葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的制備及其抗腫瘤活性研究

1、. 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（51103180），天津市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目（11JCYBJC02400） 作者簡(jiǎn)介：張琳華，女，副研究員 研究方向：生物材料與藥物緩控釋 *通訊作者：孫洪范，男，研究員 研究方向：生物材料與藥物緩控釋Email: sunhf, Tel:(022)87892052葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的制備及其抗腫瘤活性研究張琳華，馬桂蕾，宋存先，孫洪范*（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192）摘要： 目的 制備新型葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡，研究其理化性質(zhì)、細(xì)胞毒性和體內(nèi)抗腫瘤活性。方

2、法 以兩親性三嵌段共聚物聚己內(nèi)酯-b-聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯（PCL-b-PEG-b-PCL）、甲氧基聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（mPEG2000-DSPE）、偶聯(lián)葉酸的磷脂DSPE-PEG(2000) Folate共混物為載體材料，通過薄膜-超聲分散法制備出葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)、粒徑及其分布、Zeta電位、載藥量及包封率、體外釋放等表征，用CCK-8法研究了聚合物納米囊泡對(duì)H1299肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并評(píng)價(jià)其在BALB/c小鼠EMT-6乳腺癌模型中的抗腫瘤效果。結(jié)果 葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡呈球形，具有明顯的核-殼結(jié)構(gòu)，粒徑均勻。隨著紫杉醇投藥量的增加，納米囊泡

3、的粒徑增大，包封率降低。載藥30%的葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的平均粒徑為311 nm，多分散系數(shù)為0.171，Zeta電位為-30.3 mV，包封率為91.16%。體外釋放研究表明載紫杉醇聚合物納米囊泡基本無藥物突釋現(xiàn)象，具有緩釋特性。細(xì)胞毒性研究表明當(dāng)紫杉醇濃度為25µg·mL-1時(shí)，葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的細(xì)胞毒性低于相應(yīng)濃度的紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑。體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)研究表明，葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡對(duì)小鼠EMT-6乳腺癌具有明顯抑制作用，具有與紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑相似的抑制腫瘤作用。結(jié)論 葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡具有高載藥量及包封率、

4、均勻的粒徑及分布、緩釋特性、低毒和較好的抗腫瘤作用，是一種有潛力的紫杉醇緩控釋新劑型用于提高紫杉醇的藥效并且降低不良反應(yīng)。關(guān)鍵詞：紫杉醇；聚合物納米囊泡；聚己內(nèi)酯-b-聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯；葉酸靶向；細(xì)胞毒性；抗腫瘤活性Preparation, Characterization, In Vitro and In Vivo Studies on Folate-Targeted Biodegradable Polymersomes Loaded with PaclitaxelZHANG Lin-hua, MA Gui-lei, SONG Cun-xian, SUN Hong-fan. (Tian

5、jin Key Laboratory of Biomaterial Research, Institute of Biomedical Engineering, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300192, China)ABSTRACT: OBJECTIVE To prepare folate-targeted biodegradable polymersomes loaded with paclitaxel, and evaluate its physical a

6、nd chemical properties, in vitro cell cytotoxicity as well as in vivo antitumor activity. METHODS Folate-targeted biodegradable paclitaxel-loaded polymersomes composed of PCL-b-PEG-b-PCL、mPEG2000-DSPE and DSPE-PEG(2000) Folate were prepared by thin-film hydration and ultrasonic method, and character

7、ized in terms of morphology, particle size and size distribution, drug loading content, encapsulation efficiency and in vitro release. The cell cytotoxicity of folate-targeted biodegradable paclitaxel-loaded polymersomes in lung carcinoma H1299 cells was observed with CCK-8 assay. The in vivo antitu

8、mor activity was evaluated in BALB/c mice bearing the EMT-6 breast tumor models. RESULTS Folate-targeted biodegradable paclitaxel-loaded polymersomes showed spherical core-shell morphology with narrow size distribution. With the increase of drug-fed amount, the sizes of folate-targeted biodegradable

9、 paclitaxel-loaded polymersomes increased, while the drug encapsulating efficiency decreased. The folate-targeted biodegradable paclitaxel-loaded polymersomes with drug-loading content of 30% were found as spherical shape with the average particle diameter of 311 nm, polydispersity coefficient of 0.

