蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法比較

1、蛋白質(zhì)含量測(cè)定主要有五種方法，分別是凱式定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、 酚試劑法和考馬斯亮藍(lán)法。這五種方法各有特點(diǎn)，優(yōu)缺點(diǎn)明確。凱氏定氮法蛋白質(zhì)是含氮的化合物。 食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化， 使蛋白質(zhì)分 解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，留在消化液中，然后加堿蒸餾使氨游離， 用硼酸吸收后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定， 根據(jù)酸的消耗量來(lái)乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)， 即得蛋白質(zhì)含量。 因?yàn)槭称分谐鞍踪|(zhì)外， 還含有其它含氮物質(zhì)， 所以此蛋白質(zhì) 稱為粗蛋白。優(yōu)點(diǎn)：重現(xiàn)性好，是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法 ,是一種蛋白質(zhì) 測(cè)定的經(jīng)典方法 , ,測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確。缺點(diǎn)：操作比較繁復(fù)，費(fèi)時(shí) ,試劑消耗量大。且此

2、法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量實(shí)際 上包括了核酸，生物堿，含氮類脂，卟啉，含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物。 雙縮脲定氮法雙縮脲(NH3CONHCONH 3)是兩個(gè)分子脲經(jīng)180 C左右加熱，放出一個(gè) 分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與 CuSO4 形成紫色絡(luò)合物，稱 為雙縮脲反應(yīng)。 凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵， 或能過一個(gè)中間碳原 子相連的肽鍵， 這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。 紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃 度成正比， 而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)， 故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 測(cè) 定范圍為 110mg 蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、 Tris 緩沖液 和某些氨基酸等。優(yōu)點(diǎn)：

3、較快速 ，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主 要的缺點(diǎn)是靈敏度差。 因此雙縮脲法常用于需要快速， 但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。缺點(diǎn)：不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似。紫外吸收定氮法雙縮脲法是傳統(tǒng)的分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的方法 ,當(dāng)含有兩個(gè)或者兩個(gè)以上 肽鍵的物質(zhì)和堿性的硫酸銅反應(yīng)時(shí) ,形成紫色的絡(luò)合物 ,這個(gè)顏色產(chǎn)物是肽鍵中的 氮原子和銅離子配價(jià)結(jié)合的結(jié)果。 蛋白質(zhì)分子中， 酪氨酸、 苯丙氨酸和色氨酸殘 基的苯環(huán)含有共軛雙鍵， 使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。 形成顏色產(chǎn)物的量取 決于蛋白質(zhì)的濃度。實(shí)際測(cè)定時(shí) ,必須預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液制作一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)校正 曲線,通常用牛血清白蛋白水溶

4、液做蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶 液加入雙縮脲試劑后 ,反應(yīng)生成的顏色產(chǎn)物用紫外 - 可見分光光度計(jì)在 540nm 波 長(zhǎng)下測(cè)定吸光度 ,以雙縮脲試劑加緩沖或水作空白對(duì)照。然后將測(cè)得的值分別對(duì) 蛋白濃度 (mg/ ml) 作圖,得標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白樣品用雙縮脲試劑做同樣處理 , 根據(jù)測(cè)得吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接查得未知蛋白質(zhì)樣品中得蛋白質(zhì)濃度。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)各種蛋白質(zhì)呈色基本相同 ;特異性和準(zhǔn)確度好 ,精密度好 ;呈色穩(wěn)定性 好,試劑單一 ,方法簡(jiǎn)便?？焖伲幌臉悠?，測(cè)定后仍能回收使用。缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那 些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量

5、差異大的蛋白質(zhì)， 有一定的誤差。 故該法 適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。 若樣品中含有嘌呤、 嘧啶及 核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表， 再進(jìn)行計(jì)算的方法， 加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收 是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)， 由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因 pH 的改變而有變化， 因此要注意溶液 的 pH 值，測(cè)定樣品時(shí)的 pH 要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的 pH 相一致。酚試劑法此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即 Folin 酚試劑，以增加顯色量， 從而提高了

6、檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。 這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn) 生深藍(lán)色的原因是： 在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin 酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基 還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬蘭和鎢蘭的混合物） 。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白 的量成正比。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高 ,比雙縮脲法靈敏約 100 倍。操作簡(jiǎn)單，不需要特殊儀器設(shè) 備。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式， 且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾 Lowry 反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、 Tris 緩沖 液、甘氨酸、糖類、甘油等均有

7、干擾作用。 濃度較低的尿素（0.5% ），硫酸納（ 1% ）， 硝酸納（ 1%），三氯乙酸（ 0.5% ），乙醇（ 5% ），乙醚（ 5% ），丙酮（ 0.5% ）等 溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液， 只須加濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液， 即可顯色測(cè)定。 若樣品酸度較高， 顯色后會(huì)色 淺，則必須提高碳酸鈉氫氧化鈉溶液的濃度 12 倍。進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加 F olin 酚試劑時(shí)要特別小心， 因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性 pH 條件下穩(wěn)定， 但上述還原反應(yīng) 只在 pH=10 的情況下發(fā)生，故當(dāng) Folin 一酚試劑加到堿性的銅蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸一磷鎢酸試劑被

8、破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生?？捡R斯亮藍(lán)法考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收 峰的位置（max ），由465nm變?yōu)?95nm ，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。 經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 （特別是精氨酸）和芳香族氨 基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá) rlg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物 有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣

9、品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要 2分鐘即可完成，其顏色可以在1小 時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用 像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、 Na +、Mg 2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾 此測(cè)定法。缺點(diǎn)：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定， 主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣。）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，4因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。應(yīng)用范圍凱氏定氮法適用樣品廣泛是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第一法 。適合于各種食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定以及各 類動(dòng)植物蛋白測(cè)定。適用于0.2