凱氏定氮法測大豆中總氮含量的實驗條件分析

1、 分析檢驗方案設(shè)計與實施綜合報告分析檢驗方案設(shè)計與實施綜合報告 題題目目： 凱凱氏氏定定氮氮法法測測大大豆豆中中總總氮氮含含量量的的實實驗驗條條件件分分析析 姓姓 名：名： 孟照明孟照明 學(xué)學(xué) 號：號： 20 號號 專業(yè)班級：專業(yè)班級： 分析分析 3126 班班 指導(dǎo)教師：指導(dǎo)教師： 姜老師姜老師 王老師王老師 分析檢驗方案設(shè)計與實施- 1 - 凱凱氏氏定定氮氮法法測測大大豆豆中中總總氮氮含含量量的的實實驗驗條條件件分分析析摘 要 將蛋白質(zhì)樣品在硫酸銅的催化下，用氧化性試劑消化分解轉(zhuǎn)化為銨離子，然后將含有銨試液置于蒸餾瓶中，加高濃度堿使銨離子轉(zhuǎn)化為氨，然后與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，再加熱蒸餾，用過

2、是的標(biāo)準(zhǔn)硼酸溶液吸收氨氣，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H2B03，以甲基紅作為指示劑，測出含氮量，將結(jié)果乘以換算系數(shù)，計算出粗蛋白質(zhì)含量。關(guān)鍵詞：凱氏定氮儀;消化時間;蒸餾;滴定。 分析檢驗方案設(shè)計與實施- 2 -目 錄摘 要 .I第 1 章 前言 .3 1.1 本課題的來源、目的及意義 .3 1.2 課題背景及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 .3第 2 章 實驗部分 .4 2.1 實驗原理 .4 2.2 實驗藥品與儀器 .4 2.3 實驗內(nèi)容 .5 2.3.1 0.1molL 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)定.5 2.3.2 樣品消化 .5 2.3.3 滴定 .5第 3 章 結(jié)果與分析.63.1 國家標(biāo)準(zhǔn)測定結(jié)果 .63.

3、2 實驗最佳條件確定及過程分析 .7第 4 章 結(jié)論 .8 致謝 .9 參考文獻(xiàn) .9 - 3 -第一章 前言 蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)占有特殊的地位，它和核酸是構(gòu)成原生質(zhì)的主要成分，是生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)。食物中的蛋白質(zhì)是人體中氮的唯一來源。具有糖類和脂肪不可替代的作用。作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進(jìn)行、調(diào)節(jié)代謝、抵御外來物質(zhì)入侵及控制遺傳信息等方面都起著至關(guān)重要的作用。蛋白質(zhì)的分離與定性、定量分析是生物化學(xué)和其他生物學(xué)科、食品檢驗、臨床檢驗、疾病診斷、生物藥物分離提純和質(zhì)量檢驗中最重要的工作。蛋白質(zhì)是由 a 一氨基酸以酰胺鍵(肽鍵)相結(jié)合形成的結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜的高分子化合物，是生

4、物體中的主要含氮物質(zhì)。蛋白質(zhì)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、酶、激素、病毒、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和遺傳等密切相關(guān)，蛋白質(zhì)測定方法一般可分為間接方法和直接方法。間接方法是通過測定樣品中蛋白質(zhì)的含氮量進(jìn)行推算蛋白質(zhì)含量的方法。直接方法則是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，直接測定蛋白質(zhì)含量的方法。蛋白質(zhì)是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，與生命的起源和進(jìn)化都密切相關(guān)，因此蛋白質(zhì)也是生命科學(xué)中極為重要的研究對象。關(guān)于蛋白質(zhì)的分析研究，一直是化學(xué)家及生物學(xué)家極為關(guān)注的問題，其含量的測定在生化分析和臨床分析中具有重要意義，研究和開發(fā)新的、高靈敏度的蛋白質(zhì)測定方法是生物化學(xué)研究的一個活躍領(lǐng)域。測定蛋白質(zhì)的方法不斷發(fā)展，主要有凱氏