10、171 and Zeta potential of -30.3 mV. The folate-targeted biodegradable paclitaxel-loaded polymersomes showed a continuous and steady release of PTX without initial burst release. At the paclitaxel concentration of 25µg·mL-1, the folate-targeted biodegradable paclitaxel-loaded polymersomes d

11、isplayed much less cell cytotoxicity than paclitaxel injections with Cremophor EL. The in vivo tumor inhibiting activity of folate-targeted biodegradable paclitaxel-loaded polymersomes was similar to that of paclitaxel injections with Cremophor EL in the same paclitaxel concentration. CONCLUSION The

12、 folate-targeted biodegradable paclitaxel-loaded polymersomes had high drug-loading content and drug encapsulating efficiency, more uniform size and size distribution, excellent drug sustainable-release behavior, less cytotoxicity, good antitumor activity similar to paclitaxel injections with Cremop

13、hor EL. Therefore, folate-targeted biodegradable paclitaxel-loaded polymersomes would be a novel paclitaxel preparation in clinic for the treatment of tumor.KEY WORDS: Paclitaxel; Nano-sized Polymersomes; PCL-b-PEG-b-PCL; Folate targeted; Cell cytotoxicity; Antitumor activity紫杉醇（paclitaxel，PTX）是從紅豆杉

14、屬植物紫杉的樹干和樹皮中提取得到的天然抗癌藥，臨床上主要用于卵巢癌、乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌的治療1,2。由于PTX在水中溶解度極低，臨床以聚氧乙烯蓖麻油和乙醇溶解后給藥，給藥后存在嚴(yán)重過敏反應(yīng)、腎毒性、神經(jīng)毒性、心臟毒性等不良反應(yīng)，使其臨床應(yīng)用受到限制3,4。為消除毒副作用，提高PTX在水中的分散性，設(shè)計(jì)新的更能被接受的劑型以淘汰含有Cremophor的傳統(tǒng)劑型成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，如微乳、膠束、囊泡、前體藥物、包合物、脂質(zhì)體、納米粒等5-11。聚合物囊泡（Polymersome）是由合成或天然改性的雙親性聚合物自組裝構(gòu)成、具有類似脂質(zhì)體雙層結(jié)構(gòu)的封閉空腔球體或類球體。相對(duì)于表面活性劑、脂質(zhì)體等小

15、分子囊泡，聚合物囊泡有著分子可設(shè)計(jì)性好、囊泡強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好、滲透性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn) 12,13。作為藥物載體時(shí),同脂質(zhì)體一樣具有組織相容性和細(xì)胞透過性,但不像脂質(zhì)體容易受氧化或水解,也不易泄漏藥物。藥物被聚合物囊泡包封后，可以起到增效、減毒、緩釋、增加藥物穩(wěn)定性和靶向等作用；表面修飾后，則可賦予囊泡在血液中長(zhǎng)循環(huán)和靶向等特性14,15。近年來，隨著大分子自組裝的飛速發(fā)展，以聚合物囊泡作為一類新型藥物載體的研究得到了廣泛的關(guān)注。葉酸是一種糖基化磷脂肌醇連接的膜糖蛋白，其受體在許多腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，而在絕大多數(shù)正常組織中幾乎不表達(dá)，同時(shí)葉酸無毒、免疫原性弱、穩(wěn)定, 與葉酸受體的結(jié)合力強(qiáng),對(duì)腫瘤有高度選

