苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒囊膜蛋白GP64與寄主細(xì)胞互作蛋白的初步鑒定

1、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒囊膜蛋白gp64與寄主細(xì)胞互作蛋白的初步鑒定楊銳馮敏吳小鋒浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院摘要：鑒定桿狀病毒與宿主昆蟲細(xì)胞間的互作蛋口，對(duì)于進(jìn)一步研究病毒受體的特性 與功能，理解病毒與宿主細(xì)胞的相互作用關(guān)系具有重要意義。為了闡明苜蓿銀紋 夜蛾核型多角體病毒(acmnpv)出芽型病毒粒子(bv)囊膜蛋白gp64是否與宿 主細(xì)胞表面蛋白存在互作，利用蛋白酶k消化處理tn細(xì)胞系的細(xì)胞膜蛋白，結(jié) 果表明bv不能感染經(jīng)300 n g/m l蛋白酶k消化處理的tn細(xì)胞，免疫熒光檢測(cè) bv病毒粒子不能吸附于tn細(xì)胞膜上。利用病毒覆蓋蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(v0pba)及 質(zhì)譜初步鑒定的結(jié)果顯示，tn細(xì)胞

2、膜上的翻譯控制腫瘤蛋白(tctp)是與bv囊 膜蛋白gp64互作的候選蛋白。關(guān)鍵詞：苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒;出芽型病毒;gp64蛋白；互作蛋白;作者簡(jiǎn)介：楊銳(1985),男，博士研究生。e-mail:yrsla.m163. com作者簡(jiǎn)介：吳小鋒，教授，博士生導(dǎo)師。e-mail:wuxiaofengzju. edu. cn收稿日期：2017-04-25基金：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(no. 31472146)identification of host cell protein interacting with envelope protein gp64 of autographa cali

3、fornica multicapsid nucleopolyhedrovirusyang rui feng min wu xiaofengcollege of animal science, zhejiang university;abstract：tdentification of insect cel 1 proteins interacting with baculovirus is of significeint impottancc for furthcr cxploration on charactcristics and functions of virus receptors

4、and for understanding the interaction between virus and host cell. to identify cell membrane proteins interacting with envelope protein gp64 of budded virus ( bv) of autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus ( ac mnpv) , cel 1 membrane protoins of tn cells were digested with protcasc k

5、. the rcsuit revealed that bv could not infect tn cells that had been digested with 300 u g/m l protease k. immunofluorescence assay displayed that bv virus particles could not attach onto tn cell membrane. using virus overlay protein binding assay ( vopba) and mass spectrometry, translational ly_co

6、ntrol led tumor protein ( tctp) of tn cell membrane was preliminarily identified as the candidate protein interacting with envelope protein gp64 of bv.keyword：autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus; budded virus; gp64 protein; tnteracting protein;received： 2017-04-25桿狀病毒(baculovirus

7、)是一類特異性感染無脊椎動(dòng)物的有囊膜包裹的雙鏈 dma病毒，其宿主以昆蟲為主1。桿狀病毒具有雙相生活史，其子代病毒粒子 呈現(xiàn)出2種結(jié)構(gòu)和形態(tài)不同的表型，即出芽型病毒(budded virus, bv)和包涵 體衍生型病毒(occlusion-derived virus, 0dv)。在病毒感染早期,病毒核衣 殼在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)組裝后從核膜出芽進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并最終從被病毒囊膜蛋 白修飾過的細(xì)胞膜出芽獲得囊膜，形成bv2-3。在感染晚期，核衣殼在細(xì)胞核 內(nèi)獲得囊膜形成odv,并在感染極晚期被包埋入多角體2-3 ° bv負(fù)責(zé)宿主內(nèi)細(xì) 胞與細(xì)胞之間的水平傳播;odv則是通過宿主昆蟲攝入多角體在

