 3個氨基酸不同，因而易產(chǎn)生抗體

9、個氨基酸不同，因而易產(chǎn)生抗體 半合成人胰島素：將豬胰島素第半合成人胰島素：將豬胰島素第3030位丙氨酸，置換位丙氨酸，置換成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰島素成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰島素 生物合成人胰島素：利用生物工程技術(shù)，獲得的高生物合成人胰島素：利用生物工程技術(shù)，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同物活性與人體本身的胰島素完全相同 怎樣獲得人的胰島素基因？怎樣獲得人的胰島素基因？怎樣將目的基因?qū)氲绞荏w細胞中？怎樣將目的基因?qū)氲绞荏w細胞中？怎樣將重組質(zhì)粒導入到受體細胞中？怎

10、樣將重組質(zhì)粒導入到受體細胞中？目的基因是否在受體細胞中表達？目的基因是否在受體細胞中表達？4123一、提取目的基因一、提取目的基因基因的剪刀基因的剪刀限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 作用與特性：一種酶只能識別一種特定的核苷作用與特性：一種酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的內(nèi)切點切割酸序列，并在特定的內(nèi)切點切割dna分子。分子。重播重播限制性內(nèi)切酶既從人的既從人的dna中提取胰島素基因中提取胰島素基因,可使用限制可使用限制性內(nèi)切酶將目的基因從原性內(nèi)切酶將目的基因從原dna中分離。中分離。 二、提取質(zhì)粒二、提取質(zhì)粒 使用細胞工程使用細胞工程,培養(yǎng)大腸桿菌，從大腸桿菌的培養(yǎng)大腸桿菌，從大腸桿菌的細

11、胞質(zhì)中提取質(zhì)粒，質(zhì)粒為環(huán)狀。細胞質(zhì)中提取質(zhì)粒，質(zhì)粒為環(huán)狀。 質(zhì)粒質(zhì)?；虻倪\載工具基因的運載工具質(zhì)粒是真核細胞質(zhì)粒是真核細胞細胞核細胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠外或原核生物擬核區(qū)外能夠進行自主復制的進行自主復制的遺傳遺傳單位，包括真核生物的單位，包括真核生物的細胞細胞器器（主要指線粒體和葉綠體）中和（主要指線粒體和葉綠體）中和細菌細菌細胞擬核區(qū)以細胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀外的環(huán)狀脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸(dna)分子。（部分為分子。（部分為rna）現(xiàn)在習慣上用來專指細菌現(xiàn)在習慣上用來專指細菌(大腸桿菌）、大腸桿菌）、酵母菌酵母菌和和放放線菌線菌等生物中細胞核或擬核中的等生物中細胞核或擬核中的dna以

12、外的以外的dna分分子。在子。在基因工程基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的中質(zhì)粒常被用做基因的載體載體。許多。許多細菌除了擬核中的細菌除了擬核中的dna外，還有大量很小的環(huán)狀外，還有大量很小的環(huán)狀dna分子分子 三、基因重組三、基因重組取出目的基因與質(zhì)粒，先利用同種限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒切開，再使用dna連接酶將目的基因與質(zhì)?？p合，形成一個能表達出胰島素的dna質(zhì)粒。 基因的針線基因的針線dnadna連接酶連接酶 dna被限制酶切斷后有兩個反向互補的被限制酶切斷后有兩個反向互補的“黏性末端黏性末端”。被同一種限制切。被同一種限制切斷的幾個斷的幾個dna具有相同的黏性末端，能夠通過互補進行配對。具有相同的