5、定氮法(國際經(jīng)典測定方法)、分光光度法、電化學(xué)法、滴定法、高壓液相色譜法、電泳法、免疫法等。了解各種蛋白質(zhì)測定方法的原理和技術(shù)特點，對在實際工作中選擇適宜的分析方法具有重要的指導(dǎo)意義。 蛋白質(zhì)是食品檢驗中經(jīng)常進(jìn)行檢測的項目。測定食品中蛋白質(zhì)的含量，了解食品的質(zhì)量，為合理配膳提供數(shù)據(jù)，保證不同人群對蛋白質(zhì)的需要，掌握食品的營養(yǎng)價值和品質(zhì)的變化，以達(dá)到合理利用食品資源。近年來，人們發(fā)展了許多測定蛋白質(zhì)的方法，如雙縮脲法、分光光度法、凱氏定氮法、紫外吸收法、染料結(jié)合法、質(zhì)譜分析法等，質(zhì)譜分析是測定結(jié)果最準(zhǔn)確的測定方法；凱氏定氮法適用范圍最廣泛，分光光度法是最為簡便快速的測定方法，但就方法的準(zhǔn)確性、精

6、密度以及應(yīng)用程度而言，國際經(jīng)典測定方法一凱氏定氮法為首選 ，該法也是相關(guān)專業(yè)學(xué)生必須掌握的經(jīng)典試驗方法之一?，F(xiàn)在盡管有很多先進(jìn)的自動或半自動凱氏定氮儀，但這些儀器不僅價格昂貴，且需專門試劑，目前尚難分析檢驗方案設(shè)計與實施- 4 -普及，而對大批量的學(xué)生試驗更不適合，所以凱氏定氮法適用范圍是目前分析含氮化合物最常用的方法。第二章 實驗部分2.1 實驗原理利用硫酸及催化劑與樣品加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中C、H形成CO2 和H2O逸出，而蛋白質(zhì)中的氮則轉(zhuǎn)化成(NH4)2SO4，在強堿條件下加熱蒸餾，其中NH3被硼酸吸收為(NH4)2B4O7，然后用標(biāo)準(zhǔn)的鹽酸溶液滴定，根據(jù)鹽酸的消耗量和濃度計算出氮

7、的含量，乘以蛋白質(zhì)系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。反應(yīng)式如下： 2CH3 CH一C00H+13H2SO4= (NH4)2SO4+6CO2+12SOz+16H2O | NH2 (NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+NazSO4+2H202NH3 +4H3BO3 = (NH4)2B4O7+5H2O (NH4)zB4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3根據(jù)原理測定過程可分為消化、蒸餾吸收、滴定三個過程。 2.2 實驗儀器與試劑 2.2.1 實驗儀器 凱氏定氮儀 一臺 分析天平 一臺 酸性滴定管 一個 微量滴定管 一個 錐形瓶 7 個 消化裝置 一臺 容量瓶 1 個 2.2.2 實驗試劑 硫

8、酸銅（CuSO45H20） 硫酸鉀 硫酸（密度為 1.8419g/L） - 5 - 硼酸溶液（20g/L） 氫氧化鈉溶液（400g/L） 0.1mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液。 混合指示試劑：0.1%甲基紅乙溶液液 1 份，與 0.1%溴甲酚綠乙醇溶液 5 份臨用時混合。 黃豆粉。 2.3 實驗內(nèi)容2.3.1 0.1molL 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)定配制：取鹽酸 9.0ml，加水適量使成 1000ml，搖勻，待標(biāo)定。標(biāo)定： 取在 270300干燥至恒重的基準(zhǔn)無水碳酸鈉約 0.15g，精密稱定，加水 50ml 使溶解，加甲基紅-溴甲酚綠混合指示液 10 滴，用本液滴定至溶液由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色時，煮