8、中腸內(nèi)被釋放并 特異性感染屮腸上皮細(xì)胞的方式進(jìn)行昆蟲z間的水平傳播。通常，囊膜病毒入侵宿主細(xì)胞是以病毒囊膜糖蛋白與細(xì)胞表面的受體特異性結(jié) 合為起始，受體決定了病毒的宿主域。因此，研究病毒受體的特性及其功能對(duì)于 從分子水平闡明病毒侵染與宿主的免疫機(jī)制，深刻理解病毒與宿主細(xì)胞的相互 作用關(guān)系具有重要意義。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(ac mnpv)是目前研究 最為深入的桿狀病毒。ac mnpv能夠感染棉鈴蟲、玉米螟等30多種農(nóng)業(yè)害蟲，因 此ac mnpv被開發(fā)為生物殺蟲劑用于防治危害農(nóng)作物的鱗翅目昆蟲，其相對(duì)于化 學(xué)殺蟲劑具有多種優(yōu)勢(shì)，如不傷害昆蟲天敵，對(duì)人畜無害，不污染環(huán)境以及具 有后效作用等回

9、。ac mnpv的bv是通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用入侵宿主細(xì)胞，bv 的主要囊膜糖蛋白gp64是病毒的受體結(jié)合蛋白5-7 o gp64甚至能夠介導(dǎo)acmnpv進(jìn)入多種脊椎動(dòng)物細(xì)胞系，這種特性使得ac mnpv可以作為基因治療的載 體，通過gp64介導(dǎo)外源基因進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)宜。因此，鑒定 病毒囊膜蛋白gp64在宿主細(xì)胞上的受體或互作蛋白質(zhì)分子不僅具有重要的基礎(chǔ) 科學(xué)意義，而且在其應(yīng)用領(lǐng)域也具有參考價(jià)值。近年來，越來越多的病毒受體已被鑒定，且絕大多數(shù)受體分子是蛋口質(zhì)，這可 能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子具有復(fù)雜的多樣性空間結(jié)構(gòu)，具有作為受體分子的結(jié)構(gòu)基 礎(chǔ)。ac mnpv作為研究最為廣泛和深入的桿

10、狀病毒模式種，其絕大多數(shù)基因功能 已經(jīng)比較清處，病毒與宿主互作的分子機(jī)制正在逐漸被揭示。然而在ac mnpv 的bv蛋片受體研究方面卻進(jìn)展緩慢，這可能因?yàn)閍c mnpv的宿主域較為廣泛，bv 能夠進(jìn)入多種細(xì)胞。有研究報(bào)道，細(xì)胞膜蛋口在ac mnpv入侵細(xì)胞中可能具有重 要作用，但卻未有直接證據(jù)表明ac mnpv與細(xì)胞膜蛋白間的相互作用童1。因此 有觀點(diǎn)認(rèn)為bv入侵細(xì)胞并不依賴于與受體的互作也l越來越多研究表明，細(xì) 胞膜中的脂質(zhì)可與gp64發(fā)生相互作用，這一過程在bv入侵細(xì)胞過程中具有重要 作用11。tani等曲研究發(fā)現(xiàn)gp64與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面磷脂質(zhì)的結(jié)合過程在 病毒進(jìn)入細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，不

11、論是用磷脂酶c處理細(xì)胞，還是用純化的磷 脂質(zhì)孵育病毒，都會(huì)降低以gp64為囊膜蛋白的假型病毒進(jìn)入細(xì)胞的效率。用甲 基- b -環(huán)糊精去除哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜中的膽固醇可以阻斷ac mnpv進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì) 胞，卻并不能阻止病毒對(duì)于細(xì)胞的吸附過程1131。近期的研究發(fā)現(xiàn)，乙酰肝素被 鑒定為可與gp64互作的哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜蛋白，乙酰肝素對(duì)于病毒吸附并進(jìn)入哺 乳動(dòng)物細(xì)胞的過程是必需的，但是用純化的乙酰肝素孵育過后，ac mnpv卻仍能 高效地感染sf9昆蟲細(xì)胞系，說明gp64可能利用其他結(jié)合方式入侵昆蟲細(xì)胞 14 o迄今為止，ac mnpv的bv囊膜蛋白gp64在昆蟲細(xì)胞上的互作蛋白質(zhì)分子仍未被 鑒定，其至

