2019年酶工程復(fù)習(xí)提綱2009

1、酶工程復(fù)習(xí)提綱第二章 酶的定義、組成、特征及分類一、從化化學(xué)本質(zhì)上講酶到底是一種什么物質(zhì)？二、一般催化劑的特性：1. 只能進行熱力學(xué)上允許進行的反應(yīng)；2. 可以縮短化學(xué)反應(yīng)到達(dá)平衡的時間，而不改變反應(yīng)的平衡點；3. 通過降低活化能加快化學(xué)反應(yīng)速度。4. 它本身的數(shù)量和化學(xué)性質(zhì)在化學(xué)反應(yīng)后不發(fā)生改變。三、酶作為催化劑的顯著特點：高效、專一、溫和、可調(diào)節(jié)四、酶的分類天然酶的分類廠一按組成分類蛋白質(zhì)類單純酶結(jié)合酶單體酶按結(jié)構(gòu)分類彳寡聚酶-多酶體系按催化類型分類一按特殊功能分類Y抗體酶 同功酶 調(diào)節(jié)酶 別構(gòu)酶RNA酶（核酶）DNA酶（脫氧核酶）1氧化還原酶類:2. 轉(zhuǎn)移酶類：3. 水解酶類：4. 裂合

2、酶類：5. 異構(gòu)酶類：6. 連接酶類：（一）、酶的組成分類單純酶：它們的組成為單一的蛋白質(zhì)。結(jié)合酶（全酶）： 蛋白質(zhì)（酶蛋白）+輔因子 酶蛋白決定反應(yīng)的特異性，輔因子決定反應(yīng)的類型與性質(zhì)。 輔因子：輔酶：與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去的輔因子。輔基：與酶蛋白結(jié)合緊密，不能可用透析或超濾的方法除去的輔因子。(二) 、酶的結(jié)構(gòu)分類(1) 、單體酶(mo no meric en zyme):僅具有三級結(jié)構(gòu)的酶，即只由一條肽鏈組成的酶。(2) 、寡聚酶(oligomeric enzyme):兩個或兩個以上的相同或不同亞基以共價鍵方式連接 而形成的酶。(3) 、多酶復(fù)合體(多酶體系，mult

3、ienzyme system):由幾種功能不同的酶聚合在一起，分工合作。共同催化一個生化反應(yīng)過程。、多功能酶(multifunctional enzyme): 一些多酶體系 在進化的過程中由于基因融合， 致使多種不同催化功能存在于一條多肽鏈上，這種一條肽鏈具有多種催化功能的酶叫多功能酶。(三) 、酶的功能組成一酶的活性中心酶的活性中心：與底物結(jié)合并進行催化反應(yīng)的特殊的必需基團。廠結(jié)合基團：決定酶的專一性活性中心內(nèi)的必需基團必需基團:催化基團：決定酶的催化性質(zhì)L 活性中心外的必需基團：維持酶的空間結(jié)構(gòu)和催化功能所必需的基團五、酶的專一性酶作用的專一性絕對專一性：嚴(yán)格，只 作用一種物質(zhì)，例如脲 酶

4、，DNA聚合酶相對專一性：一類結(jié)構(gòu) 近似的物質(zhì)，例如 a - D -葡萄糖苷酶 鍵專一性：識別底物一定的化學(xué)鍵，例如酯酶立體異構(gòu)專一性旋光異構(gòu)專一性：例如L-氨基酸氧化酶幾何異構(gòu)專一性：琥珀酸脫氫酶琥珀酸延胡索酸順丁稀二酸第三章酶的作用機理一、酶作用專一性的機制（一）“三點結(jié)合”的催化理論三點結(jié)合”的催化理論認(rèn)為酶與底物的結(jié)合處至少有三個點，只有當(dāng)三點完全結(jié)合的情 況下。催化作用才能實現(xiàn)，酶促反應(yīng)才能進行。（二）鎖鑰學(xué)說鎖鑰學(xué)說認(rèn)為整個酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對一把鎖一樣，那把鑰匙開那把鎖。 也就是說，只有當(dāng)?shù)孜锏男螤钆c酶的活性中心的構(gòu)

5、象完全匹配時，酶與底物才能結(jié)合，催化反應(yīng)才能進行。（三）誘導(dǎo)嵌合學(xué)說（Induced fit model）酶活性中心的結(jié)構(gòu)有一定的靈活性，當(dāng)?shù)孜铮せ顒┗蛞种苿┡c酶分子結(jié)合時，在底物的誘導(dǎo)下，酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生了有利于與底物結(jié)合的變化，使反應(yīng)所需的催化基團和結(jié)合基團正確地排列和定向，這樣酶與底物才能很好地結(jié)合，酶促反應(yīng)才得以進行。二、酶高效催化的機制（一）、酶為什么能催化化學(xué)反應(yīng)1、分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的必要條件：活化能和能障在化學(xué)反應(yīng)體系中，并不是所有的分子都能參加化學(xué)反應(yīng)，只有那些所含能量達(dá)到或超過一定限度（平均能量）的分子才能參與反應(yīng)。這些能參與反應(yīng)的分子稱為活化分子，由常 態(tài)分子轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨?/p>

