超濾質(zhì)譜技術(shù)篩選板藍(lán)根中抗流感病毒活性成分

1、超濾質(zhì)譜技術(shù)篩選板藍(lán)根中抗流感病毒活性成分摘要目的：篩選板藍(lán)根中抗流感病毒的活性成 分。方法：采用超濾質(zhì)譜技術(shù)，篩選板藍(lán)根中具有抗流感病 毒的活性成分，并以體外神經(jīng)氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié) 果：通過(guò)超濾質(zhì)譜篩選并鑒定出與神經(jīng)氨酸酶結(jié)合的成分主 要是精氨酸、告依春和腺昔，其結(jié)合常數(shù)分別為(36. 23±1. 12) %, (32. 54±1.02) %, (9. 38±0. 47) %； 該結(jié)果與體外酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。精氨酸、告依春的ic50 分別為(1. 16土0. 02), (1. 20±0. 02) g l-1,腺昔的 ic50 大于500 gl

2、-1。結(jié)論：精氨酸和告依春可能是板藍(lán)根抗流 感病毒的活性成分，為板藍(lán)根質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇提供了科 學(xué)依據(jù)；亦為中藥藥效物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)提供了一種適宜技術(shù)。關(guān)鍵詞超濾質(zhì)譜；板藍(lán)根；活性成分；神經(jīng)氨酸酶 抑制活性收稿日期2013-11-17基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81274078, 81322052,81303222)通信作者*鄢丹,tel/fax： (010) 66933325, e-mail： yd277126. com； *肖小河，e-mail： pharmsci126. com板藍(lán)根isatidis radix為臨床常用中藥，主要用于治 療上呼吸道感染等疾病，療效確切，一般認(rèn)為與其抗流感病

3、 毒藥理活性相關(guān)1-4 o由于板藍(lán)根化學(xué)成分復(fù)雜，藥效物 質(zhì)尚不明確，影響了其質(zhì)量評(píng)控水平的提升及臨床療效的穩(wěn) 定發(fā)揮?，F(xiàn)行藥效物質(zhì)篩選模式（植化分離、藥理活性示蹤、 血清藥物化學(xué)篩選等）在推動(dòng)中藥藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的同時(shí)，操 作繁瑣、活性成分易丟失等局限也日益顯現(xiàn)5-7 o因此， 有必要探索高通量、靈敏的中藥藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)新技術(shù)。超濾質(zhì)譜技術(shù)是將超濾裝置與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合后形成的 一種新方法，主要是利用親和原理，將含有潛在活性的小分 子物質(zhì)與受體（靶部位如蛋白或酶等）混合，形成受體-配 體復(fù)合物（采用超濾薄膜除去可能含有的未結(jié)合小分子）， 以有機(jī)溶劑處理并釋放小分子配體，進(jìn)一步采用液相-質(zhì)譜 聯(lián)用技術(shù)對(duì)

4、其進(jìn)行鑒定，從而實(shí)現(xiàn)活性成分的快速初篩8。 目前，該技術(shù)在先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)、配體與受體結(jié)合強(qiáng)度以 及相關(guān)機(jī)制等研究方面有較廣泛的應(yīng)用9-14 o神經(jīng)氨酸酶作為抗流感病毒藥物的主要作用靶點(diǎn)之一， 可協(xié)助成熟流感病毒脫離宿主細(xì)胞感染新的細(xì)胞15。板藍(lán) 根具有神經(jīng)氨酸酶抑制活性16-17,本研究借助超濾質(zhì)譜 技術(shù)篩選板藍(lán)根與神經(jīng)氨酸酶結(jié)合的潛在活性成分，同時(shí)配 以神經(jīng)氨酸酶體外活性評(píng)價(jià)，以期發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根抗流感病毒可 能的藥效成分，將為板藍(lán)根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升以及中藥藥效物 質(zhì)的發(fā)現(xiàn)提供技術(shù)參考。1材料waters 2695高效液相色譜儀（美國(guó)waters公司）；waters xevo g2 qtof質(zhì)譜儀

