青光眼基因治療研究進(jìn)展

1、青光眼基因治療研究進(jìn)展【摘要】最近研究表明，青光眼患者眼壓升高及視網(wǎng) 膜節(jié)細(xì)胞損傷和死亡可能與某些相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及功能異 常有關(guān)，因此，基因治療作為一種新的治療方法已逐漸在醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用，為青光眼的防治提供了廣闊的前景。本文對 目前進(jìn)行的基因治療研究進(jìn)行綜述?！娟P(guān)鍵詞】 青光眼基因治療advance singenethera pyforglaucom aabstractpr eviousstudie sinmolecular genetieshaveindicatedinglaucomaelevatedintraocul arpressureanddamageofdeathofretinal

2、ganglioncells mayberelatedtotheabnormalityofrelatedgene. sogene therapyhasbeengraduallyappliedinmedicaldomainasakindofnewtreatmentmethod,itprovidesextensivepros pectforthepreventionandcureofglaucom a. thispaperr eviewsadvancesingenether apyforglauco ma. keyword s： glaucoma； g enetherapy0引言青光眼是一組以進(jìn)行性

3、視神經(jīng)損害和神經(jīng)元喪失為特 征的眼部疾患。青光眼作為全世界第二位的致盲眼病，其有 效防治越來越成為防盲治盲和公共衛(wèi)生工作的重點。眼壓升 高和缺血是引起青光眼性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinalgan glioncells, r gcs)喪失的兩個刺激因素，高眼壓將直接損 害視神經(jīng)軸突，并導(dǎo)致rgc不可逆性喪失。由于rgc死亡的 確切分子機制還不是很清楚，目前還沒有有效的治療來預(yù)防 嚴(yán)重青光眼患者的視功能喪失1。目前青光眼的治療仍以 降低眼壓為主，但常用的藥物存在較嚴(yán)重的并發(fā)癥。而手術(shù) 治療如濾過性手術(shù)，效果不是很理想，一方面很多患者術(shù)后 因發(fā)生濾過泡疤痕化而影響眼壓控制，另一方面一些患者即 使眼

4、壓已經(jīng)控制達(dá)正常范圍，他們的視功能損害仍繼續(xù)進(jìn)展, 且無有效的治療方法?；蛑委熓怯没蚬こ碳夹g(shù)，對基因進(jìn)行改建、修飾和 置換，或?qū)Ξ惓；虮磉_(dá)進(jìn)行干預(yù)以治療疾病的方法。其含 義是從導(dǎo)入基因糾正遺傳病的基因缺陷，擴大到導(dǎo)入外源基 因達(dá)到治療效果的所有治療方法。轉(zhuǎn)基因技術(shù)適合治療青光 眼，在于青光眼的慢性過程和比較明確的病理學(xué)基礎(chǔ)2。 解剖學(xué)、遺傳學(xué)和基因表達(dá)圖譜已經(jīng)證明轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療青 光眼，包括改善房水引流、減少濾過泡疤痕形成和保護(hù)rgc 已成為可能。本文對青光眼基因治療研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。1轉(zhuǎn)基因治療青光眼的靶組織青光眼基因療法特有的靶組織結(jié)構(gòu)或細(xì)胞類型包括小 梁網(wǎng)(tr abecularm

5、esh work,tm),睫狀上皮(ciliaryepi thelium,ce)、睫狀肌(ciliarym uscle,cm)、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞(retin alganglionce ils, rgcs)和 m li iler 細(xì)胞(mcs) o 小梁網(wǎng)位于前房角，是一種由不同內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)以特 定結(jié)構(gòu)形成的海綿狀組織；它負(fù)責(zé)維持房水流出的阻力和保 持眼球的形狀。睫狀上皮包括兩種緊密連接的覆蓋在睫狀突 的細(xì)胞層，外層細(xì)胞面向后房，是非色素性上皮，主要分泌 房水。房水產(chǎn)生后，進(jìn)入前房，通過小梁細(xì)胞和內(nèi)層schle mm管壁離開眼球而進(jìn)入靜脈系統(tǒng)。睫狀肌緊鄰睫狀上皮和小 梁網(wǎng)。一旦睫狀肌收縮

6、，晶狀體調(diào)節(jié)力增加，小梁網(wǎng)的構(gòu)型 發(fā)生變化，房水流出易度增加orgcs,視網(wǎng)膜的最內(nèi)層細(xì)胞， 通過其軸突將光信號傳導(dǎo)至大腦，其軸突組成了視神經(jīng)。許 多刺激傷害，通常是眼壓升高引起rgcs損害和凋亡，最后 導(dǎo)致視神經(jīng)纖維喪失3。2青光眼基因治療的有關(guān)載體能將遺傳物質(zhì)傳送入視網(wǎng)膜或rgc的載體系統(tǒng)至少應(yīng)具 備以下四種生物學(xué)特性：（1）能對準(zhǔn)目標(biāo)的特有細(xì)胞類型， 其目標(biāo)或者是受染細(xì)胞，或者是鄰近細(xì)胞，例如，引入分泌 性治療藥物的基因。（2）基因傳導(dǎo)應(yīng)該有效，即現(xiàn)有的載體 滴度和有限的劑量可以很安全地注射入各種視網(wǎng)膜間隙，傳 代基因能有效地復(fù)制，并進(jìn)入足夠多的靶細(xì)胞，允許治療藥 物在視網(wǎng)膜特定部位進(jìn)行