12、不能確定互作分子是否為蛋白質(zhì)，因此首先需要明確在感染宿主的 細(xì)胞表面，是否存在與桿狀病毒互作的蛋口質(zhì)分子。本研究利用蛋口酶消化昆蟲 細(xì)胞膜，確定細(xì)胞膜上存在與gp64互作的蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步利用病毒覆蓋蛋白 印跡實(shí)驗(yàn)(virus overlay protein blot assay, vopba)和質(zhì)譜分析鑒定細(xì)胞 膜上與bv gp64互作的候選蛋白質(zhì)。1材料與方法1.1材料和主要試劑可表達(dá)綠色熒光蛋白(egfp)的ac mnpv病毒ac-egfp由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，tn細(xì) 胞由木實(shí)驗(yàn)室繼代保存。gp64單克隆抗體購自sigma公司，羅丹明標(biāo)記羊抗鼠 二抗和hrp標(biāo)記羊抗鼠二抗購自杭州華安生物技術(shù)有

13、限公司，蛋白酶k購自ta kara公司，細(xì)胞膜蛋口提取試劑盒和ecl化學(xué)發(fā)光底物購自thermo fisher公 司，0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液購自碧云天生物技術(shù)有限公司，硝酸纖維素膜購自whatman 公司。1.2蛋白酶k對(duì)細(xì)胞膜蛋白的消化處理 將1 x 10個(gè)tn細(xì)胞轉(zhuǎn)移到直徑為35 imn的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，27°c培養(yǎng)過夜使細(xì)胞 貼壁。吸去血清培養(yǎng)基，用無菌pbs緩沖液沖洗細(xì)胞3次（5min/次）。用無菌 pbs緩沖液稀釋蛋白酶k至50、100、150、200、250和300 n g/m l共6個(gè)終濃 度，分別加入到各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿屮，37°c孵育30 mine然后加入蛋口酶抑制

14、劑 終止反應(yīng)，吸去上清，用無菌pbs緩沖液沖洗細(xì)胞3次（5 min/次）。1. 3細(xì)胞活力測(cè)定適當(dāng)稀釋制備tn細(xì)胞懸液。向細(xì)胞懸液中加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液，使臺(tái)盼藍(lán)終濃 度為0.04%。在3min內(nèi)用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，死細(xì)胞被染成 淡藍(lán)色，計(jì)算活細(xì)胞在總細(xì)胞屮所占比率。要求在3 min內(nèi)完成死細(xì)胞計(jì)數(shù)，以 免部分活細(xì)胞tn被染色，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。1.4病毒對(duì)細(xì)胞的吸附實(shí)驗(yàn)吸去tn細(xì)胞培養(yǎng)皿中的上清，加入病毒上清，4°c溫和振蕩孵育lh。吸去上清, pbs緩沖液沖洗3次（5 min/次），加入2. 5%多聚甲醛室溫下固定20mino棄上 清，pbs 沖洗 3 次（5

15、min/次）,加入 0. 5%triton x-100,放置 15 min。棄上 清，pbs沖洗3次（5min/次），加入以1 ： 200體積比稀釋的gp64抗體，室溫 下孵育1 ho棄上清，pbs沖洗3次（5 min/次），加入1 ： 500體積比稀釋的羅 丹明標(biāo)記羊抗鼠二抗，室溫孵育45 mine棄上清，pbs沖洗3次（5 min/次），加 入dapi染核，棄上清，pbs沖洗3次（5 min/次），最后觀察熒光。1.5 bv病毒粒子的分離純化參照文獻(xiàn)15,以m0i二0. 1的病毒液感染tn細(xì)胞，感染后120 h收集上清。上 清9 000 r/min離心20 min,至少重復(fù)3次，以去除殘留

16、的細(xì)胞碎片。隨后病 毒上清在4°c條件下100 000 g離心90 min,管底的黃色沉淀即為bv病毒粒子。 將沉淀重懸于0. 5 m l 0. 1xte溶液中，將病毒懸液平鋪到250560 g/l蔗糖-10 mmol/l tris-ilcl （p ii 7. 5）密度梯度溶液的頂部,4°c條件下100 000 g離心 90 min,收集白色的病毒粒子帶。加入4倍體積預(yù)冷的0. 1xte溶液洗滌2次，每 次洗滌完畢后均在4°c條件下100 000 g離心90 min,棄上清，最后用0. 2 m l 的0. 1xte溶液重懸病毒粒子，-20°c保存?zhèn)溆谩?