16、擇性16-18。因此，將葉酸連接到聚合物囊泡表面，賦予聚合物囊泡對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向性，可提高藥物在腫瘤組織中的濃度，減輕不良反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療。本研究以兩親性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL、甲氧基聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺mPEG2000-DSPE、偶聯(lián)葉酸的磷脂DSPE-PEG(2000) Folate為載體材料，通過分子自組裝制備出新型葉酸靶向的載紫杉醇聚合物納米囊泡，并對(duì)其特性進(jìn)行表征，研究其細(xì)胞毒性和體內(nèi)抗腫瘤活性，并與臨床應(yīng)用的紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑進(jìn)行比較。1 材料及儀器己內(nèi)酯單體（-CL）（純度>99%, 美國(guó)Aldrich公司）；聚乙二醇800

17、0（純度>99%，美國(guó)Sigma公司）；甲氧基聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺mPEG2000-DSPE（美國(guó)Avanti Polar Lipids 公司）；偶聯(lián)葉酸的磷脂DSPE-PEG(2000) Folate，（美國(guó)Avanti Polar Lipids 公司）；紫杉醇原料藥（純度>99%，中國(guó)重慶美聯(lián)制藥有限公司）；紫杉醇對(duì)照品（含量測(cè)定用，中國(guó)生物制品檢定所）；紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑(6 mg·mL-1 ×5 mL)（北京四環(huán)醫(yī)藥科技股份有限公司）；CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本）。高效液相色譜（美國(guó)Waters公司）；VC 501探頭超

18、聲儀（美國(guó)Sonics &Materials公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；Tecnai G 20 S-TWIN型透射電子顯微鏡（荷蘭FEI公司）；Malvern Nano ZS粒度及Zeta電位分析儀（英國(guó)Malvern公司）。2 方法2.1 PCL-b-PEG-b-PCL兩親性三嵌段共聚物的合成 在辛酸亞錫催化下，用聚乙二醇8000引發(fā)-己內(nèi)酯（-CL）開環(huán)聚合，合成了PCL-b-PEG-b-PCL兩親性三嵌段共聚物。準(zhǔn)確稱取7.5g-CL和7.5g PEG加入到經(jīng)硅烷化處理的干燥聚合管中，再將適量辛酸亞錫經(jīng)注射器加入聚合管。體系進(jìn)行抽真空-充氮?dú)膺^程反復(fù)3次，真

19、空封管，將其放入150恒溫油浴中反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后，將所得產(chǎn)物溶于少量二氯甲烷，傾入大量甲醇中重沉淀進(jìn)行純化，過濾后得到白色產(chǎn)物，在40下真空干燥至恒重即得到純化后的PCL-b-PEG-b-PCL兩親性三嵌段共聚物。對(duì)聚合物進(jìn)行了FT-IR、1H NMR、GPC表征。2.2 葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的制備 用薄膜-超聲分散法制備葉酸靶向載紫杉醇聚合物納米囊泡。將PCL-b-PEG-b-PCL、紫杉醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG(2000) Folate（70:30:3.5:0.35，w%）溶于二氯甲烷中，在茄形瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制成均勻薄膜，抽真空過夜除去殘留的有機(jī)溶劑。在茄

20、形瓶中加入雙蒸水于60水化1h，震蕩混勻，冰浴下使用探頭超聲儀超聲10 min，即得載藥納米囊泡分散液，12000 r·min-1離心30 min，收集下層沉淀，冷凍干燥得葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡。采取上述制備方法，在處方中不加DSPE-PEG(2000) Folate制備出mPEG-DSPE修飾的紫杉醇聚合物納米囊泡。2.3 葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的表征2.3.1 粒徑及其分布、的測(cè)定 室溫下取葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡混懸液適量，加蒸餾水稀釋10倍，置于Malvern Nano ZS粒度及Zeta電位分析儀中測(cè)定納米囊泡的粒徑大小及其分布、電位。2.3.2 形態(tài)的觀察

