蛋白質(zhì)分離純化與質(zhì)譜鑒定（ProteinIdentification）

1、蛋白質(zhì)分離純化與質(zhì)譜鑒定(protein purification and identification )文章導(dǎo)讀單一蛋白質(zhì)樣品的分離、純化？單一蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定？蛋白質(zhì)混合物質(zhì)譜鑒定方法？對(duì)于單一蛋0的常用鑒定方法，大家背定立馬想到免疫印跡法(western blot)。western blot是通過抗體和目標(biāo)分子的特異性結(jié)合從而對(duì)r標(biāo)蛋白進(jìn) 行鑒定，但是這種方法是適用于對(duì)已知蛋白進(jìn)行鑒定，并且必須借助抗體，所 以不適用于對(duì)未知或者沒有相應(yīng)抗體的蛋白進(jìn)行分析。那么小伙伴們可能要問 了，如果自己要研宄的蛋白質(zhì)是未知的或者目前沒有可用抗體怎么辦呢？在這 種情況下，就可以借助質(zhì)譜鑒定技術(shù)來對(duì)蛋白

2、質(zhì)進(jìn)行鑒定了。在這期中小編就 給人家整理了蛋白質(zhì)鑒定的相關(guān)知識(shí)，希望對(duì)于蛋白質(zhì)鑒定一直有困惑的同學(xué) 能有幫助。一、單一蛋白質(zhì)分離純化提到單一蛋0樣品，顧名思義在這類蛋0樣品應(yīng)該已經(jīng)經(jīng)過了一定的蛋0純化 步驟，獲得了相對(duì)單一的蛋白。通常通過細(xì)胞裂解或者體外合成的蛋白質(zhì)都包 含其他的雜蛋白，因此需耍將目的蛋白與雜蛋白區(qū)分開，常用的蛋白分離純化 方法便是電泳分離。一維電泳分離利用蛋白質(zhì)大小不同的特性，能夠很好的將 不同分子量的蛋白進(jìn)行區(qū)分，另外，再次基礎(chǔ)之上二維電泳能夠進(jìn)一步將不同 帶點(diǎn)量的蛋白分子進(jìn)行區(qū)分。1.維電泳0前普遍采用的一維電泳為垂直板聚乙烯酰胺凝膠電泳(sds-page膠)，其原 理是

3、不同濃度的乙烯酰胺在聚合后會(huì)產(chǎn)生具冇一定孔徑大小的凝膠，接著在緩 沖液屮加入sds表面活性劑屮和蛋0質(zhì)表面的電荷，當(dāng)變性的蛋0質(zhì)混合樣品 通過凝膠空隙的時(shí)候，不同分子量大小的蛋白質(zhì)在凝膠中遷移的速度不同因而 被分離開來。一維電泳能夠分離對(duì)大多數(shù)蛋白和蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行初步分離。圖1.蛋白質(zhì)一維電泳分離2.二維電泳二維電泳，也稱為雙向電泳，是在一維電泳的基礎(chǔ)上加入了橫向的等電聚焦分 離，而其縱向的分離與一維sds分離方法完全一樣。二維電泳首先利用蛋白等 電點(diǎn)不同的特性，對(duì)蛋白進(jìn)行初步分離，接著再根據(jù)蛋白質(zhì)分子量不同，再進(jìn) 一步對(duì)等電點(diǎn)相同或相近的蛋白質(zhì)進(jìn)行二維分離，進(jìn)一步提升蛋a質(zhì)分離效率。 二維

4、電泳的蛋白分辨率相比一維電泳已經(jīng)大幅度提升，經(jīng)過二維電泳分離后大 部分蛋白質(zhì)都能夠被分離為含有單一的蛋白質(zhì)蛋白膠點(diǎn)。蛋白一維等電聚焦分離蛋白二搛電泳分«:多數(shù)懂白餃點(diǎn)為h雞一m蛋白廉i圖2.蛋白質(zhì)二維電泳分離二、單一蛋白質(zhì)鑒定目前對(duì)純度較高，或單一蛋白質(zhì)的鑒定的方法有蛋白質(zhì)指紋譜鑒定（pmf）和 ms/ms串聯(lián)質(zhì)譜鑒定法。這兩種方法都是先將蛋白質(zhì)酶切成多肱片段，再利用 質(zhì)譜儀對(duì)肽段分析，達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)鑒定的目的。而兩種方法的不同之處就在于 pmf法只使用一級(jí)質(zhì)譜對(duì)蛋白肽段進(jìn)行檢測(cè)，而ms/ms不僅經(jīng)過一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè), 并且在此基礎(chǔ)上選取特定肽段進(jìn)行肽段破碎，對(duì)肽段的序列進(jìn)行測(cè)定。因此 m

5、s/ms比pmf的鑒定準(zhǔn)確度更高，與數(shù)據(jù)庫比對(duì)的可靠性更高，但分析起來的 也更為復(fù)雜。1.蛋白質(zhì)指紋譜鑒定（pmf）由于蛋白質(zhì)序列的不同，因此不同的蛋白質(zhì)在同一種消化酶的作用下酶切產(chǎn)生 的多肽片段大小質(zhì)量是特異的。蛋白質(zhì)指紋譜鑒定法正是利用了每種蛋白酶切 產(chǎn)生的太片段不同的特性，對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切處理，再對(duì)酶切產(chǎn)生的肽 片段的質(zhì)量進(jìn)行分析，即可獲得蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量譜圖。再將肽譜圖與數(shù)據(jù)庫中 蛋白質(zhì)理論肽譜圖進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而可獲知蛋白質(zhì)的身份信息。2. ms/ms串聯(lián)質(zhì)譜法串聯(lián)質(zhì)譜(ms/ms)檢測(cè)蛋白的原理是先使用一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)肽段的質(zhì)量信息，再 選取峰值高的肽段進(jìn)行破碎，分析獲得二級(jí)質(zhì)譜。用檢

6、索軟件選擇相應(yīng)的數(shù)據(jù) 庫對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，同吋以打分的形式評(píng)判鑒定結(jié)果，當(dāng)打分人于某個(gè)閾 值時(shí)，即判定質(zhì)譜鑒定成功，反之則鑒定失敗。三、蛋白混合物鑒定雖然目前有多種蛋白質(zhì)分離純化的方法，但在很多吋候分離效率不夠高，導(dǎo)致 分離后的蛋白可能還是含有多個(gè)蛋白。另外，對(duì)于豐度較低的蛋白質(zhì)可能在分 離過程中造成進(jìn)一步損失而無法被鑒定到，因此需要直接對(duì)這一類蛋0質(zhì)不經(jīng) 過分離處理直接進(jìn)行分析。目前適用于對(duì)混合蛋白進(jìn)行分析的方法有l(wèi)c-ms/ms 色譜質(zhì)譜串聯(lián)分析法。與pmf法和ms/ms法相比，lc-ms/ms在質(zhì)譜分析前加了 液相色譜的分離，使得蛋白分析精度更高，對(duì)肽段序列測(cè)定幾乎可以的達(dá)到 100%的準(zhǔn)確度。因此，與單個(gè)蛋白質(zhì)