17、.6 tn細(xì)胞膜蛋白的提取用細(xì)胞刮棒將約5x10個(gè)tn細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面刮下，細(xì)胞懸液300 g離心5 min, 收集細(xì)胞，棄上清。pbs緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，300 g離心5 min,重復(fù)3次。 按照膜蛋白提取試劑盒說明書加入裂解液混勻，4°c孵育10 mine 4°c條件下16 000 g,離心15 min,棄上清,加入增溶緩沖液重懸沉淀，4°c孵育30 min。再 于4°c條件下16 000 g離心15 min,上清即為細(xì)胞膜蛋白。吸取上清至新的離 心管屮，-80°c保存?zhèn)溆谩?.7病毒覆蓋蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（v0pba） 對(duì)tn細(xì)胞的膜蛋白進(jìn)行s

18、ds-page電泳分離，再將細(xì)胞膜蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素 膜（7c膜）上。參照文獻(xiàn)的方法，將轉(zhuǎn)印有細(xì)胞膜蛋白的nc膜用含2%牛血 清白蛋白的pbs溶液封閉30 min,隨后加入純化的bv病毒粒子，4°c溫和振蕩 孵育過夜。棄上清，用pbst緩沖液沖洗3次（5 min/次），加入1 ： 1 000體積 比稀釋的gp64鼠單抗,室溫孵育lh。棄上清，pbst沖洗3次（5 min/次），加 入1 ： 5 000體積比稀釋的hrp標(biāo)記羊抗鼠二抗，室溫孵育45 min。棄上清，pbst 沖洗3次（5 min/次）。加入ecl化學(xué)發(fā)光底物，膠片曝光。1.8細(xì)胞膜蛋白的質(zhì)譜鑒定對(duì)tn細(xì)胞的膜蛋口進(jìn)行

19、sds-page電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色，比對(duì)v0pba實(shí)驗(yàn) 結(jié)果將相應(yīng)的條帶分別割下，分別轉(zhuǎn)入無菌離心管中，對(duì)其進(jìn)行酶解。采用 4800 plus maldi tof/tof串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國abi公司）對(duì)蛋白質(zhì)酶解 后的樣品進(jìn)行鑒定。2結(jié)果與分析2.1蛋白酶k消化細(xì)胞膜蛋白阻斷病毒對(duì)tn細(xì)胞的感染使用不同濃度的蛋白酶k孵育tn細(xì)胞，使蛋白酶k消化處理細(xì)胞膜蛋白，然后 以moi二10的感染劑量接種病毒（ac-egfp） , 24 h后觀察細(xì)胞被感染的情況。 結(jié)果顯示，用質(zhì)量濃度為50 u g/m l的蛋白酶k消化處理細(xì)胞后，在熒光顯微鏡 下可觀察到大部分細(xì)胞能夠被ac-egfp感染發(fā)岀

20、綠色熒光，用facs cali bur流 式細(xì)胞儀（美國bd公司）檢測(cè)熒光細(xì)胞的比率發(fā)現(xiàn)，熒光細(xì)胞比率（細(xì)胞感染 率）接近100%;當(dāng)?shù)鞍酌竗質(zhì)量濃度上升至150 y g/m l時(shí)，接種病毒后大部分 細(xì)胞仍然能夠被感染；直到蛋白酶k質(zhì)量濃度達(dá)到200 m g/m l時(shí)，細(xì)胞感染率才 下降至49%;當(dāng)?shù)鞍酌竗質(zhì)量濃度達(dá)到300 y g/m l時(shí)，細(xì)胞感染率下降至9. 7% （圖1-a和圖1-0 o為了確認(rèn)蛋口酶k消化細(xì)胞導(dǎo)致感染率下降不是因?yàn)榧?xì)胞活力下降造成的，我 們對(duì)蛋白酶k消化處理的tn細(xì)胞活力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，用蛋白酶k消化處 理細(xì)胞并沒有導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著下降（圖1-b）。這些結(jié)果說明，