21、 取少量葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡混懸液滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，自然晾干后，于透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)。2.3.3 包封率和載藥量的測(cè)定使用HPLC法測(cè)定葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的包封率及載藥量。HPLC色譜條件：色譜柱為C18柱( Symetry，150 mm×4.6 mm, 5 mm)；流動(dòng)相為乙腈水(50:50, v/v)；流速為1.0 mL·min-1；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm；進(jìn)樣量20µl。 精密稱取紫杉醇納米囊泡5 mg，溶于5 ml乙腈中，加入蒸餾水定容至10 mL，用HPLC測(cè)溶液中紫杉醇的峰面積，結(jié)合紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算載藥量與包封率。

22、載藥量(%)=聚合物納米囊泡中紫杉醇的質(zhì)量×100%聚合物納米囊泡的質(zhì)量紫杉醇投藥量包封率（%）=聚合物納米囊泡中紫杉醇量×100%2.4 葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡體外釋放研究采用雙腔擴(kuò)散池法測(cè)定藥物體外釋放。精確稱取葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡2 mg，加入水楊酸鈉PBS（1M，pH 7.4）4.5 mL，震搖使其形成納米囊泡懸液,然后加入雙腔擴(kuò)散池(中間為0.22m孔徑的微孔濾膜)一側(cè)即釋放池,另一側(cè)為接收池亦加入水楊酸鈉溶液4.5 mL,置于37 ，130 r·min-1的恒溫?fù)u床中進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)。每隔一定時(shí)間,取出接收池的溶液作為釋放液,然后補(bǔ)充新鮮的水

23、楊酸鈉溶液4.5 mL。用二氯甲烷萃取釋放液中的紫杉醇，重復(fù)萃取后分離得到的紫杉醇二氯甲烷液中加入流動(dòng)相4.5 mL，在氮?dú)庀聯(lián)]干二氯甲烷直至溶液澄清，定容。用HPLC法（同上色譜條件）測(cè)定紫杉醇含量，計(jì)算釋放量并繪制累積釋放曲線。2.5 葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的細(xì)胞毒性研究2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) H1299常規(guī)培養(yǎng)于高糖DMEM完全培養(yǎng)液中(含10胎牛血清，100 U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素)，經(jīng)0.25胰蛋白酶溶液消化傳代，在37、飽和濕度、含5CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2.5.2 CCK-8法測(cè)定葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡對(duì)H1299細(xì)胞毒性細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值

24、-空白對(duì)照組OD值陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值×100%取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H1299細(xì)胞以每毫升1.5×104個(gè)的密度將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 µL，于接種后24h更換培養(yǎng)液，其實(shí)驗(yàn)組為紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑組（25µg·mL-1）、mPEG-DSPE修飾的紫杉醇載藥納米囊泡組（紫杉醇濃度25µg·mL-1）、葉酸靶向紫杉醇納米囊泡組（紫杉醇濃度25µg·mL-1）、葉酸靶向的空白納米囊泡組，對(duì)照組為陰性對(duì)照組（不加藥）、空白對(duì)照組（無細(xì)胞和無藥），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h、48h、7

25、2h、96h、120h后，小心吸棄孔板內(nèi)的上清液，各孔加入含CCK-8 10L的100L無血清培養(yǎng)液，37、5% CO2培養(yǎng)3 h后于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)光密度值。按下式計(jì)算細(xì)胞存活率，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線。2.6 抑瘤試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EMT-6乳腺癌細(xì)胞，配成5×106·mL - 1單細(xì)胞懸液，BALB/c小鼠腋下接種0.2 mL /只。待瘤體直徑約58 mm時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分為4組在瘤旁注射給藥，每組10只。對(duì)照組為注射滅菌生理鹽水，陽性組為注射紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑，治療組1：注射葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡，治療組2：注射mPEG-DSPE修飾的紫杉醇聚合

