影響ELISA結(jié)果常見因素和有效控制

1、影響elisa結(jié)果常見因素和有效控制摘要：elisa,也就是酶聯(lián)免疫吸附試驗，是20世 紀70年代發(fā)展起來的一種檢測技術(shù)，因其具有敏感性高、 特異性強、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于各種抗原和抗體 的測定，為輔助臨床診斷與生物科研起到了積極的推動作 用。從事檢驗工作這些年，深知elisa測定中影響因素較多， 操作過程中每個環(huán)節(jié)都會對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響，甚至出現(xiàn)錯 誤的結(jié)果。為此，筆者在具體工作中對影響實驗結(jié)果的常見 因素進行了控制，取得了較好的效果。關(guān)鍵詞：elisa影響因素有效控制doi： 10. 3969/j. issn. 1671-8801. 2013.01.210【中圖分類號】r9【文獻標

2、識碼】b【文章編號】 1671-8801 (2012) 01-0232-02elisa是20世紀70年代發(fā)展起來的一種檢測技術(shù)，因 其具有敏感性高、特異性強、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用 于各種抗原和抗體的測定，為輔助臨床診斷與生物科研起到 了積極的推動作用。但該試驗的影響因素較多，操作中如不 嚴格控制常常會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，在工作中我們注意收 集并分析影響結(jié)果的因素，適當加以控制，效果較為理想。 現(xiàn)將影響因素及控制方法分析總結(jié)如下：1試劑的因素1.1試劑的選擇。試劑的選擇是保證檢測質(zhì)量的關(guān)鍵。 雖然國家采用批批檢定的形式對elisa試劑嚴格把關(guān)，但不 同廠家的試劑在使用效果上仍存在在差異。為

3、此，一定要選 購知名度相對高、具有"三證”的試劑，最好選用與儀器配 套的試劑。切忌用無批號的試劑，更不要使用過期的試劑和 混用不同批號的試劑。1.2試劑的準備。在實驗過程中，對試劑的準備一般不 太注意，通常的做法是在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即 用，而忽略了這種做法有可能影響后面時間不夠的問題，其 直接的后果是對一些弱陽性標本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此， 在elisa測定中試劑的準備最為關(guān)鍵的是，將試劑盒先從冰 箱中拿出來，在室溫下放置2030min后，再進行測定，使 試劑盒在使用前與室溫平衡，這樣做的目的能使反應微孔內(nèi) 的溫度較快地達到所需的溫度，以滿足后面的測定需求。2樣本的因素2.

4、1內(nèi)源性干擾因素。包括類風濕因子、補體、高濃度 的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體等1。2. 1. 1類風濕因子在類風濕患者及正常人血清中，常含 有較高或不同濃度的類風濕因子（rf）,其一般為igm型， 亦有igg和iga型，具有與變性igg產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點, 因為在elisa測定中，其可與固相上包被的特異抗體igg以 及隨后加入的酶標的特異抗體igg結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽性結(jié) 果。避免其發(fā)生的方法有：用f (ab) 2替代完整的iggo 標本用聯(lián)有熱變性igg的固相吸附劑處理。檢測抗原時, 可用2-硫基乙醇加入到標本稀釋液中使rf降解。2. 1.2補體在固相酶免疫測定中，來自哺乳動

5、物的固相 抗體和酶標二抗均有激活人補體系統(tǒng)的功能。一方面，固相 抗體和酶標二抗可因其吸附及結(jié)合過程中抗體分子發(fā)生變 構(gòu)，使fc段的補體clq結(jié)合點暴露出來，使clq成為一個 中介物將二者交聯(lián)起來出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另一方面，固相抗 體也會因為活化補體的結(jié)合，封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能 力而引起假陰性。解決的辦法是：用edta稀釋標本。56°c30min加熱血清使clq滅活1, 2 o2. 2外源性干擾因素。包括標本溶血、標本被細菌污染、標本保存時間過長和標本凝固不全等。2. 2. 1標本的溶血。血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性，因此，在以辣根過氧化物酶(hrp)為標志的 elis

6、a測定中，如血清樣本中血紅蛋白濃度較高，則很容易 在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的hrp底物反應 顯色。所以在采血時應注意手法，采集的血液勿用力振蕩， 嚴防標本溶血。2. 2.2標本的污染。菌體可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物 酶，可使實驗出現(xiàn)非特異性顯色。因此，elisa檢測宜采集 新鮮標本，如不能當時測定，5d之內(nèi)應41保存，1周后檢 測應低溫凍存；同時，收集標本采用無菌試管，可防止標本 的污染。2. 2.3標本的保存。標本在冰箱中保存過久，血清中igg 可聚合成多聚體，afp可形成二聚體，在用間接法測定中會 導致本底過深，甚至造成假陽性。冰凍保存的標本反復凍 融產(chǎn)生機械剪切力對標本中的