9、沸 2 分鐘，冷卻至室溫，繼續(xù)滴定至溶液由綠色變?yōu)榘底仙Ｃ?1ml 的鹽酸滴定液（0.1molL）相當(dāng)于 5.30mg 的無水碳酸鈉，根據(jù)本液的消耗量與無水碳酸鈉的取用量，算出本液的濃度，即得。滴定至近終點需煮沸 2 分鐘，是因為此時溶液中有大量 H2CO3，和 NaHC03，形成緩沖對，使終點不敏銳。若加熱煮沸可使 H2C03 分解為 C02 和 H20 而除去。 2.3.2 樣品消化稱取黃豆粉約 0.2g（0.001g），移入干燥凱氏燒瓶中，加入 0.5g 硫酸銅和 10g 硫酸鉀，加入 10mL 濃硫酸，放在通風(fēng)櫥中加熱消化，開始時用低溫加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止后，再升高溫度保

10、持微沸，消化至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，繼續(xù)加熱 0.5h，取下放冷，即為消化液。試劑空白實驗：取與樣品消化相同的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸，按以上同樣方法進(jìn)行消化，冷卻，即得試劑空白消化液。 2.3.3 滴定 將上述吸收液用 0.1molL 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定至由藍(lán)色變?yōu)槲⒓t色即為終點，記錄鹽酸溶液用量，同時做空白實驗，記錄消耗體積。 分析檢驗方案設(shè)計與實施- 6 -第三章 數(shù)據(jù)記錄與分析 3.1 國家標(biāo)準(zhǔn)測定結(jié)果 表 3-1 0.1molL 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)定數(shù)據(jù)記錄測定項目12 表 3-1 34m(稱樣前 NaOH)/g24.374424.243324.074123.9240 m(稱樣

11、后 NaOH)/g24.243324.074123.9240 23.7737m(NaOH)/g0.15010.15020.15011.1503V(消耗體積)/mL27.0227.0327.0227.04V0/mL0.00 C(HCl)/mol/L0.104810.104840.104810.10487平均 C(HCl)/mol/L0.1048相對極差/%0.06表 3-2 大豆粉總氮含量測定數(shù)據(jù)記錄測定項目1234m(NaOH)/g0.20060.20070.20040.2005V(消耗體積)/mL9.2209.2189.2199.221/%38.1038.1438.1338.10m(NaOH

12、)/g0.20070.20060.20040.2006V(消耗體積)/mL9.2219.2209.2189.220/%38.1038.1238.1438.12V0/mL 0.100平均/%38.12相對平均偏差/%0.04 分析：這組數(shù)據(jù)是按照國家標(biāo)準(zhǔn)操作完成的，消化時間為 90min。根據(jù)其數(shù)據(jù)與下面條件實驗做對比， 對濃硫酸、稱樣量、堿用量進(jìn)行實驗探究，選擇出它們的最佳用量，使消化時間大大降低，所測含量準(zhǔn)確，提高了凱氏定氮的速度和精確度。 - 7 -3.2 實驗最佳條件確定及過程分析表 3-3 大豆粉總氮含量測定數(shù)據(jù)記錄（改變稱樣量）測定項目1234m（試樣）/g0.20330.40120

13、.6030.801V(消耗體積)/mL9.240 19.200 27.420 36.620 m（試樣）/g0.2030.40210.60250.8012V(消耗體積)/mL9.24118.21227.41836.621V0/mL0.100 平均/%37.7237.7938.1438.32消化時間/min90|90140|140150|150180|180相對平均偏差/%0.080.190.040.00 分析：在不同稱樣量時，按國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行消化，根據(jù)數(shù)據(jù)分析可得，稱樣量的多少影響消化時間，為了節(jié)省時間，節(jié)約實驗成本，最佳稱樣量為:0.2000 g. 表 3-4 大豆粉總氮含量測定數(shù)據(jù)記錄（改變硫

