紅、黃荷包花原生質(zhì)體分離文獻(xiàn)綜述

1、紅、黃荷包花的原生質(zhì)體分離文獻(xiàn)綜述學(xué)院： 生命科學(xué)學(xué)院年級(jí)： 2013級(jí)姓名： Molly愛(ài)楊洋學(xué)號(hào)：楊洋一 前言原生質(zhì)體一詞來(lái)源于原生質(zhì)（protoplasm）。原生質(zhì)指組成細(xì)胞的有生命物質(zhì)的總稱，是物質(zhì)的概念。原生質(zhì)體是組成細(xì)胞的一個(gè)形態(tài)結(jié)構(gòu)單位。后來(lái)發(fā)現(xiàn)了原生質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的認(rèn)識(shí)與Hooke時(shí)期不同了，1880年Hanstein提出“原生質(zhì)體”一詞。由于細(xì)胞一詞的出現(xiàn)較原生質(zhì)體早，故沿用至今。原生質(zhì)體由原生質(zhì)分化形成，具體包括細(xì)胞膜和膜內(nèi)細(xì)胞質(zhì)及其他具有生命活性的細(xì)胞器。原生質(zhì)體是指用特殊方法脫去植物細(xì)胞壁的、裸露的、有生活力的原生質(zhì)團(tuán)。就單個(gè)細(xì)胞而言，除了沒(méi)有細(xì)胞壁外，它具有活細(xì)胞的一切特

2、征。1960年英國(guó)植物生理學(xué)家Cocking首次利用纖維素酶等從番茄根細(xì)胞分離原生質(zhì)體獲得成功。1971年Takebe等培養(yǎng)煙草葉片原生質(zhì)體獲得再生植株，首次證實(shí)了原生質(zhì)體的全能性。二 主題1 材料與方法1.1 材料紅、黃荷包花的種子1.2 方法1.2.1播種及幼苗的培養(yǎng) 精選飽滿的荷包花種子，用01升汞表面消毒10 min，再用無(wú)菌水洗滌4次，將種子接入12 MS培養(yǎng)基中。置于溫度(254-2)。光照度1 000 Ix， 光照1416 hd的條件下培養(yǎng)7 d左右。 1.2.2原生質(zhì)體分離所用的酶液 CPW為水溶液，含KH2PO4 272 mgL、KNO2 101 mgL、CaCl2·

3、;2HzO 1 480 mgL、Mgso4 ·7H2o 240 mgL、CuSO4·5H2o 0025 mgL，溶解不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甘露醇于CPW中成混合液，再將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的纖維素酶和果膠酶溶解在混合液中。調(diào)節(jié)pH值到5.81.2.3 材料處理 用剪子和鑷子分別將紅、黃荷包花的子葉剪成細(xì)條，分別放進(jìn)建立好的酶液當(dāng)中進(jìn)行酶解；1.2.4酶解 設(shè)立2,4,6,8,10h酶解原生質(zhì)體，并用倒置顯微鏡觀察原生質(zhì)體狀態(tài)。1.2.5原生質(zhì)體的收集和純化。將酶解完全的荷包花的子葉的原生質(zhì)體分別放入150目、300目的尼龍膜中進(jìn)行過(guò)濾， 去掉網(wǎng)上未能酶解的材料塊后移入10mL離心管中離心離

4、心速率為l 000 rmin吸取上層液體于培養(yǎng)皿中去掉離心管底層的沉淀物(破碎后的細(xì)胞碎片)；用無(wú)菌紙吸去酶液，再用5 mL原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌，吸干重復(fù)2次，便可得到純凈的原生質(zhì)體溶液。1.2.6原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的測(cè)定 采用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定原生質(zhì)體的產(chǎn)量；采用伊文斯蘭染色法測(cè)定原聲質(zhì)體的活力，原生質(zhì)體活力=（未染色原生質(zhì)體數(shù)/觀察的原生質(zhì)體總數(shù)）*100%1.2.7 原生質(zhì)體分離方法1.2.7.1機(jī)械法 由高等植物中分離原生質(zhì)體的研究最早是Klercker在1892年進(jìn)行的。當(dāng)時(shí)他所用的主要是機(jī)械法把細(xì)胞置于一種高滲的糖溶液中，使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形，然后用利刃切割。在這個(gè)過(guò)程

5、中，有些質(zhì)壁分離的細(xì)胞只被切去了細(xì)胞壁，從而釋放出完整的原生質(zhì)體。在某些貯藏組織中，如洋蔥的鱗片、蘿卜的根、黃瓜的中皮層、甜菜的根組織等，應(yīng)用這個(gè)方法可由它們高度液泡化的細(xì)胞中分離出原生質(zhì)體。然而，這個(gè)方法有明顯的缺點(diǎn)：一是產(chǎn)量很低，二是在由分生細(xì)胞和其他液泡化程度不高的細(xì)胞中分離原生質(zhì)體時(shí)不適用。1.2.7.2 酶解法 1960年，Cocking證實(shí)了用酶解法由高等植物細(xì)胞中大量分離原生質(zhì)體的可能性。他使用了一種由疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)培養(yǎng)物制備的高濃度的纖維素酶溶液以降解細(xì)胞壁。然而，進(jìn)一步的研究只是到了有商品酶供應(yīng)之后才成為可能。自從1968年纖維素酶