5、（美國(guó)waters公司）；自動(dòng)酶 標(biāo)儀（美國(guó)bio-tek公司）；超速離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公 司）；板藍(lán)根購(gòu)自安徽，經(jīng)中國(guó)人民解放軍第302醫(yī)院中藥 研究所肖小河研究員鑒定為十字花科植物耘藍(lán)isatis indigotica fort.的干燥根；精氨酸（arginine）,告依春 （goitrin）,腺昔（adenosinea）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品 檢定研究院；2- （n-嗎啡咻）-乙磺酸（mes）購(gòu)自sigma公 司，神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase, na） （human h1n1）購(gòu) 自 sino biological 公司；ym-100 超濾膜購(gòu)自 millipore

6、 公 司；神經(jīng)氨酸酶熒光底物2z 一 （4-methylumbelliferyl） -d-n-acetylneuraminic acid （ munana ）,奧斯 他韋酸（oseitamivir acid） 購(gòu)自 toronto research chemicals lnc.；甘氨酸購(gòu)自北京索萊寶科技公司。甲醇和乙酸均為色 譜純（美國(guó)fisher公司）；水為超純水；其他試劑均為分析 純。2方法2. 1樣品制備2.1.1供試品溶液制備 取板藍(lán)根藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩） 約5 g,精密稱(chēng)定，置圓底燒瓶中，精密加水50 ml,稱(chēng)定 質(zhì)量，加熱回流1 h,放至室溫，加水補(bǔ)足質(zhì)量，濾過(guò)；取 續(xù)濾液25 m

7、l,濃縮至15 ml,放冷，加乙醇20 ml,靜置使 沉淀，離心，過(guò)濾；另取60%乙醇10 ml洗滌沉淀過(guò)濾器， 合并上清液及濾液，濃縮至近干，加水溶解定容于5 ml量 瓶中，過(guò)0.22 um微孔濾膜，樣品用于超濾實(shí)驗(yàn)和體外酶 活性實(shí)驗(yàn)分析。2. 1.2對(duì)照品溶液制備 告依春對(duì)照品用甲醇配成質(zhì)量 濃度為2 g l-1的儲(chǔ)備液；精氨酸對(duì)照品用甲醇配成質(zhì)量 濃度為10 gl-l的儲(chǔ)備液；腺昔對(duì)照品用甲醇配成質(zhì)量濃 度為10 gl-1的儲(chǔ)備液。2. 1.3參照物溶液制備 取奧司他韋酸適量，精密稱(chēng)定, 加水制成每1 ml含50 ng的溶液，按等比級(jí)數(shù)1 ： 0. 5稀釋 成4個(gè)不同濃度的參照物溶液。2

8、. 1.4 緩沖液制備 稱(chēng)取 mes 0. 64 g, cac12 0.044 g 溶于100 ml超純水中，配成濃度為32. 5 mmol lt mes, 4 mmoll-lcac12的緩沖溶液，并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至6. 5。2. 1.5終止液制備 取甘氨酸1.5 g,加25%乙醇溶解， 氫氧化鈉試液調(diào)ph至10.7,即得。2.2色譜與質(zhì)譜條件2. 2. 1 色譜條件 waters acquity uplc beh c18 色譜柱 (2. 1 mmx50 mm, 1. 7 um),柱溫 25 °c ,流速 0.4 ml min-lo流動(dòng)相水(a)-甲醇(b)二元梯度洗脫，具體 梯