26、物納米囊泡，劑量均為紫杉醇量20 mg·kg-1，隔天給藥1次，共給藥7次。接種腫瘤25天后處死動(dòng)物，取腫瘤稱重，測(cè)量瘤塊長(zhǎng)、短徑，根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤體積、藥物制劑對(duì)腫瘤的重量抑制率和體積抑瘤率。腫瘤體積（V）=1/2×長(zhǎng)徑×短徑2重量抑瘤率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重對(duì)照組平均瘤重）×100%體積抑瘤率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均體積對(duì)照組平均體積）×100%2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，對(duì)比較的樣本進(jìn)行 t 檢驗(yàn), P < 0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 結(jié)果與討論3.1 葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的表征葉酸

27、靶向紫杉醇納米囊泡的透射電鏡圖如圖1所示，載藥納米囊泡呈球形，大小均勻，具有明顯的核-殼結(jié)構(gòu)。說明兩親性嵌段共聚物在水中自組裝成具有核-殼結(jié)構(gòu)的納米囊泡，載藥后，由于紫杉醇依靠疏水作用協(xié)同進(jìn)入，均勻分散在納米囊泡的核中，形成具有核殼結(jié)構(gòu)的載藥納米囊泡。在制備過程中，加入mPEG2000-DSPE及DSPE-PEG(2000) Folate修飾后，由于其一端的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)親脂性較強(qiáng)，可以插入到納米囊泡里面，柔順的PEG長(zhǎng)鏈留在納米囊泡表面，與納米囊泡表面本身攜帶的PEG共同賦予聚合物囊泡長(zhǎng)循環(huán)特性，可延長(zhǎng)在血液中的循環(huán)時(shí)間而不被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)捕獲，通過EPR效應(yīng)，

28、使載藥囊泡被動(dòng)靶向聚集在腫瘤部位，同時(shí)通過葉酸受體介導(dǎo)的方法將藥物主動(dòng)靶向濃集于葉酸受體豐富的腫瘤部位，達(dá)到腫瘤靶向治療的目的19,20。用Malvern Nano ZS粒度及Zeta電位分析儀對(duì)制備出的葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡進(jìn)行粒徑及其分布、Zeta電位測(cè)定。載藥30%的葉酸靶向紫杉醇納米囊泡的平均粒徑為311 nm，多分散系數(shù)為0.171，Zeta電位為-30.3 mV。Zeta電位與納米囊泡體系的穩(wěn)定性密切相關(guān)，本研究制備的葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡具有較高的Zeta電位，由于電子排斥力不容易發(fā)生聚集，納米囊泡能穩(wěn)定地分散于溶液中，屬于熱力學(xué)穩(wěn)定體系。 圖1 葉酸靶向紫杉醇聚合物

29、納米囊泡的透射電鏡圖（載藥量30%）Figure.1 Transmission electron micrograph ( TEM ) of folate targeted PTX-loaded polymersome with drug-loaded amount of 30%.圖2 葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡粒徑及其分布圖（載藥量30%）Figure.2 Size and size distribution of folate targeted PTX-loaded polymersome with drug loaded amount of 30%. 不同投藥量對(duì)葉酸靶向紫杉醇聚合物納

30、米囊泡的制備影響如表1所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著投藥量的增加載藥納米囊泡粒徑增大，包封率有所降低，紫杉醇投藥量達(dá)到50時(shí)，實(shí)際載藥量比理論載藥量顯著降低，30投藥質(zhì)量量所得納米囊泡的平均粒徑為311.0 nm，包封率達(dá)到91.16%，以上數(shù)據(jù)說明，在制備葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡時(shí)，紫杉醇投藥量以不超過30%為宜，以免成本過高。表1 投藥量對(duì)葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的影響Tab.1 Influence of PTX fed amount on the preparation of folate targeted PTX-loaded polymersomePTX fed amount / %D