6、和離析酶投入市場(chǎng)以后，植物原生質(zhì)體才變成了一個(gè)熱門的研究領(lǐng)域。 首先用商品酶進(jìn)行原生質(zhì)體分離的是Takebe等(1968)。在他們分離煙草葉肉原生質(zhì)體的程序中，上述兩種酶是依次使用的，即先用離析酶處理葉片小塊，使之釋放出單個(gè)細(xì)胞，然后再以纖維素酶消化掉細(xì)胞壁，釋放出原生質(zhì)體。Power和Cocking(1968)證實(shí)，這兩種酶也可一起使用。這種“同時(shí)處理法”或“一步法”比“順序處理法”快，并且由于減少了步驟，從而減少了微生物污染的機(jī)會(huì)。多數(shù)研究者現(xiàn)在都使用這種簡(jiǎn)化的一步法，現(xiàn)在市面上有各種酶制品出售，取決于組織性質(zhì)的不同，它們可以不同配比搭配使用。三 總結(jié)2.1影響原生質(zhì)體分離的因素雖然已有很

7、多植物原生質(zhì)體分離取得成功，但并不是在任何情況下均能得到大量活力好、質(zhì)量高的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體分離受到較多因素的影響，包括植物的類型、基因型、外植體類型及生理狀態(tài)和酶液類型及濃度等。2.2再生植株 在過(guò)去幾十年間，高等植物原生質(zhì)體培養(yǎng)已經(jīng)取得了重大成績(jī)，但就若干重要的農(nóng)作物來(lái)說(shuō)，到目前為止成功還僅限于少數(shù)基因型，并且一般而言再生植株的頻率也不高。因此尚須不斷改進(jìn)培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，力爭(zhēng)克服基因型的局限性并提高植株再生的頻率。此外，目前所用的原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的程序還比較復(fù)雜，重復(fù)性也不高，所知道的一些有關(guān)培養(yǎng)的規(guī)律多數(shù)只是經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)。從這個(gè)角度考慮，今后的工作應(yīng)更注意研究基本規(guī)律，并使培養(yǎng)技術(shù)系

8、統(tǒng)化、程序化、更簡(jiǎn)單實(shí)用。2.3植物原生質(zhì)體是遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體，原生質(zhì)體能夠捕獲外源基因、細(xì)胞器、染色體及DNA片段，常被用于基因轉(zhuǎn)化、新品種培育或品種改良、新物種的創(chuàng)造等領(lǐng)域。原生質(zhì)體融合避開(kāi)了有性雜交過(guò)程中的不親和障礙，在獲得種間、屬間甚至科間雜種方面均發(fā)揮著重要作用。2.4原生質(zhì)體分離技術(shù)的現(xiàn)狀由于商品酶的出現(xiàn)，現(xiàn)在實(shí)際上已有可能由每種植物組織分離出原生質(zhì)體，只要該組織的細(xì)胞還沒(méi)有木質(zhì)化即可。據(jù)報(bào)道，由以下各種組織中都已分離出原生質(zhì)體：葉肉細(xì)胞，根組織，豆科植物的根瘤，莖尖，胚芽鞘，塊莖，花瓣，小孢子母細(xì)胞，果實(shí)組織，糊粉細(xì)胞，下胚軸和培養(yǎng)的細(xì)胞等。2.5展望原生質(zhì)體的分離融合與培育不

9、僅可以轉(zhuǎn)移細(xì)胞核中的染色體組、染色體片段，還可轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)中的葉綠體 DNA及線粒體DNA并在一定程度上克服遠(yuǎn)緣雜 交的不親和性。配合使用常規(guī)育種技術(shù)已在多種 作物育種中培育篩選出具有優(yōu)良特性的種質(zhì)材料 甚至是創(chuàng)造出自然界不存在的新種質(zhì)資源。與基因 工程相比通過(guò)體細(xì)胞雜交途徑進(jìn)行育種具有其獨(dú) 特的優(yōu)勢(shì)主要在于體細(xì)胞雜交可以轉(zhuǎn)移基因工程 無(wú)法實(shí)現(xiàn)的多基因控制性狀且不至于造成生物污 染和對(duì)人體的潛在危害。隨著融合方法、技術(shù)的不斷探索和改進(jìn)近年來(lái)逐漸發(fā)展起來(lái) 的亞原生質(zhì)體融合技術(shù)尤其是微核技術(shù)可在不同屬 植物間定向轉(zhuǎn)移單條或多條染色體實(shí)現(xiàn)部分基因 組轉(zhuǎn)移的技術(shù)且能獲得性狀穩(wěn)定的再生植株。2.6分析與討