14、酸用量）測定項目1234m（試樣）/g0.2010 0.20110.20120.2014V(消耗體積)/mL9.2289.230 9.24V(加入硫酸體積)/mL8101520m（試樣）/g0.20090.2010 0.20120.2014V(消耗體積)/mL9.2259.2669.238V(加入硫酸體積)/mL8101520 /% 38.07|38.0738.06|38.0638.08|38.08 平均/% 38.0738.0638.08消化時間/min1209010080相對平均偏差/%0.040.00 0.00 分析：樣品在消化時加入濃硫酸的量必須過量，一是脫水作用，將樣品中有機物脫水然

15、后碳化成 c；二是氧化作用，濃硫酸和硫酸鉀、硫酸銅一同加熱分析檢驗方案設(shè)計與實施- 8 -使溫度達(dá)到 400 以上，碳還原硫酸生成 SO3，而碳本身被氧化成 CO2；三是分解作用，將蛋白質(zhì)分解，SO2還原 N 生成 NH4 ，本身被氧化成 SO3；四是吸收作用，生成的 NH4 與濃硫酸反應(yīng)生成(NH4)2SO4 ；五是生成的(NH4)2SO4保存在濃硫酸溶液中不至于損失 。所以，在樣品為 0.2000g 時，硫酸加入量為10ml。這樣可以使消化時間大大降低，提高了凱氏定氮的速度。表 3-5 大豆粉總氮含量測定數(shù)據(jù)記錄（改變堿用量)測定項目1234m（試樣）/g0.20040.20070.200

16、30.2008V(NaOH)/mL40.00|40.0060.00|60.0080.00|80.00100.00|100.00V(消耗體積)/mL7.250|7.2519.216|9.2189.205|9.2079.220|9.221/%30.33|30.3338.49|38.5038.52|38.5438.49|38.50平均/%30.3338.538.5338.5相對平均偏差/%0.00 0.010.030.01 分析：蒸餾時必須加堿(可加入 NaOH)，加入堿的作用一是中和硫酸，二是使溶液處于強堿性，這樣才能使(NH4)2SO4 變成 NH3 被蒸餾吸收。堿的用量取決于消化時硫酸的用量和

17、堿的濃度，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)顯示，堿用量為 60ml。 第 4 章 結(jié)論 經(jīng)典的凱氏定氮法試樣消化階段必須有定氮催化劑與硫酸(比重184，無氮)參與，催化劑一般用 CuSO5H2O、K2SO 。但由于 CuSO45H O、K2SO4 和濃 H2SO4 的用量不合適，一方面導(dǎo)致消化時間過長，降低了分析化驗人員的工作效率，使教學(xué)試驗不能在規(guī)定的時間內(nèi)完成凱氏定氮的整個過程。另一方面，過量的催化劑與硫酸造成資源浪費及環(huán)境污染。在研究經(jīng)典的凱氏定氮法中，許多人只注重 CuSO5H O 和 K2SO4 用量,而忽略濃硫酸、稱樣量及堿用量對消化時間的影響。本研究對經(jīng)典的凱氏定氮法進(jìn)行了研究， 對濃硫酸、稱樣量及

18、堿的用量做了探究實驗，選擇出它們的最佳用量，使消化時間大大降低，提高了凱氏定氮的速度。試驗證明，該最佳條件對蛋白質(zhì)含量高的樣品還是蛋白質(zhì)含量低的樣品都能完成消化，這樣不僅能使學(xué)生課堂試驗?zāi)茉谝?guī)定的時間內(nèi)完成，也適合批量樣品中蛋白質(zhì)含量的消化測定，有一定的應(yīng)用價值。同時也提高分析化驗人員的工作效率和學(xué)生教學(xué)試驗及環(huán)境保護(hù)都有很大的益處。 - 9 - 由試驗結(jié)果看出，各因素對消化時間的影響是有差異的。以最佳條件作驗證試驗，消化時間僅為90 min。 致謝本實驗在姜老師、王老師的悉心指導(dǎo)和嚴(yán)格要求下得以完成，從課題選擇到具體的寫作過程，論文初稿與定稿無不凝聚著姜老師、王老師的心血和汗水，在我的實驗期間，姜老師、王老師為我提供了許多專業(yè)知識上的指導(dǎo)和一些富于創(chuàng)造性的建議，姜老