7、蛋白等分子有破壞作用，可引 起假陰性結(jié)果。因此，elisa檢測盡量采用新鮮標本，長時 凍存的樣本避免反復融凍3。2. 2.4標本凝固不全。凝固不全的血清中含有部分纖維 蛋白原，可使結(jié)果呈假陽性。解決的方法有：于采血管中 加入適當?shù)目鼓齽?；將采集后的血液放在架子上再放?371水浴中l(wèi)h,待充分凝固后再離心分離血清4。3操作中的因素3. 1加樣。孵育前加樣時間過長，酶試劑加出孔外，使 用滴瓶滴加試劑時，滴加的角度不同和擠壓的力度不同，致 使滴加的試劑量不準，都可導致試驗結(jié)果不準確。控制方法: 實驗樣本過多時，可分批次操作，以減少實驗時間延長造 成的誤差；加酶試劑后，用吸水紙吸干孔外試劑；作定 量

8、試驗時，使用加樣器加注試劑，并經(jīng)常校正其準確性，此 外，要做到一份樣本一個移液頭，防止交叉污染。3.2溫育。溫育是elisa測定最為關(guān)鍵、最容易出現(xiàn)問 題的步驟。最為常見的溫育溫度有371和室溫，其次是43°c 和28工。目前國內(nèi)售elisa試劑盒溫育時間為37°c, 30minlh,進口 elisa試劑盒則通常為37°c, 12h能有 較完全的結(jié)合。3. 2. 1溫育時間、溫度的選擇一般根據(jù)試劑盒的說明書 選擇溫育的時間、溫度。加完樣本和（或）試劑后將微孔板 從室溫放入水浴箱或溫箱中時，孔內(nèi)溫度從室溫升至37。（2需 要一定時間，如果是將微孔板一放入溫箱即開始計

9、時，這樣 就容易造成實際測定中溫育時間不夠，易致弱陽性標本測不 出來?？刂品椒ǎ喝缬袃煞N溫度，盡量使用較低的溫育溫 度、較長反應時間的條件；用1個小溫度計放置在板孔反 應液中測量觀察。3. 2.2 “邊緣效應”的排除?！斑吘壭笔窃谑褂?6孔板的elisa測定中，外周孔顯色較 中心孔深的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因可能是為96孔板周圍孔與中 心孔在溫育中的熱力學梯度造成的，因此在溫育時盡量采用 水浴。3.3洗板。elisa測定的洗板一般有兩種方式，即手工 和洗板機洗板。采用手工洗板，孔與孔之間液體易交叉，采 用半自動洗板機時，洗液量不足導致洗板不徹底，洗板針堵 塞導致抽吸不完全，洗板不暢導致清洗效果差。

10、控制方法： 手工洗板時，拍板時要垂直，避免交叉污染，用力不能過 猛，防止抗原抗體復合物脫離；洗板機洗板時應經(jīng)常檢查 沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出； 為了洗滌效果好，實驗室可采用機器與人工洗滌相結(jié)合的方 法，在機器洗滌后再進行人工洗板12次，或適當增加洗 板的次數(shù)，有資料報道洗板7次能達到理想的洗滌效果5。3.4顯色。市售elisa試劑盒中，如以四甲基聯(lián)苯胺(tmb)為底物，則提供的底物為a和b兩瓶應用液；如以 鄰苯二胺(opd)為底物，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉 劑。顯色反應條件為37t或室溫反應1530mino以鄰苯二 胺(opd)為底物的試劑，要臨用前30min配制且

11、必須避光。 以四甲基聯(lián)苯胺(tmb)為底物的試劑則不需避光，但a、b 液應盡量避免接觸金屬器械。3. 5結(jié)果判定。讀取結(jié)果要在1530min內(nèi)完成，定性 測定用肉眼判讀試驗結(jié)果時，反應板應水平距離白色背景 1015cm；定量測定時用酶標儀讀取結(jié)果，酶標儀不應置于 陽光或強光照射下，需先預熱1530min再進行測試。綜上所述，盡管elisa法操作簡單，但可能影響測定結(jié) 果的因素也較多。故在實際操作的過程中，要加強質(zhì)量管理, 認真避免或減少影響因素，力求結(jié)果準確，為疾病的診斷和 科研提供可靠的依據(jù)。參考文獻1李寧.影響酶聯(lián)免疫吸附實驗測定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)j. 檢驗醫(yī)學與臨床，2006, 3 (7)： 314-3152宗永學，梅桂杰酶聯(lián)免疫吸附實驗的影響因素及控制方法j中國療養(yǎng)醫(yī)學,2007