9、度為 03 min, 95%50% a； 310 min, 50%30% a；1015 min, 30%0%a； 1518 min, 0%0%a； 1821 min, 95%95%a。2. 2.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（esi）,采用正離子掃描檢測(cè)；脫溶劑氣流量800 lh-l,脫溶劑溫 度350 °c,錐孔氣流量50 lh-l,離子源溫度120 °c,毛 細(xì)管電壓正離子掃描3 200 v,負(fù)離子掃描2 700 v,錐孔 電壓35 v,微通道板電壓3 500 v,碰撞能6 v,碰撞氣氫 氣，碰撞室壓力小于0.28 pa。質(zhì)譜掃描范圍501 200o2.3超濾實(shí)驗(yàn)分別吸取一定

10、量板藍(lán)根提取物溶液和神經(jīng)氨酸酶溶液 加至ph 6. 5的緩沖溶液中，隨后置37 °c水浴中反應(yīng)30 min 后，吸取一定量轉(zhuǎn)移至截留相對(duì)分子質(zhì)量為100的ym-100型 超濾管中，8 500 r min-1離心5 min,濾膜加緩沖溶液（ph 6. 5）離心清洗3次，洗去未結(jié)合成分。再向?yàn)V膜中加入適 量的50%甲醇，8 500 r min-1離心7 min釋放結(jié)合配體， 重復(fù)3次，收集洗脫液，冷凍干燥后加50%甲醇500 ul溶 解，用于lc-ms分析。為了排除由于超濾膜對(duì)小分子的吸附 作用而產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果，每次實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，即 同法處理不加na的藥材溶液17 o2.4神經(jīng)

11、氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)采用課題組已建立的神經(jīng)氨酸酶（na）活性檢測(cè)法16, 18表征藥物抗流感病毒的作用強(qiáng)度。反應(yīng)在96孔板熒光酶 標(biāo)板中進(jìn)行，首先加入稀釋的神經(jīng)氨酸酶25 ul和供試品 溶液25 u l,室溫下作用30 min后加底物munana 50 ul 37 °c孵育60 min后加入終止液mes （0. 1 mollt甘氨酸, 以25%乙醇配制，10%氫氧化鈉溶液調(diào)ph 10. 7） 200 ul終 止反應(yīng)。測(cè)定熒光強(qiáng)度值，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)355 nm,發(fā)射波長(zhǎng) 460 nm,檢測(cè)溫度37 °co為便于活性比較，同時(shí)設(shè)樣品測(cè) 試組（na +樣品+ munana）,背景對(duì)照組（

12、樣品+ munana, 緩沖液補(bǔ)足至相同體積），空白熒光組（munana,用緩沖液 和樣品溶劑補(bǔ)充至相同體積），酶活性對(duì)照組（na + munana, 反應(yīng)終止后再加入同體積樣品溶液），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。3結(jié)果3. 1超濾質(zhì)譜篩選抑制神經(jīng)氨酸酶活性成分采用超濾質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)比較對(duì)照組（超濾不加酶）、 對(duì)照品組、藥材原液組（不超濾不加酶）和實(shí)驗(yàn)組（超濾加 酶）中成分的差異，并結(jié)合基峰總離子流色譜圖（圖1）和 提取離子流色譜圖（圖2）篩選與神經(jīng)氨酸酶有相互作用的 成分，結(jié)果共篩選鑒定出3個(gè)可與na結(jié)合的化合物，分別 為精氨酸、告依春和腺昔。在本實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)組（超濾 加酶）色譜圖主要集中在4 mi

13、n內(nèi)。由圖2可知，板藍(lán)根藥材提取離子流圖中精氨酸、告依 春、腺昔的保留時(shí)間分別為0. 344, 0. 455, 0. 491 min。 q-tof-ms給出的準(zhǔn)分子離子峰分別為精氨酸m/z 175. 119 0, 告依春m/z 130. 033 2,腺昔m/z 268. 104 6,分別與對(duì)照 品精氨酸、告依春、腺昔比對(duì)，具有相同的保留時(shí)間、準(zhǔn)分 子離子峰，由此可以確認(rèn)上述3種化合物分別為精氨酸、告 依春、腺a.對(duì)照組(未加酶組)；b.對(duì)照品組；c.板藍(lán)根藥液 組；d.實(shí)驗(yàn)組(加酶組)。圖1不同組別樣品總離子流圖fig. 1 the totai ion chromatogram of diff