6、分子所需的能量稱為活化能。活化分子含有的能參與化學(xué)反應(yīng)的最低限度的能量稱為化學(xué)反應(yīng)的能閾或能障。因此，只有那些所含能量大于能障的分子才能參與化學(xué) 反應(yīng)。在一個化學(xué)反應(yīng)體系中，活化分子越多，反應(yīng)就越快。所以，設(shè)法增加活化分子數(shù)， 就能加速化學(xué)反應(yīng)。2、增加活化能（活化分子）的途徑增加活化分子有兩種可能的途徑：一是加熱或光照射增加能量，使一部分分子獲得能量而活化，直接增加活化分子數(shù)目， 以加速化學(xué)反應(yīng)的進行。 另一種途徑是 降低活化能的閾值， 間接增加活化分子數(shù)目。催化劑的作用就是降低反應(yīng)的活化能。酶是如何降低化學(xué)反應(yīng)的活化能的呢？（二）、有關(guān)酶高效率機理的假說1、中間產(chǎn)物學(xué)說中間產(chǎn)物學(xué)說是目前較

7、公認(rèn)的解釋酶作用機理的理論。這個理論認(rèn)為：在酶促反應(yīng)中， 底物先與酶結(jié)合，形成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物一ES復(fù)合物，然后再分解釋放出酶與產(chǎn)物。ES的形成，改變了原來反應(yīng)的途徑。酶的活性中心與底物分子通過短程非共價鍵（如氫鍵，離子鍵和疏水鍵等）的作用，形成ES復(fù)合物，使底物的價鍵狀態(tài)發(fā)生形變或極化，從而激活底物分子和降低過渡態(tài)活化能，使底物的活化能大大降低，結(jié)果使反應(yīng)加速。2. 趨近效應(yīng)（approximation）禾口定向效應(yīng)（orientation）通常底物濃度與化學(xué)反應(yīng)速度成正比。若在反應(yīng)系統(tǒng)的某一局部區(qū)域，底物濃度增高， 則反應(yīng)速度也隨之提高。趨近效應(yīng)指由于活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團的誘導(dǎo)和定

8、向作 用，使底物分子中參與反應(yīng)的基團相互接近，底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，并被嚴(yán)格定向定位，從而降低了進入過渡態(tài)所需的活化能。使酶促反應(yīng)具有高效率。酶的活性中心部位，一般都含有多個起催化作用的基團，這些基團在空間有特殊的排列和取向，可以對底物價鍵的形變和極化及調(diào)整底物基團的位置等起到協(xié)同作用，從而使底物 達(dá)到最佳反應(yīng)狀態(tài)。3、張力作用(distortion or strain)底物的結(jié)合可誘導(dǎo)酶分子構(gòu)象發(fā)生變化，比底物大得多的酶分子的三、四級結(jié)構(gòu)的變化，也可對底物產(chǎn)生張力作用，使底物扭曲，促進ES進入活性狀態(tài)。4、酸堿催化(acid-base catalysis)酸和堿是有機反應(yīng)中用途

9、最廣和最普遍的催化劑。酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都 是廣義的酸-堿催化方式。廣義酸-堿催化是指通過質(zhì)子酸提供部分質(zhì)子，或是通過質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過程。酶的活性中心具有某些氨基酸殘基的R基團，這些基團往往是良好的質(zhì)子供體或受體，在水溶液中這些廣義的酸性基團或廣義的堿性基團對許多化學(xué)反應(yīng)是有力的催化劑。如氨 基、羧基、巰基、酚羥基及咪唑基等。影響酸堿催化反應(yīng)速度的因素有兩個：第一個因素是酸堿的強度 。第二個因素是這些功能基供出質(zhì)子或接受質(zhì)子的速度。共價催化：催化劑通過與底物形成反應(yīng)活性很高的共價過渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降

10、低，從而提高反應(yīng)速度的過程，稱為共價催化。某些酶與底物結(jié)合形成一個反應(yīng)活性很高的共價中間產(chǎn)物， 這個中間產(chǎn)物以較大的機率，轉(zhuǎn)變?yōu)檫^渡態(tài)，因此反應(yīng)的活化能大大降低，底物可以越過較低的能障而形成產(chǎn)物。5、共價催化作用可分為親核催化作用和親電子催化作用兩大類。親核催化作用：親核催化是指具有一個非共用電子對的基團或原子，攻擊缺少電子 具有部分正電性的原子，并利用非共用電子對形成共價鍵催化反應(yīng)。酶分子中具有催化功能的親核基團主要是：組氨酸的咪唑基、絲氨酸的羥基、半胱氨酸的巰基。此外，許多輔酶也 具有親核中心。酶中參與共價催化的基團主要包括His的咪唑基，Cys的硫基，Asp的羧基，Ser的親電子催化作用