13、黏性末端，能夠通過互補進行配對。 連接酶的作用是：將互補配對的兩個黏性連接酶的作用是：將互補配對的兩個黏性末端連接起來，使之成為一個完整的末端連接起來，使之成為一個完整的dnadna分子。分子。重重播播四、將質(zhì)粒送回大腸桿菌四、將質(zhì)粒送回大腸桿菌 為獲得目的基因的表達產(chǎn)物時，通常以大腸桿菌為獲得目的基因的表達產(chǎn)物時，通常以大腸桿菌等無害易得的細菌為受體。等無害易得的細菌為受體。 為使重組的為使重組的dna分子更容易進入受體細胞，常分子更容易進入受體細胞，常還要用一些物質(zhì)（含有還要用一些物質(zhì)（含有ca+的物質(zhì)，如的物質(zhì)，如cacl2 ）對）對受體細胞進行處理，使受體細胞具受體細胞進行處理，使受體

14、細胞具 有更大的通透性。有更大的通透性。導入導入擴增擴增將質(zhì)粒送回大腸桿菌將質(zhì)粒送回大腸桿菌在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有ca+的物的物質(zhì)，如質(zhì)，如cacl2，這使細胞會吸收外源基因。，這使細胞會吸收外源基因。此時將重組的質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中，大腸桿此時將重組的質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中，大腸桿菌便會將重組質(zhì)粒吸收。菌便會將重組質(zhì)粒吸收。 cacl2法的作用機理法的作用機理 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞的制備常用冰預冷的的制備常用冰預冷的cacl2cacl2處理細菌的處理細菌的方法制備，即用低滲方法制備，即用低滲cacl2cacl2溶液在低溫（溶液在低溫（ 00）時處）時處理快速生長的

15、細菌，從而獲得感受態(tài)細菌。此時細理快速生長的細菌，從而獲得感受態(tài)細菌。此時細菌膨脹成球形，外源菌膨脹成球形，外源dnadna分子在此條件下易形成抗分子在此條件下易形成抗dnadna酶的羥基鈣磷酸復合物粘附在細菌表面，通過酶的羥基鈣磷酸復合物粘附在細菌表面，通過熱激作用促進細胞對熱激作用促進細胞對dnadna的吸收。轉(zhuǎn)化效率可達的吸收。轉(zhuǎn)化效率可達106106107107轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子/ /微克微克dnadna。 感受態(tài)細胞（感受態(tài)細胞（competent cell）：）： 理化方法誘導細胞，使其處于最適攝取和容納理化方法誘導細胞，使其處于最適攝取和容納外來外來dna的生理狀態(tài)。的生理狀態(tài)。感受態(tài)

16、細胞制備感受態(tài)細胞制備(cacl2法法)1、取、取70冰凍菌種，用劃線法接種細菌于培養(yǎng)皿，做好標記，冰凍菌種，用劃線法接種細菌于培養(yǎng)皿，做好標記， 于于37培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)過夜。2、第二天，從平板上挑取單個菌落，接種至含有、第二天，從平板上挑取單個菌落，接種至含有3ml lb培養(yǎng)液培養(yǎng)液的試管中，的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜。次日取菌液振蕩培養(yǎng)過夜。次日取菌液1ml接種至含有接種至含有100ml lb培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的500ml燒瓶中，燒瓶中，370c劇烈震蕩培養(yǎng)約劇烈震蕩培養(yǎng)約23小時（小時（200300r/min）3、當菌落、當菌落600nm od值達到值達到0.4-0.5 時，將燒瓶取出放置冰水上時，將燒瓶取出放置冰水上1015分鐘。在無菌條件下把菌液倒入分鐘。在無菌條件下把菌液倒入50ml離心管中。離心管中。4,8000g離心離心10分鐘。分鐘。4、棄上清，將管倒置于干濾紙上、棄上清，將管倒置于干濾紙上1min，吸干殘留的培養(yǎng)液。加，吸干殘留的培養(yǎng)液。加10ml 0.1m的的cacl2到離心管中，振蕩混勻，懸浮菌體，冰浴到離心管中，振蕩混勻，懸浮菌體，冰浴30分鐘。分鐘。5、4,8000g離心離心10分鐘，棄上清，將管倒置于干濾紙上分鐘，棄上清，將管倒置于干濾紙上1min，吸干殘留的培養(yǎng)液吸干殘留的培養(yǎng)液.加