14、erent groups昔。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中化合物亦按照上述方法進(jìn)行確 認(rèn)。由于色譜峰的積分面積與其相應(yīng)的濃度成正比，故可以 通過(guò)超濾前后色譜峰積分面積的變化程度來(lái)反映相應(yīng)化合 物與生物靶分子的結(jié)合程度。按如下公式進(jìn)行計(jì)算20：結(jié) 合率二(ae-ac) /ax 100%,其中a為藥物原液色譜峰的積分 面積，ae為實(shí)驗(yàn)組色譜峰的積分面積，ac為對(duì)照組色譜峰 的積分面積。利用這種計(jì)算方法對(duì)板藍(lán)根藥材中各組分與靶分子的 相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)算，3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示精氨酸、 告依春、腺昔的結(jié)合常數(shù)分別為(36.23±1.12) %, (32. 54±1. 02)%, (9. 38

15、±0.47)%(精氨酸告依春腺昔)。 比較結(jié)合常數(shù)可以看出，精氨酸和告依春與神經(jīng)氨酸酶的結(jié) 合強(qiáng)度較大，提示精氨酸和告依春可能是板藍(lán)根抑制神經(jīng)氨 酸酶的活性成分。a.對(duì)照組（未加酶）；b.板藍(lán)根藥液組；c.實(shí)驗(yàn)組 （加酶組）；1精氨酸；2告依春；3.腺昔。圖2不同成分提取離子色譜圖fig. 2 the extracted ion chromatogram of different compound3.2體外神經(jīng)氨酸酶抑制活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用體外神經(jīng)氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證超濾質(zhì)譜初 篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果（以na為陽(yáng)性藥），結(jié)果表明，精氨酸、告依春 和腺昔超濾質(zhì)譜的結(jié)合常數(shù)與體外神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)結(jié)

16、 果吻合度良好，提示超濾質(zhì)譜技術(shù)在初篩中藥活性成分具有 高通量、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)（圖3）。4討論與結(jié)論本研究借助超濾質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)比對(duì)不同組別板藍(lán)根樣 品超濾前后成分的變化情況，篩選并鑒定出精氨酸、告依春 與神經(jīng)氨酸酶結(jié)合能力顯著；進(jìn)一步以體外神經(jīng)氨酸酶活性 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)精氨酸和告依春可能是板藍(lán)根抗流感病毒的 活性成分，為板藍(lán)根質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇提供了科學(xué)依據(jù)， 有助于*腺昔ic50大于500 gl-lo圖3初篩成分超濾質(zhì)譜結(jié)合常數(shù)與體外活性ic50對(duì)比 圖（n=3）fig.3 comparison of binding degree and ic50of the screening com

17、pounds against neuraminidase ( n=3 ) 其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升。與藥效成分常規(guī)篩選方法相比，超濾質(zhì)譜技術(shù)是基于對(duì) 藥物小分子與其活性發(fā)揮關(guān)鍵靶點(diǎn)(蛋白、酶等)相互作用 的共識(shí)而建立的中藥活性成分初篩技術(shù)，具有高通量、靈敏、 快速等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，適合用于活性成分的早期篩選、活性強(qiáng)度 評(píng)測(cè)以及相關(guān)機(jī)制初步探索研究。同時(shí)，結(jié)合中藥多成分、 多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)，深入開(kāi)展不同關(guān)鍵靶點(diǎn)和體內(nèi)試驗(yàn)以確認(rèn) 初篩的活性成分將是十分重要而有意義的研究工作。參考文獻(xiàn)1 zhou w, zhang x y. research progress of chineseherbal medicine r