11、：在親電子催化作用中，催化劑和底物的作用與親核催化相反，就是說，親電子催化劑缺少電子， 從底物中吸取一個電子對形成共價鍵催化反應(yīng)。酶分子親電子的基團有親核堿基被質(zhì)子化的共軛酸，如一NH3+。在酶的親電子催化過程中，有時其必需的親電子物質(zhì)不是上述的共軛酸，而是由酶中非蛋白組成的輔因子提供，其中金屬陽離子是很重要的一類。6、金屬離子催化作用(1) 、提高水的親核性能：金屬離子可以和水分子的0H-結(jié)合，使水顯示出更大的親核 催化性能。(2) 、電荷屏蔽作用(3) 、電子傳遞中間體第四章 影響酶促反應(yīng)速度的因素一、底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響（一）、單底物反應(yīng)1、米氏方程底物濃度較低時，增加底物濃度可加

12、快酶促反應(yīng)速度。當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r，酶促反應(yīng)速度 不會再隨底物濃度的增加而加快。底物濃度與酶促反應(yīng)速度的關(guān)系通常用米氏方程來表示:V max SK m S2、米氏常數(shù)的定義米氏常數(shù)是酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的一半時的底物濃度。Km是一個物理常數(shù)。米氏常數(shù)的單位是 mM。3、米氏常數(shù)的意義（1）K是酶的一個特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)。m（2） 如酶能催化幾種不同的底物，對每種底物都有一個特定的Km值，其中 值最小 的稱該酶的最適底物。（3） K除了與底物類別有關(guān)，還與pH、溫度有關(guān)。m（4） 0表示酶和底物的親和力。Km越大，表示和底物的親和力越小。判斷代謝反應(yīng)的方向、途徑和限速

13、步驟等。二、酶的抑制作用和抑制作用動力學(xué)（一）、什么是抑制作用（inhibition） ?某些物質(zhì)使酶活力下降的作用叫抑制作用，這些使酶活力下降的物質(zhì)，稱為 抑制劑（Inhibitor, I ）（二）、抑制作用的種類1、不可逆抑制（irreversible inhibition ）:抑制劑與酶的必需基團以共價鍵結(jié)合，不能 用稀釋或透析去除抑制劑使得酶活力恢復(fù)。2、可逆抑制作用（reversible inhibition）及其動力學(xué)（1）競爭性抑制作用（competitive inhibition） 定義：抑制劑與底物競爭酶的活性結(jié)合部位 競爭性抑制作用的特點：Km增加、Vmax不變（2）非競爭

14、性抑制作用（noncompetitive inhibition） 定義：I與S同時結(jié)合到酶的不同部位上特點： Km 不變、 Vmax 降低3）反競爭性抑制作用（ uncompetitive inhibition ）復(fù)合物結(jié)合。定義：只有酶和底物結(jié)合之后，抑制劑才與酶和底物的特點： Km 降低、 Vmax 降低 三）一些重要的抑制劑及其實際意義 有機磷化合物 制膽堿酯酶。：有機磷化合物能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，特別是強烈抑 巰基酶抑制劑A、烷化劑：B、有機汞、有機砷化合物 重金屬抑制劑Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等金屬鹽能使大多數(shù)酶失活。第五章 核酶和抗體酶一、核酶的發(fā)現(xiàn)1982 年

15、 Cech 等發(fā)現(xiàn)四膜蟲細(xì)胞大核期間 26SrRNA 前體具有自我剪接功能， 并于 1986 年證明其內(nèi)含子 L-19IVS 具有多種催化功能。1995 年 Cuenoud 等發(fā)現(xiàn)有些 DNA 分子亦具有催化活性。稱之為脫氧核酶。二、核酶作用的特點1、化學(xué)本質(zhì)： RNA2、底物： RNA3、反應(yīng)特異性 （專一性）堿基4、催化效率 低5、 核酶是一種金屬依賴酶。金屬離子起以下的作用：（1）、特異的結(jié)構(gòu)作用，或參與活性部位的化學(xué)過程（2）、促進 RNA 的總體折疊（ 3）、二價金屬離子（如 Mg 2+ ）與底物活性部位直接相互作用，參與過渡中間復(fù)合 物的形成三、核酶的應(yīng)用1、核酶抗肝炎病毒的研究目

16、前人們已進行了核酶抗甲型肝炎病毒（ HAV）、乙型肝炎病毒（HBV ）、丙型肝炎病 毒（HCV ）以及HDV作用的研究。人工設(shè)計核酶多為錘頭狀結(jié)構(gòu)，少部分是采用發(fā)夾狀 核酶。2、抗人類免疫缺陷病毒1型（ HIV- I ）。核酶免疫源性低，很少引起免疫反應(yīng)。1998年，美國加利福尼亞大學(xué) Wong-Staal等利用發(fā)夾核酶抑制 HIV- I基因表達(dá)，并 率先進入臨床I期。3、抗腫瘤治療 核酶能在特定位點準(zhǔn)確有效地識別和切割腫瘤細(xì)胞的 mRNA, 抑制腫 瘤基因的表達(dá)，達(dá)到治療腫瘤的目的。4、抑制疾病基因的表達(dá)和基因治療 通過識別特定位點而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)， 抑制效率高， 專一性強。 針對錘頭核