31、LC/ %EE / %Size / nm10.098.7995.11259.720.1217.5092.98286.830.0126.0891.16311.050.2430.2160.12401.13.2 葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的體外釋放由于紫杉醇在水中溶解度極低,為了達(dá)到釋放的漏槽條件,需選擇一定的釋放介質(zhì)。有機(jī)溶劑和表面活性劑可作為釋放介質(zhì),但是其對(duì)釋放動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性的潛在影響的研究不充分并常常被忽視。本實(shí)驗(yàn)選擇水楊酸鈉溶液作為葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的體外釋放介質(zhì),使其在較小體積釋放液中就能達(dá)到漏槽條件21。載藥量為30%的葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡體外釋放曲線見圖3，由圖可

32、知，在體外釋放過程成基本沒有突釋現(xiàn)象，說明聚合物納米囊泡表面幾乎沒有吸附藥物，藥物都被包裹在囊泡內(nèi)部。在前5天，紫杉醇的累積百分釋放量與時(shí)間呈良好的線性關(guān)系，為零級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)模型（R0.994），零級(jí)釋放能確保藥物隨時(shí)間釋放的量保持穩(wěn)定，從而最大限度減少潛在的峰/谷波動(dòng)及副作用，并最大限度地延長(zhǎng)藥物濃度處于治療窗（有效性）的時(shí)間。隨后，藥物釋放減緩，釋放28天后，累積百分釋放量約為98.7%，紫杉醇基本釋放完全。葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡具有良好的藥物緩釋作用。圖3 葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的體外釋放曲線 (n=3)Fig.3 In vitro release profile of fo

33、late targeted PTX-loaded polymersome (n=3)3.3 葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的細(xì)胞毒性研究本研究用CCK-8法研究了臨床應(yīng)用的紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑、mPEG-DSPE修飾的載紫杉醇聚合物納米囊泡、葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡及空白納米囊泡對(duì)H1299肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。紫杉醇在人體血漿中可存在的濃度范圍是0.025µg·mL-1至25µg·mL-1 9，本研究中細(xì)胞培養(yǎng)液中紫杉醇濃度為25µg·mL-1，為紫杉醇在人體血漿中可存在的最大濃度。CCK-8法比較各組對(duì)H1299肺癌細(xì)胞的

34、生長(zhǎng)抑制曲線如圖4，由圖可見，加入紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑的細(xì)胞存活率在細(xì)胞培養(yǎng)24h時(shí)大幅下降，72h后細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎完全被抑制?？瞻兹~酸靶向的聚合物納米囊泡對(duì)細(xì)胞沒有毒性，細(xì)胞存活率一直保持近100%。mPEG-DSPE修飾及葉酸靶向載紫杉醇納米囊泡的細(xì)胞存活率均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，與mPEG-DSPE修飾的載紫杉醇納米囊泡相比，葉酸靶向紫杉醇納米囊泡對(duì)細(xì)胞毒性更強(qiáng)，在培養(yǎng)96h后，細(xì)胞存活率為19.73%，而mPEG-DSPE修飾的納米囊泡細(xì)胞存活率為30.08%。與紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑細(xì)胞存活率變化相比，mPEG-DSPE修飾及葉酸靶向載紫杉醇納米囊泡的細(xì)胞存活率在各時(shí)間

35、點(diǎn)均高于紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑組，這可能是由于紫杉醇注射劑直接作用于細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的殺傷力較大，而紫杉醇包載在納米囊泡中后從納米囊泡中釋放出來受到載體的影響，需要一定的時(shí)間，在同一作用時(shí)間點(diǎn)，培養(yǎng)液中的藥物含量小于紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑。圖4 紫杉醇注射劑、mPEG-DSPE修飾的載紫杉醇聚合物納米囊泡、葉酸靶向載紫杉醇聚合物納米囊泡（紫杉醇濃度25µg·mL-1）、葉酸靶向空白聚合物納米囊泡（聚合物濃度10 mg/mL）在不同作用時(shí)間對(duì)H1299肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線（n=6，±s）。Fig.4 H1299 cell viability after 24