10、論（1）最佳酶組合的確定 將葉片用已確定的最佳預(yù)處理時(shí)間處理后入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的纖維素酶(w=00.5、1.0、1.5) 和和果膠酶(w= 0、03、06、o.9)的cPw酶解 液(含w=10甘露醇)中，pH調(diào)至58，振蕩(約 30 rmin，25士1，黑暗)6 h，在顯微鏡下觀察原生 質(zhì)體分離情況，以確定最佳酶組合（2）最佳酶處理時(shí)間的確定將葉片用已確定的最佳預(yù)處理時(shí)間處理后轉(zhuǎn)人 加有最佳酶組合液中振蕩(約30 rmin，25±l，黑暗)，設(shè)4 h、6 h、8 h、10 h、12 h共5個(gè)時(shí)間處 理，pH調(diào)至58，比較不同處理時(shí)間對(duì)葉片原生質(zhì) 體產(chǎn)量、活力的影響，以確定最佳酶解時(shí)間四

11、 參考文獻(xiàn) （1）安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)Journal ofAnhui AgiSci2009。37(8)：34483,449 甘藍(lán)與大白菜的原生質(zhì)體融合梁丹1，丁丹1，王火旭1，2* (1遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧大連116029；2遼寧省植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116029)（2）第31卷第4期 2005年8月湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) Joumal of Hunan Agricultural University(Natural sciences)v013l No4Aug2005刺葡萄原生質(zhì)體分離研究呂長(zhǎng)平a,b，石雪暉a，徐艷a，葉云a (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)a園藝園林學(xué)院；b細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室

12、，湖南長(zhǎng)沙410128)（3） 熱帶作物學(xué)報(bào)2012。33(8)：15161521Chinese Journal of Tropical Crops 植物原生質(zhì)體融合研究進(jìn)展 及其在育種中的應(yīng)用戴雪梅，黃天帶，孫愛(ài)花，周權(quán)男，李 哲，華玉偉中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所 農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 海南儋州571737 國(guó)家橡膠樹育種中心（4）中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 2009,25(14):47-50 ChineseAgricultural Science Bulletin花生原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)黃 玲1,2，趙 凱2，孔 賀2，周紅梅2，王晶珊1 （1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266109

13、； 2濟(jì)寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東濟(jì)寧 272100）（5）第29卷第8期 VO29 NO8 西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)Journal of Southwest University(Natural Science Edition)2007年8月 Aug 2007卡特蘭葉片原生質(zhì)體分離條件的研究陳澤雄， 劉奕清， 丁茂倩重慶文理學(xué)院生命科學(xué)系t慶園林花卉工程研究中心，重慶永川402168（6 ）第51卷第11期 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) V015l No112012年6月 Hubei Agricultural Sciences Jun,2012甘藍(lán)型油菜與菘藍(lán)原生質(zhì)體融合及植株 再生體系的研究杜雪竹1李再云

14、2(1 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430062；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)文驗(yàn)室，武漢430070)（7 ）第49卷第6期 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) V0149 No62010年6月 Hubei Agricultural Sciences Jun，2010紅葉石楠葉片原生質(zhì)體分離條件的研究陳澤雄1，劉奕清1，黃登艷2(1 重慶文理學(xué)院花卉研究所，重慶永川402160；2重慶高校園林花卉工程研究中心，重慶永川402160）（8） 園藝學(xué)報(bào)2006，33（4）：908914Acta Horticulturae Sinica菊科植物原生質(zhì)體融合研究進(jìn)展趙宏波, 陳發(fā)棣, 房偉民 （南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，

15、江蘇南京210095）（9） 2010年第7期植物原生質(zhì)體融合培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用孫慧慧2，王力軍2，閏曉紅2，葉永忠1，魏文輝2(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院河南鄭州450002，2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢430062)（10） Hu Q，Li YC，Mei DS，etalEstablishment and iden-tification of cytoplasmic male sterile in Brassicanapus by intergeneric somatic hybridizationJSeientia Agricultura Sinica，2003，2(12)11

16、3211328（11） Davey M R，Anthony P，Power J B，et a1Plant protoplast technology：Current statusJ-Acta PhysiologiaePlantarum，2005，27(1)：117-129（12）熱帶作物學(xué)報(bào)2012。33(8)：15161521Chinese Journal of Tropical Crops 植物原生質(zhì)體融合研究進(jìn)展及其育種中的應(yīng)用戴雪梅，黃天帶，孫愛(ài)花，周權(quán)男，李 哲，華玉偉（13） Sheng X G，Liu F，Zhu Y LProduction and analysisof intergeneric somatic hybrids between Brassica oleracea and Matthiola incanaJ1Plant Cell Tiss Organ Cult，2008，92(1)：55 62（