17、酶而言，催化結(jié)構(gòu)域小， 既可作為轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物， 也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在體內(nèi)轉(zhuǎn) 運。5、在其他領(lǐng)域的應(yīng)用防治動、植物 病毒侵害：馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒負(fù)鏈的多價核酶構(gòu)建，馬鈴薯卷葉 病毒復(fù)制酶基因負(fù)鏈的突變核酶的克隆等。四、核酶技術(shù)面臨的問題1、核酶催化切割反應(yīng)的 可逆性 問題，定向反應(yīng)2、催化效率 較低，設(shè)法提高催化效率3、尋找合適 載體 將核酶高效、特異地導(dǎo)入靶 細(xì)胞4、使核酶在細(xì)胞內(nèi)有 調(diào)控 地高效表達(dá)5、增強核酶在細(xì)胞內(nèi)的 穩(wěn)定性6、對宿主的 損傷問題 有待進一步考察五、 抗體酶（ abzyme ）（一）、 抗體酶的定義 ：抗體酶或催化抗體（ Catalytic anti

18、body） 是指具有酶催化活性的抗體。是一種新型人工 酶制劑，是一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。它是利用現(xiàn)代生 物學(xué)與化學(xué)的理論與技術(shù)交叉研究的成果，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙 結(jié)合的產(chǎn)物。抗體：與抗原特異結(jié)合的免疫球蛋白。 抗體酶：指具有催化功能的抗體分子，在抗體分子的可變區(qū) （即肽鏈的 N 端）是識別 抗原的活性區(qū)域，這部分區(qū)域被賦予了酶的屬性。（二）、抗體酶的催化特征1、抗體酶的特點（與天然酶相比） ：（ 1） 能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng) （2）有更強的專一性和穩(wěn)定性（3）催化作用機制不同2、抗體酶和非催化性抗體作用的比較（ 1）更高的反應(yīng) 特異性

19、（ 2）反應(yīng)的 可逆性（ 3）反應(yīng)的 量效性（ 4）反應(yīng) 過程（三）、 抗體酶的催化作用機理1、過渡態(tài)理論與抗體酶2、抗體酶催化的三種重要反應(yīng)機制 水解作用機制 基團轉(zhuǎn)移 連續(xù)反應(yīng)機制3、抗體酶催化反應(yīng)的 介質(zhì)效應(yīng) 酯解反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng) ：抗體酶在有機溶 劑中具穩(wěn)定性。 脫羧反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng) ；有機溶劑引起脫羧反應(yīng)速率增加。 酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng) ：在疏水溶劑中，活性較高。（四）、抗體酶的制備1、細(xì)胞融合法：2、抗體結(jié)合位點化學(xué)修飾法： 對抗體酶進行結(jié)構(gòu)修飾的關(guān)鍵是找到一種溫和的方法在 抗體結(jié)合位置或附近引入具有催化功能的基團。 游離巰基就是適合的基團之一， 它具有高親 核性，易于氧化，及能通過

20、二硫化物進行交換反應(yīng)或親電反應(yīng)而選擇性修飾的特點。3、引入輔助因子法： 將此半抗原通過共價鍵連接在載體蛋白免疫動物產(chǎn)生的抗體，在 金屬離子復(fù)合物作為輔因子的參與下，這些抗體酶能選擇性水解甘氨酸和丙氨酸之間的肽 鍵.4、 用生物工程的方法產(chǎn)生抗體：將編碼具有抗體酶活性的 Fab片斷的基因是通過細(xì)菌 的形式表達(dá)出來的。5、拷貝法：用酶作為抗原免疫動物得到抗酶的抗體，再將此抗體免疫動物并進行單克 隆化，獲得單克隆的抗抗體。對抗抗體進行篩選，獲得具有原來酶活性的抗體酶。6、共價抗原免疫法：這是在親和標(biāo)記抑制劑基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的抗體酶制備方法。 以親和標(biāo)記劑為半抗原，則抗體結(jié)合部位將產(chǎn)生與親和基團電荷

21、性質(zhì)相反的基團，如親核 性，親電性氨基酸，酸性氨基酸，堿性氨基酸等。第六章酶的分離純化、沉淀分離：1沉淀劑的類型2、使用注意事項沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用不冋蛋白質(zhì)在不冋的鹽濃度條件下溶解度不冋的特性，通過在酶 液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使 酶與雜質(zhì)分離等電點沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不冋的兩性電解質(zhì)有不 冋的等電點這一特性， 通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出， 從而使酶與雜質(zhì)分離有機溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不冋，通過添加一定量的某 種有機溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入

