實驗二：淀粉酶活性測定實驗報告3頁

1、淀粉酶活性的測定一、實驗目的酶的活力是酶的重要參數(shù)，反映的是酶的催化能力，因此測定酶活力是研究酶的基礎。酶活力由酶活力單位表征，通過計算適宜條件下一定時間內一定量的酶催化生成產物的量得到。淀粉酶是水解淀粉的糖苷鍵的一類酶的總稱。-淀粉酶是一種典型的內切型淀粉酶,主要作用于淀粉水解的液化階段,因此又叫液化酶。作為一種最重要的工業(yè)酶制劑，-淀粉酶廣泛存在于動物,植物和微生物中。其中，微生物-淀粉酶以其經(jīng)濟易得成為工業(yè)生產主要來源。目前,關于-淀粉酶活性的測定方法很多種。 本實驗采用楊氏改良法測定-淀粉酶；掌握測定-淀粉酶活性大小與溫度關系的方法，通過分析得出酶的最適溫度范圍。二、實驗原理酶促反應中

2、，反應速度達到最大值時的溫度和pH值稱為某種酶作用時的最適溫度和pH值。溫度對酶反應的影響是雙重的：一方面隨著溫度的增加，反應速度也增加，直至最大反應速度為止；另一方面隨著溫度的不斷升高，而使酶逐步變性從而使反應速度降低，其變化趨勢呈鐘形曲線變化。 不同菌株產生的酶在耐熱性、酶促反應的最適溫度、PH、對淀粉的水解程度，以及產物的性質等均有差異。-淀粉酶屬水解酶，作為生物催化劑可隨機作用于直鏈淀粉分子內部的-1,4糖苷鍵，迅速地將直鏈淀粉分子切割為短鏈的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉與碘的反應逐漸消失，這種作用稱為液化作用，生產上又稱-淀粉酶為液化淀粉酶。-淀粉酶不能水解淀粉支鏈的-1,

3、6糖苷鍵，因此最終水解產物是麥芽糖、葡萄糖和-1,6鍵的寡糖。 本實驗通過淀粉遇碘顯藍色，淀粉含量越高，顏色越深。用分管光度計檢測顯色效應大小，通過分管光度值計算酶活力注意：實驗中為了消除非酶促反應引起的淀粉水解帶來的誤差，每組實驗都做了相應的對照實驗，在最終計算酶的活性時以測量組的值減去對照組的值加以校正。在實驗中要嚴格控制溫度及時間，以減小誤差。并且在酶的作用過程中，三支測定管及空白管不要混淆。三、材料、試劑與儀器實驗材料：-淀粉酶儀器：分光光度計、電熱恒溫水浴鍋、小臺秤、研缽、玻璃儀器若干試劑： 0.4M NaOH/0.4M CH3COOH及0.1M HCl： 0.005%工作碘液：0.

4、5克I2和5.0克KI水中研磨，定容至1000mL； 1%糊化淀粉溶液：稱取1.0克淀粉，加入25mL0.4M NaOH，605min，冷卻后加25mL0.4M CH3COOH，定容至100mL； 稀釋-淀粉酶溶液：待測樣品 四、實驗步驟 10mL1%淀粉溶液加入試管中，室溫25/45/65保溫10min于每管中各加酶稀釋液1mL，在室溫25/45/65恒溫水浴中（水浴溫度的變化不應超過±0.5）準確加熱10min，冷卻。加1mL1M鹽酸終止反應。 取上述混合液1mL加入預先裝好10mL工作碘液的試管，搖勻。 660nm測吸光度（蒸餾水調零），記錄數(shù)據(jù)。（注：吸光度測定勿漏空白對照組）對照組為不加酶液，加相應體積的水五、數(shù)據(jù)整理及計算溫度（）254565OD660對照組OD0660 根據(jù)以上的數(shù)據(jù)整理的結果，結合以下公式計算兩種淀粉酶的活性：酶活=(D0-D)*100/D0*10*稀釋倍數(shù)D反應混合液吸光度D0對照組吸光度100系數(shù)(%)10