21、蛋白酶k消化 處理細(xì)胞膜蛋白阻斷了病毒感染細(xì)胞，初步確認(rèn)了 tn細(xì)胞膜蛋白在病毒感染過 程屮的關(guān)鍵作用。2. 2蛋白酶k消化細(xì)胞膜蛋白阻止bv病毒粒子吸附tn細(xì)胞膜的作用為了確認(rèn)蛋白酶k消化細(xì)胞膜蛋白阻斷病毒感染tn細(xì)胞的原因是否是因?yàn)椴《?粒子無法吸附細(xì)胞膜造成的，我們用bv病毒粒子與蛋白酶k消化處理后的tn 細(xì)胞在4°c條件下孵育1 h,然后用pbs緩沖液沖洗掉未吸附在細(xì)胞膜上的病毒 粒子，再用gp64抗體和羅丹明標(biāo)記羊抗鼠二抗檢測(cè)吸附在細(xì)胞膜上的病毒粒子, 通過觀察紅色熒光判斷病毒粒子的吸附情況。結(jié)果顯示，未經(jīng)蛋口酶k消化的 tn細(xì)胞明顯可以觀察到病毒粒子吸附在細(xì)胞膜上，而用3

22、00 ng/ml蛋白酶k消 化后的tn細(xì)胞，病毒粒子則無法吸附到細(xì)胞膜上（圖2） o這些結(jié)果說明，蛋 白酶k消化細(xì)胞膜蛋白阻止了病毒吸附細(xì)胞膜，進(jìn)一步確認(rèn)了 ac mnpv的囊 膜蛋白gp64在tn細(xì)胞膜上的互作分子是蛋白質(zhì)。活細(xì)胞比率/ % rate of live cells0 50 100 150x閉口bk)二匚protease圖1用蛋白酶k消化細(xì)胞膜蛋白阻斷ac-egfp病毒感染tn細(xì)胞的效果fig. 1 effects of blocking the virus ac-egfp from infecting tn cells by digesting cell membrane pr

23、oteins with protease k 卜載原圖a.病毒感染不同濃度蛋白酶k處理細(xì)胞的觀察b.不同濃度蛋白酶k處理后的細(xì) 胞活力c.不同濃度蛋口酶k處理后細(xì)胞的感染率a. infection of tn cells digested with different concentrations of protease k by ac-egfp b. cell viability after treatments by different concentrations of protease k c. infection rates of cel 1s digested with diffe

24、rent concentrations of protease k.gp64抗體anti-gp64對(duì)照controlgroup蛋白酶k處理treatment withprotease k10 pim圖2用300 n g m l蛋白酶k處理tn細(xì)胞后bv病毒粒子對(duì)細(xì)胞的吸附觀察fig. 2 observation on attachment of bv virus particles onto tn cells digested with 300 m g m lprotease k 下載原圖2. 3 tn細(xì)胞膜上與bv囊膜蛋白gp64的互作蛋白分子鑒定提取tn細(xì)胞膜蛋白，通過sds-page電泳

25、分離后轉(zhuǎn)卬至nc膜上，將其與純化的 bv病毒粒子孵育，然后用gp64抗體檢測(cè)病毒粒子。結(jié)果顯示，bv病毒粒子可以 結(jié)合到3個(gè)細(xì)胞膜蛋白的條帶上，它們的分子質(zhì)量分別是44 k d、27 k d和19 k d (圖3)。從tn細(xì)胞膜蛋口 sds-page電泳凝膠相對(duì)應(yīng)的位置切下蛋口質(zhì)條 帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，44 k d和27 k d的條帶被鑒定為肌動(dòng)蛋白(actin) , 19 k d 的條帶被鑒定為翻譯控制腫瘤蛋白(translationally-controlled tumor protein, tctp),結(jié)果見表1。這些結(jié)果證明在tn細(xì)胞膜上存在與ac mnpv的 bv互作的蛋白質(zhì)分子。而為何

26、在電泳凝膠中分子質(zhì)量差異明顯的2個(gè)條帶都被 鑒定為actin,推測(cè)可能是在蛋口質(zhì)提取過程屮由于體內(nèi)或體外的因素，導(dǎo)致 actin發(fā)生剪切或降解。i n mkd55433426 圖3病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定tn細(xì)胞膜上與bv病毒粒子囊膜蛋白gp64的互 作蛋白 fig. 3 identification of tn cell membrane proteins interacting with bv virus particles using virus overlay protein binding assay 下載 原圖sf9細(xì)胞蛋口(泳道i)、tn細(xì)胞蛋白(泳道ii)、病毒感染sf9細(xì)胞蛋