22、某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶 與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的 酶，從而使酶與雜質(zhì)分離、層析分離層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對不同物質(zhì)的 吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的 分配系數(shù) 不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不 同而達(dá)到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分 子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的 等電點

23、特性 與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實 現(xiàn)組分分離（一）離子交換層析1、如何根據(jù)酶的特性選擇離子交換介質(zhì)？2、如何根據(jù)離子交換介質(zhì)的特性選擇緩沖體系？（二）凝膠層析操作（裝柱、洗滌及洗脫）過程中要注意那些問題？（三）親和層析的原理及操作要點第七章 固定化酶一、什么是固定化酶？ 通過化學(xué)方法將水溶性酶與不溶性載體鉸鏈而形成的不溶性酶稱為固定化酶。 與天然酶 比較，固定化酶具有可多次重復(fù)使用、可以裝塔連續(xù)反應(yīng)、 純化簡單、 能提高產(chǎn)物質(zhì) 量、應(yīng)用范圍廣 等多種優(yōu)點。二 固定化酶的優(yōu)缺點優(yōu)點：可多次重復(fù)使用 可以裝塔連續(xù)反應(yīng) 純化簡單 提高產(chǎn)物質(zhì)量 應(yīng)用范圍廣缺點：首次投入成本高 大分子底物較困難

24、三、影響固定化酶性質(zhì)的因素1 酶本身的變化： 主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。2 載體的影響（1）分配效應(yīng)（2）空間障礙效應(yīng)（3）擴散限制效應(yīng)3.固定化方法的影響四、固定化后酶性質(zhì)的變化1 固定化對酶活性的影響：酶活性下降，反應(yīng)速度下降。原因：酶結(jié)構(gòu)的變化空間位阻2 固定化對酶穩(wěn)定性的影響（ 1） 操作穩(wěn)定性提高（ 2） 貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。（3 ） 對熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。（4 ） 對分解酶的穩(wěn)定性提高。（ 5） 對變性劑的耐受力升高 固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：a. 固定化后酶分子與載體多點連接。b. 酶活力的釋放是緩慢的。c. 抑制

25、自降解，提高了酶穩(wěn)定性。3、米氏常數(shù)Km的變化，Km值隨載體性質(zhì)變化（1） 載體與底物帶相同電荷，Km ' >Km固定化酶降低了酶的親和力。（2） 載體與底物電荷相反，靜電作用，Km'<Km五、固定化酶的制備（一）、各類固定化方法的特點比較比較項目吸附法結(jié)合法交聯(lián)法包埋法物理吸附共價鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合制備難易易難易較難較難固定化程度弱強中等強強活力回收率較咼低高中等高載體再生可能不可能可能不可能不可能費用低高低中等低底物專一性不變可變不變可變不變適用性酶源多較廣廣泛較廣小分子底物、藥 用酶（二）選擇方法依據(jù)：（1）酶的性質(zhì)（2）載體的性質(zhì)（3）制備方法的選擇（三）選擇

26、載體的原則（1）要有巨大的比表面積（2）要有活潑的表面（3）便于裝柱進行連續(xù)反應(yīng)（四）載體活化的方法A .重氮法B .疊氮法C.烷基化反應(yīng)法D .硅烷化法E.溴化氰法（五八固定化后酶的考察項目：（1）測定固定化酶的活力，以確定固定化過程的活力回收率。（2）考察固定化酶穩(wěn)定性（2）考察固定化酶最適反應(yīng)條件第八章 化學(xué)酶工程第一節(jié) 酶分子的化學(xué)修飾一、酶化學(xué)修飾的定義 用化學(xué)試劑對酶的側(cè)鏈基團進行共價改造，從而賦予酶分子以特殊功能和提高酶的活 力的方法，稱為酶的化學(xué)修飾。二 酶的化學(xué)修飾原因1穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。2作用的最適條件不符。3酶的主要動力學(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。4臨床應(yīng)用的特殊要

27、求。三、酶化學(xué)修飾的目的1、改變活性部位的構(gòu)象 。酶蛋白的主鏈經(jīng)蛋白酶的水解作用，去掉部分肽段或者取代 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上某些氨基酸殘基，使活性部位的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以達(dá)到人們所需要的各 種目的。2 、 提高生物活性 。酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)轉(zhuǎn)變，改變基團的電化學(xué)性質(zhì)、分子內(nèi)基團 的相互作用力等，某些情況下能提高酶的生物活性。3 、增強酶的穩(wěn)定性 。一般酶反應(yīng)條件基本接近中性， 但在工業(yè)應(yīng)用上， 由于生產(chǎn)條件、 底物等帶來的影響，作用的 pH 常常不在中性；生產(chǎn)溫度的提高，酶往往易變性失活。這些 都直接影響酶作用的發(fā)揮。用雙功能試劑讓酶分子基團之間、內(nèi)部側(cè)鏈基團之間進行交聯(lián)， 可以達(dá)到提高酶的穩(wěn)定性