18、adix isatidis (baniangen) j. am j chin med, 2013,41(4)：743.2 楊海霞，李曉眠.板藍(lán)根提取液體內(nèi)抗流感病毒 作用的研究j.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007, 13 (1)： 19.3 左麗，李建北，徐景，等.板藍(lán)根的化學(xué)成分研究j.中國(guó)中藥雜志，2007,32 (8)：688.4 lin c w, tsai f j, tsai c h, et al. anti-sarscoronavirus 3c-like protease effects of isatis indigotica root and plant-derived phenoli

19、c compounds j, antivir res, 2005,68(1)：36.5 肖小河，肖培根，王永炎.中藥科學(xué)研究的幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題j中國(guó)中藥雜志，2009,34 (2)：119.6 劉榮霞，葉敏，果德安.中藥質(zhì)量控制研究的思路與方法j.中國(guó)天然藥物，2006,4 (5)：332.7 王智民.中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)研究是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵j.中國(guó)中藥雜志，2011, 28 (12)：1111.8 周慧，宋鳳瑞，劉志強(qiáng)，等.超濾質(zhì)譜技術(shù)在藥物小分子與生物靶分子相互作用研究中的應(yīng)用j化學(xué) 進(jìn)展，2010,22(9)：2207.9 zhang h, gu q, liang x, et al. s

20、creening fortopoisomerase i binding compounds by high-performance liquid chromatography-mass spectrometryj. anal biochem, 2004,329(2)：173.10 hannewald p , maunit b , muller j f. tubulin-binding drug screening by maldi-tofmsj. anal chem, 2006,78(3)：4390.11 韓雪瑩，王巍，譚日秋，等.超濾法測(cè)定牛勞昔及牛旁昔元的血漿蛋白結(jié)合率j.中國(guó)中藥雜志，

21、2013, 38 (3)：432.12 machicado c, l 6 pezllano j, cuestal6pez s, et al. design of ligand binding to an engineered protein cavity using virtual screening and thermalup-shift evaluationj j comput aid mol des, 2005,19 (6)：421.13 王兆伏，宋鳳瑞，劉志強(qiáng)，等.質(zhì)譜技術(shù)在中藥小分子與生物大分子相互作用研究中的應(yīng)用j質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2010,31 (3)：129.14 董潔，郭立瑋，李玲娟

22、，等.截留相對(duì)分子質(zhì) 量1 000的超濾膜對(duì)生物堿和環(huán)烯瞇菇類(lèi)物質(zhì)的透過(guò)率及其 定量構(gòu)效關(guān)系研究j中國(guó)中藥雜志，2011,36(2)： 127.15 smith b j, colman p m, von itzstein m, etal. analysis of inhibitor binding in influenza virus neuraminidase j. protein sci,2001,10 (4)：689.16 李寒冰，鄢丹，王伽伯，等.基于神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)的板藍(lán)根品質(zhì)的生物評(píng)價(jià)j藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009,44 (2)：162.17 曹鴻鵬，陶佩珍，杜冠華.流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制

23、劑篩選模型的建立和應(yīng)用j藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002, 3718 li h b, yan d,of bioassay method for(12)：930.jin c, et al. establishmentantivirus potency of radixisatidis based onchemicalfluorometriedetermination j spectrosc spect anal, 2009, 29 (4)：screening bioactive compounds inhibitinginfluenza virus from isatidisradix by ultrafil

24、tration mass spectrometryma li-na zhang cong-en,yan dan, tan man-rong,li han-bing,zhang le-le,xiong yin, xiao xiao-he(1.college of pharmacy ,chengdu university oftraditional chinese medicine, chengdu 610075, china；2. china military institute of chinese ma/teriamedica, 302 military hospital, beijing

25、100039, china；3.college of pharmacy, he' nan university oftraditional chinese medicine , zhengzhou 450008 ,china)abstract in vitro neuraminidase inhibitionassays and ultrafiltration liquid chromatography with diodearray detector coupled to time of flight mass spectrometer (uplc-dad-tof-ms ) were combined to screen bioactive compounds inhibiting neurami