36、h, 48h, 72h and 96h treatment by Taxol®, mPEG-DSPE modified PTX-Polymersome, Folate targeted PTX-Polymersome at the paclitaxel concentration of 25µg/mL, respectively, and folate drug-free polymersome at polymers concentration of 10 mg/mL. 3.4 紫杉醇聚合物納米囊泡對(duì)荷EMT-6乳腺癌BALB/c小鼠抑瘤作用在體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)中，以生理

37、鹽水為對(duì)照，比較了mPEG-DSPE修飾載紫杉醇納米囊泡、葉酸靶向載紫杉醇納米囊泡和紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射液對(duì)荷EMT-6乳腺癌小鼠的抑瘤作用，結(jié)果見表2。生理鹽水組的荷瘤小鼠腫瘤增長(zhǎng)最快，重量和體積最大；紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射液組、mPEG-DSPE修飾載紫杉醇納米囊泡組、葉酸靶向載紫杉醇納米囊泡組對(duì)腫瘤均有抑制作用，給藥后腫瘤的重量和體積均明顯低于對(duì)照組(P< 0.05)，但相同劑量條件下，陽性組和葉酸靶向載紫杉醇納米囊泡組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明葉酸靶向載紫杉醇納米囊泡對(duì)BALB/c小鼠EMT6乳腺癌的生長(zhǎng)具有與紫杉醇注射液相似的抑制作用。與mPEG

38、-DSPE修飾載紫杉醇納米囊泡組相比，葉酸靶向載紫杉醇納米囊泡組對(duì)腫瘤抑制作用較強(qiáng)(P<0.05)。表2. 葉酸靶向載紫杉醇納米囊泡對(duì)荷EMT-6乳腺癌BALB/c小鼠抑瘤效果（n=10，±s）Tab.2 Anti-tumor activity of folate targeted PTX-loaded polymersome on BALB/c mice bearing EMT6 mammary tumors (n=10，±s)GroupAnimal amountBegin/endWeight of animal/gWeight of tumor/gInhibiti

39、ng rate of tumor weight/%Volume of tumor/mm3Inhibiting rate of tumor volume/%BeginEndControl group10/820.10±1.6321.23±1.771.356±0.21 1238.71±347.74Paclitaxel injection10/819.81±1.4217.84±1.350.44±0.11*67.55378.53±94.63*69.44mPEG-DSPE modified PTX-Polymersome10

40、/819.75±1.5920.23±1.680.74±0.16*45.74639.42±144.17*48.38Folate targeted PTX-Polymersome10/919.61±1.4719.90±1.560.48±0.13*64.60423.93±114.88*65.78*P < 0.05 vs control group4 結(jié)論本研究成功地以兩親性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL、mPEG2000-DSPE及DSPE-PEG(2000) Folate為載體材料，通過分子自組裝制備

41、出新型葉酸靶向載紫杉醇聚合物納米囊泡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葉酸靶向載紫杉醇聚合物納米囊泡的細(xì)胞毒性低于相應(yīng)濃度的紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑，但對(duì)荷EMT-6乳腺癌BALB/c小鼠的腫瘤生長(zhǎng)具有與紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑類似的抑制作用。與mPEG-DSPE修飾的載紫杉醇納米囊泡相比，葉酸靶向的載紫杉醇納米囊泡對(duì)細(xì)胞毒性更強(qiáng)、對(duì)荷EMT-6乳腺癌BALB/c小鼠腫瘤抑瘤作用更強(qiáng)，表明運(yùn)用腫瘤細(xì)胞表面有大量葉酸受體這一特性，通過葉酸靶向作用將納米囊泡導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)能有效提高抑制腫瘤的能力。REFERENCES1 SINGLA A K, GARG A, AGGARWAL D. Paclitaxel a

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