28、的目的。4 、 降低酶類藥物的抗原性 。酶是蛋白質(zhì)，作為藥物使用時，這些異源蛋白進入人體后 可能成為抗原，誘導(dǎo)相應(yīng)的抗體產(chǎn)生，這些酶類藥物就會通過抗原抗體反應(yīng)被清除掉，從 而不能發(fā)揮藥效，有的甚至還會產(chǎn)生過敏反應(yīng)。通過對酶的化學(xué)修飾，可以降低酶類藥物 的抗原性。5 、改變酶學(xué)性質(zhì) 。利用有機小分子或大分子物質(zhì)對活性部位或活性部位之外的側(cè)鏈基 團進行化學(xué)修飾，達(dá)到改變酶學(xué)性質(zhì)的目的。四、 酶化學(xué)修飾的基本原理1 如何增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性2 如何保護酶活性部位與抗抑制劑3 如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶4 如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境 因此，在酶的化學(xué)修飾過程中需要注意以

29、下幾個方面：（ 1）、充分了解被修飾酶 。開始設(shè)計酶化學(xué)修飾反應(yīng)時，對被修飾酶的活性部位、穩(wěn) 定條件、側(cè)鏈基團性質(zhì)及酶反應(yīng)的最適條件等應(yīng)盡可能全面了解。（2）、修飾劑的選擇 選擇修飾劑時要求修飾劑具有較大的相對分子質(zhì)量，對蛋白質(zhì)的吸附有良好的生物相 容性和水溶性，修飾劑分子表面有較多的活性基團，還要考慮修飾劑上的反應(yīng)基團的活化 方式和活化條件，以及修飾后酶活性的半衰期。（3）修飾反應(yīng)條件的選擇修飾反應(yīng)一般要選擇在酶穩(wěn)定的條件下進行，盡可能少破壞酶的必需基團，選擇酶與 修飾劑的結(jié)合率和酶活回收率都較高的反應(yīng)條件。對反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例、 反應(yīng)溫度、pH、時間、溶劑性質(zhì)和離子強度等在確定

30、反應(yīng)條件時也必須考慮。五、酶修飾方法（一）、 酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾（二）、 酶分子表面的化學(xué)修飾（三）、 蛋白質(zhì)類及其他對酶的化學(xué)修飾。六、修飾酶的性質(zhì)及特點1熱穩(wěn)定性提高 修飾劑與酶多點交聯(lián)，固定了酶的分子構(gòu)象，增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性減少了酶熱失 活，增強了酶的熱穩(wěn)定性。2抗原性降低 當(dāng)酶被修飾以后，酶分子表面上許多抗原決定簇在反應(yīng)過程中被修飾劑結(jié)合，在空間 結(jié)構(gòu)上使這些抗原決定簇被屏蔽，從而降低了酶分子的抗原性或抗原抗體的結(jié)合能力。3體內(nèi)半衰期延長 經(jīng)過化學(xué)修飾后，由于增強了抗蛋白水解酶、抗抑制劑和抗失活因子的能力以及對熱 穩(wěn)定性的提高，所以其半衰期都比天然酶長。4. 最適pH變化修飾

31、酶的微環(huán)境更為穩(wěn)定。5. 酶的動力學(xué)性質(zhì)的改變A、米氏常數(shù) Km增大：交聯(lián)于酶上的大分子修飾劑造成空間障礙，影響了底物對酶的 接近和結(jié)合，使米氏常數(shù) Km增大。B修飾酶抵抗各種失活因子的能力增強。C體內(nèi)半衰期的延長6. 對組織的分布能力變化第二節(jié) 模擬酶一. 模擬酶概述（一）、模擬酶的概念： 用合成高分子來模擬酶的結(jié)構(gòu)、特性、作用原理以及酶在生 物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過程，它研究吸收酶中起主導(dǎo)作用的因素，利用有機化學(xué)、生物化學(xué)等 方法設(shè)計和合成一些較天然酶簡單的非蛋白質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子，以這些分子作為模型來 模擬酶對其作用底物的結(jié)合和催化過程，也就是說，模擬酶是在分子水平上模擬酶活性部 位的形狀、大

32、小及其微環(huán)境等結(jié)構(gòu)特征，以及酶的作用機理和立體化學(xué)等特性。模擬酶又 稱人工酶或酶模型，它是生物有機化學(xué)的一個分支。（二）、模擬酶的研究目的：研究模擬酶主要是為了解決酶容易受多種物理、化學(xué)因素 的影響而失活，所以不能用酶廣泛取代工業(yè)催化劑等缺點。二、模擬酶的理論基礎(chǔ)和策略（一）酶學(xué)基礎(chǔ)酶的催化機制： Pauling 的穩(wěn)定過渡態(tài)理論（二）超分子化學(xué)基礎(chǔ)主-客體化學(xué)：主體和客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補三、模擬酶的分類四、模擬酶的制備第九章生物酶工程第一節(jié) 酶基因的克隆和表達(dá)、酶基因的克隆1、獲得目的基因（target ge ne ）（1）已知序列的目的基因的獲取方法： 同源克隆法（PCR