27、白(泳 道iii)和病毒感染tn細(xì)胞蛋白(泳道iv)通過10%的sds-page電泳分離，然后 轉(zhuǎn)卬至硝酸纖維素膜上，gp64抗體檢測(cè)作為對(duì)照。sf9細(xì)胞(泳道v)和tn細(xì) 胞(泳道vi)細(xì)胞膜蛋白通過10%的sds-page凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)印至硝酸 纖維素膜上。純化的bv病毒粒子覆蓋膜上，互作蛋白條帶以gp64抗體檢測(cè)。在 泳道v未見條帶，在泳道vi可見3個(gè)條帶。泳道vii是蛋口質(zhì)分子質(zhì)量markero 相應(yīng)的sds-page電泳凝膠(泳道訓(xùn))經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，將對(duì)應(yīng)的3個(gè)條帶 切下進(jìn)行質(zhì)譜分析。proteins from sf9 cells ( i ) , from tn cells

28、 (11) , from sf9 cel 1 s inf ected by virus (iii) , and from tn cel is in fected by virus (iv) were isolated bylo%sds-page and transferred onto nitrocellulose membrane. nitrocellulose membrane was detected by gp64 antibody. cell membrane proteins from sf9 cells (v) and tn cells (vi) were isolated by

29、 10%sds-page and transferred onto nitrocellulose membrane. purified bv virus particles were overlaid on the membrane. the interacting proteins were detected by using gp64 antibody. no band was seen in lanev (sf9), and three bcinds were seen in lanevi (tn) umevhwas the protein moleculeir weight marke

30、r. coomassie blue stain profile (viii) of a similar gel electrophoresis was used to excise the corresponding bands for mass spectrometric analysis.表1病毒覆蓋蛋白結(jié)合試驗(yàn)鑒定的3個(gè)細(xì)胞膜蛋白條帶的質(zhì)譜分析信息table 1 mass spectromctrie analysis of 3 membrane protcins identificd with virus overlay protein binding assay下載原表分子質(zhì)量/ kd

31、molecular weight鑒定蛋白質(zhì)4identified proteii44肌動(dòng)蛋白a2719肌動(dòng)蛋白a翻譯控制腫瘤translalionally-<x)ntrolle(l tu3討論目前為止被確認(rèn)的病毒受體分子絕大多數(shù)為蛋白質(zhì)。為了確認(rèn)ac mmpv的bv感 染是否與細(xì)胞表面蛋口質(zhì)有關(guān)，本研究用蛋口酶k消化tn細(xì)胞，破壞其細(xì)胞膜 蛋白，觀察這一處理過程能否降低bv對(duì)tn細(xì)胞的感染率。當(dāng)使用質(zhì)量濃度 <200 u g/m l的蛋白酶k消化處理細(xì)胞后，病毒粒子對(duì)細(xì)胞的感染率接近100%; 蛋白酶k的質(zhì)量濃度>200 h g/m l,病毒粒子對(duì)細(xì)胞的感染率呈現(xiàn)下降趨勢(shì);當(dāng)

32、消 化處理使用的蛋白酶k質(zhì)量濃度達(dá)到300 u g/m l,幾乎阻斷了病毒對(duì)細(xì)胞的感 染。顯然細(xì)胞膜上膜蛋口的量與細(xì)胞對(duì)于病毒的易感性成正相關(guān)。這些結(jié)果初步 證明膜蛋白在bv入侵細(xì)胞過程中具有重要作用。有趣的是，當(dāng)細(xì)胞被300 u g/m l的蛋白酶k消化處理后，經(jīng)過72h的培養(yǎng)生長，細(xì)胞的感染率乂重新達(dá)到 100%。我們推測(cè)，因?yàn)榈鞍酌竗消化并沒有影響細(xì)胞活力，經(jīng)過72h的生長，細(xì) 胞又重新合成細(xì)胞膜蛋白并展示于細(xì)胞表面，恢復(fù)了對(duì)于病毒的易感性。通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞膜上的病毒粒子吸附狀況，結(jié)果顯示蛋口酶k消化 細(xì)胞膜蛋白后阻礙了 bv病毒粒子對(duì)細(xì)胞的吸附。由此可見，細(xì)胞膜蛋白的完整 性受