33、人工化學(xué)合成（2）.已知探針的基因的獲取方法 構(gòu)建基因組DNA文庫 構(gòu)建cDNA文庫（3）.未知序列的基因的獲取方法 隨機引物PCR 差別顯示PCR 代表性差式分析 PCR2、選擇載體基因克隆載體的定義基因克隆載體是指可承載外源基因并將其帶入受體細(xì)胞且得以穩(wěn)定維持的DNA分子。理想克隆載體的的條件 分子?。?：:10 Kb ），以容納較大的外源 DNA 有克隆位點（外源 DNA插入點）即多個單一酶切位點； 是一個獨立的復(fù)制子，有復(fù)制起始序列，可在宿主細(xì)胞中獨立自主復(fù)制； 有足夠的copy數(shù) 帶篩選的標(biāo)志：具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定； 克隆載體必須是安全的，不應(yīng)含有對受體細(xì)

34、胞有害的基因。（3）常用的克隆載體（vector ）質(zhì)粒（plasmid :柯斯質(zhì)粒和酵母質(zhì)粒）入噬菌體（phage）病毒（virus ）人工染色體3、目的基因與載體的重組（1）目的基因酶切/修飾限制性核酸內(nèi)切酶：一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶（2）載體酶切（3）DNA連接酶連接目的基因和載體 用T4或E. coli DNA連接酶可連接具互補黏性末端的DNA片段； 用T4 DNA連接酶連接具平末端的DNA片段； 先在DNA片段末端加人工接頭，使其形成黏性末端，然后再行連接。 常用的 DNA ligase : T4 DNA ligase只以雙鏈DNA為底物，不能有核苷酸的

35、缺失只催化3'端帶有羥基的斷點與 5'帶有磷酸基的斷點的連接 既可連接粘性末端，又可連接平末端（是目前已知的唯一的可以連接平末端的DNA連接酶）最適 pH: 7.2 - 7.8需要ATP參加反應(yīng)4、重組載體的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備0-4 C O.1mol/L CaCI2 冰浴 15-30mi n重組載體直接引入感受態(tài)細(xì)胞 重組DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞常用轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)，先制備細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，然后用重組DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化子 重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞常見的是導(dǎo)入酵母細(xì)胞，一般用蝸牛酶去除酵母細(xì)胞壁形成原生質(zhì)體，再用CaCl2和聚乙二醇處理，重組 DNA以轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入酵母細(xì)胞

36、原生質(zhì)體，將其置于再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 使原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁形成完整酵母細(xì)胞。導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞較簡便的是電穿孔法和微 量注射法。體積大的動物細(xì)胞可用微量注射法將外源DNA注入細(xì)胞，如受精卵。5、重組子的篩選與鑒定 根據(jù)重組載體的表型抗藥性（Ampr、Tetr）營養(yǎng)條件（自養(yǎng)、異養(yǎng)）其他marker （-互補篩選） 根據(jù)DNA限制性內(nèi)切酶的酶譜分析 利用核酸雜交和放射自顯影進行鑒定：原位雜交、Southern印跡 PCR法 DNA序列測定 免疫學(xué)法二、克隆基因的表達(dá)表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（一）外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)目前應(yīng)用最廣的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。下面以

37、大腸桿菌為例，講述原核生物基因表達(dá) 系統(tǒng)。1 原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)的特點原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)的特點如下： 只有一種RNA聚合酶（真核細(xì)胞有三種）識別原核細(xì)胞的啟動子； 表達(dá)是以操縱子為單位的； 轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)，是連續(xù)進行的； 一般不含有內(nèi)含子（intron）,缺少真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，故當(dāng)含有內(nèi)含子的真核基因在原核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成 mRNA前體后，其中內(nèi)含子部分不能被切除； 原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，包括起始控制（啟動子控制）和終止控制（衰減子控制 ）； 在大腸桿菌 mRNA 的核糖體結(jié)合位點上，含有真核基因缺乏的轉(zhuǎn)譯起始密碼子及SD 序列。2. 真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞

38、優(yōu)點：可表達(dá)克隆的 cDNA 及真核基因組 DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點：操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE 葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射第二節(jié) 酶分子的改造一、概述1、為什麼要改造酶分子？ 多數(shù)天然酶在工業(yè)生產(chǎn)的條件下，難以具備商業(yè)價值的酶學(xué)特性，對天然酶進行分子 水平的改造，以獲得比天然酶活力更高或催化能力更強的新的非天然酶或改造天然酶。2、酶分子改造的內(nèi)容主要兩方面：理性設(shè)計和非理性設(shè)計（1）理性設(shè)計 在研究天然酶及其突變體時，通常先獲得酶分子特征、空間結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān) 系等方面信息，這些用各種生物化學(xué)、光譜學(xué)、晶體學(xué)等方法來解決，