33、到破壞后，嚴(yán)重影響了病毒粒子與細(xì)胞表面蛋白質(zhì)分子的相互作用，進(jìn)一 步證明bv囊膜蛋白gp64的互作分子之一是細(xì)胞膜蛋白o(hù) vopba實(shí)驗(yàn)鑒定到在tn 細(xì)胞膜蛋白中，直接與gp64發(fā)牛相互作用的是分子質(zhì)量分別為44 k d、27k d 和19kd的蛋片質(zhì)條帶，質(zhì)譜鑒定分別是actin和tctp蛋白。值得思考的是，同 樣是ac mnpv的易感細(xì)胞，sf9的細(xì)胞膜蛋口并未通過vopba的方法檢測(cè)到結(jié)合 條帶。分析原因可能是因?yàn)関opba方法的缺點(diǎn)在于只能檢測(cè)單一多肽分子與病毒 的互作，如果與病毒互作的蛋白質(zhì)是復(fù)合體或蛋白質(zhì)在處理過程中喪失活性， 則很可能就無法用此方法檢測(cè)到互作蛋白。因此，并不能就此

34、排除sf9細(xì)胞膜中 存在與病毒發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)的可能性。actin是胞漿蛋白，但是在細(xì)胞膜提取物屮也被鑒定到，表明提取方法并不能 完全將脂溶性的膜蛋口和水溶性的胞漿蛋口徹底分開。有充分的證據(jù)表明，在 bv囊膜與細(xì)胞膜融合，核衣殼進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)過程中，定位于核衣殼末端的衣殼蛋 白pp78/83可以通過激活arp2/3復(fù)合物的途徑導(dǎo)致actin聚集從而使桿狀病毒 核衣殼獲得運(yùn)動(dòng)能力，這一作用在桿狀病毒核衣殼由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到核衣殼的過 程中起到重要作用17-18。actin在病毒核衣殼組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程屮也具有重要 作用19。但是，顯然actin不太可能定位于細(xì)胞膜上并具有病毒受體的功能。tctp是一類在

35、進(jìn)化中高度保守、在細(xì)胞內(nèi)含量豐富的管家蛋白。tctp在多個(gè)生 物學(xué)進(jìn)程中具有重要作用，包括細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化 等等，它可與細(xì)胞中的多種蛋白質(zhì)，諸如x射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白(x-ray repair crosscomplcmcnting 6, xrcc6)、b-肌動(dòng)蛋口(b pctin, actb)、 微管蛋白(tubulin alpha lc, tl'baic)、熱激蛋白(heat shock protein 70, hsp70)等結(jié)合發(fā)生和互作用20。據(jù)報(bào)道，tctp蛋白的n端包含一段具有細(xì)胞 穿透功能的疏水序列，此序列名為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域(protein tra

36、nsduction domains, ptd) 21。ptd 又名細(xì)胞穿透多肽序列(cel 1 -penetraxin peptides, cpp),在多種蘇及病毒蛋口質(zhì)屮都有出現(xiàn)，其功能為促進(jìn)蛋口質(zhì)分子穿過細(xì) 胞膜進(jìn)入細(xì)胞或組織，研究顯示tctp的ptd序列引導(dǎo)綠色熒光蛋白egfp通過內(nèi) 吞作用進(jìn)入細(xì)胞，因而可觀察到細(xì)胞發(fā)出的綠色熒光陛1。如前所述，ac mnpv 的bv病毒粒子入侵細(xì)胞也是通過gp64與受體分子互作介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。因此， bv與tn細(xì)胞膜結(jié)合后，是否通過由gp64和tctp互作介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞, 需要進(jìn)一步的研究。而tctp的高度保守性也初步解釋了為何ac mnpv的

37、bv病毒 粒子能夠進(jìn)入包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞。綜上所述，ac mnpv的bv囊膜蛋白gp64與tn細(xì)胞膜蛋白存在互作，并通過vopba 以及質(zhì)譜的方法鑒定到tctp是候選的細(xì)胞表面的互作蛋白。本研究對(duì)桿狀病毒 感染宿主細(xì)胞時(shí)與細(xì)胞表面蛋白的相互作用進(jìn)行了初步探索，豐富了桿狀病毒 gp64蛋白與受體的相互作用機(jī)制的研究信息。參考文獻(xiàn)1theilmann d a, blissard g w, bonning b, et al.baculoviridaem/fauquet c m, mayo m a, ma7il0ff j, et al.virus taxonomy-eighth repor

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