39、然后根據(jù)這些信息 進行酶分子的改造，這就是酶分子的理性設(shè)計，它包括化學(xué)修飾、定點突變等。（2）非理性設(shè)計：不需準(zhǔn)確知道酶蛋白結(jié)構(gòu)與功能等信息，直接通過隨機突變、篩選 等方法進行酶分子的改造，稱為酶分子的非理性設(shè)計，如定向進化、雜合進化等。目前用 于進行酶分子的改造方法主要是定點突變。二、改造酶分子的常用方法（一）、酶的定點突變1、概念：定點突變 （site-directed mutagenesis， SDM） 指在基因的特定位點引入突變， 即通過取代、 插入或刪除已知 DNA 序列中特定的核苷酸序列來改變酶蛋白結(jié)構(gòu)中某個或某 些特定的氨基酸，以此來提高酶對底物的親和力，增強酶的專一性等。定點突

40、變方式多樣， 有改變特定的核苷酸，也有對一段最可能影響酶的功能與性質(zhì)的基因序列進行隨機突變， 從而產(chǎn)生一系列突變酶蛋白分子。2、優(yōu)點：突變率高、簡單易行、重復(fù)性好的特點。3、應(yīng)用：定點突變技術(shù)通常可以用于改變核苷酸序列獲得突變基因，研究基因的結(jié)構(gòu) 與功能的關(guān)系；還能夠通過改變特定的氨基酸獲得突變酶蛋白，研究基因表達(dá)調(diào)控、基因 結(jié)構(gòu)與功能及蛋白質(zhì)性質(zhì)等，從微觀水平來闡明正常狀態(tài)下基因的調(diào)控機理以及疾病的病 因和機理。在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。（二）、常用方法1、寡核苷酸引物突變 寡核苷酸引物突變法用含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物合成 DNA 子鏈的一部分。 引 物中除了所需的突

41、變堿基之外，其余部分則應(yīng)與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補。 這種突變的步驟如下：將待突變基因克隆到突變載體上；制備含待突變基因的單鏈模板； 突變寡核苷酸引物與待突變的核苷酸形成一小段堿基錯配的異源雙鏈的DNA ； 合成突變鏈： 在 DNA 聚合酶的催化下， 引物以單鏈 DNA 為模板合成全長的互補鏈， 而后由連接酶封閉缺口，產(chǎn)生閉環(huán)的異源雙鏈的 DNA 分子； 轉(zhuǎn)化和初步篩選異源雙鏈 DNA 分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，產(chǎn)生野生型、突變型的同源 雙鏈 DNA 分子該法是應(yīng)用范圍最廣的突變方法，其保真度比后面提到的 PCR 突變法高， 其缺點是攜作過程環(huán)節(jié)復(fù)雜。2、 PCR 突變PCR 介導(dǎo)的定點突變

42、是應(yīng)用 PCR 技術(shù)，置換 DNA 鏈上特定部位的氨基酸，插入特定 幾個或消除特定幾個氨基酸。主要有經(jīng)典的重組 PCR 定點突變法和大引物突變法。重組 PCR 定點突變法可在 DNA 區(qū)段的任何部位產(chǎn)生定點突變，這種方法，需要四種擴增引物， 總共進行三輪 PCR 反應(yīng)。3、盒式突變 概念：盒式突變是利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型 基因中的相應(yīng)序列。這種突變的寡核苷酸是由兩條寡核苷酸組成的，當(dāng)它們退火時，產(chǎn)生 克隆所需要的黏性末端，由于不存在異源雙鏈的中間體，因此重組質(zhì)粒全部是突變體。優(yōu)點：盒式突變法與前兩者相比，更加簡單易行、突變效率高，可以在一對限制酶切 位點內(nèi)進

43、行一次突變而獲得多個位點。缺點：唯一不足的是靶 DNA 區(qū)段的兩側(cè)需存在一對限制酶單切位點。三、酶分子定向進化酶分子定向進化的關(guān)鍵是通過隨機以誘變和體外重組產(chǎn)生分子多樣性。其基本方法分 三步進行：1、通過隨機誘變和體外重組創(chuàng)造基因多樣性；2、將突變或重組基因?qū)脒m當(dāng)載體后構(gòu)建突變文庫；3、通過靈敏的篩選方法，選擇樣性突變子。第十章 有機介質(zhì)中的酶反應(yīng)有機相酶反應(yīng)的優(yōu)點：1有利于疏水性底物的反應(yīng)。2可提高酶的熱穩(wěn)定性 .3能催化在水中不能進行的反應(yīng)4可改變反應(yīng)平衡移動方向5可控制底物專一性6可防止由水引起的副反應(yīng)。7可擴大反應(yīng) pH 值的適應(yīng)性。8酶易于實現(xiàn)固定化。9酶和產(chǎn)物易于回收。10可避免微生物污染。有機相酶反應(yīng)具備條件1保證必需水含量。2選擇合適的酶及酶形式。3選擇合適的溶劑及反應(yīng)體系。4選擇最佳 pH 值。三、分子印跡技術(shù)原理：1、競爭性抑制劑誘導(dǎo)酶活性中心構(gòu)