7、表達(dá)。（3）載體相關(guān)表達(dá)應(yīng)該恒定 并適當(dāng)?shù)爻掷m(xù)較長時間。（4）載體本身毒性應(yīng)該很低，這包 括藥理學(xué)毒性、針對傳導(dǎo)基因產(chǎn)物、輸入載體或者源于輸入 載體的任何表達(dá)基因的局部和全身免疫反應(yīng)。目前用于青光眼轉(zhuǎn)基因治療，并滿足這些生物學(xué)特性的 載體可分為病毒和非病毒兩種方法：病毒方法病毒方法是利用載有目的基因的復(fù)制缺陷病 毒感染靶細(xì)胞。相關(guān)的dna病毒載體腺病毒(adenov irus, ad)載體: 最初的腺病毒載體能夠搭載大約8kb的傳代dna0幾種早期 的病毒基因的附加失活作用產(chǎn)生的復(fù)制缺陷病毒載體能夠 在傳導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞中生長并形成很高的滴度?；虮磉_(dá)通 常在接種后24h內(nèi)出現(xiàn)，這使得在動物模型

8、中進(jìn)行研究變得 非常方便。重組的腺病毒由于宿主對輸入的病毒顆粒本身和 因為感染而產(chǎn)生的大量病毒蛋白質(zhì)的反應(yīng)，故具有相對的免 疫原性。然而，眼部的相對免疫特性使得暫時性的腺病毒相 關(guān)的基因治療仍然有效。由于重組的腺病毒dna并不能穩(wěn)定 地整合入宿主染色體的dna中，所以其在眼組織中傳達(dá)的基 因表達(dá)是暫時性的，一般保存13mo。如果其引起的免疫反 應(yīng)能進(jìn)一步減輕的話，特殊的短期基因治療干預(yù)，將是有利 時機。腺相關(guān)病毒(adeno-as sociatedviru s, aav)載 體：通常這種病毒感染人類，并不引起已知的疾病。它是一 種小的單鏈dna病毒，它本身只產(chǎn)生非常小的蛋白質(zhì)，因此 具有相對的

9、非免疫原性。如果沒有與野生型輔助病毒(通常 是人類腺病毒)一同感染，野生型aav能穩(wěn)定地整合入人類 19號染色體的特定位點，并建立隱匿性感染。相反，由于在 重組的a av(raav)中刪除了這種特殊整合位點所必需的病毒 rep蛋白質(zhì)，目前的aav載體并不具備這種特性。然而，體 內(nèi)實驗顯示，raav能在長達(dá)數(shù)周或數(shù)月內(nèi)緩慢地整合入隨機 的染色體位點，這取決于靶細(xì)胞，也使得長期性的、或者是 永久性的傳導(dǎo)成為可能。與重組的腺病毒不一樣，ra av似 乎能傳導(dǎo)正常的rgc和光感受器細(xì)胞與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。 但是，當(dāng)前的raav具有兩大缺陷：它限定了搭載的dna 不能超過。盡管aav適合于目前的可用于

10、視神經(jīng)保護(hù)治療的 絕大部分基因，但是，只有有限的空間用于調(diào)節(jié)成分，這是 為精確地協(xié)調(diào)和控制基因表達(dá)所必需的，才能起作用。如 果raav整合確實是隨機的話，理論上就存在插入的基因突 變。這使得臨床前期研究比其他載體更加費時，而且不可能 很快用于視網(wǎng)膜變性疾病的動物模型中。目前一種新的，更 加有效的raav包裝技術(shù)能很好地避免低病毒滴度和野生型 腺病毒輔助劑的低水平污染引起的一些早期問題5。單 皰病毒(h erpessimplev irus,hsv)載體：hsv能有效地將有 益基因轉(zhuǎn)入青光眼相關(guān)的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞。在猴和嚙齒類，通過 前房注射，在tm和ce轉(zhuǎn)染效率很高，而其他細(xì)胞如虹膜色 素上皮細(xì)胞和角

11、膜內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低。只有在cmv啟動 子和hsv載體一起進(jìn)行實驗時，基因表達(dá)最多持續(xù)10d6,7o hsv在rgcs亦能產(chǎn)生有效的轉(zhuǎn)染，但在靈長類，其傳導(dǎo)位置 只局限于傳送部位3。逆轉(zhuǎn)錄病毒(rv)載體其優(yōu)點是目的基因可以整合到染 色體上，可以實現(xiàn)穩(wěn)定長期表達(dá)，而且轉(zhuǎn)移效率高。但目前應(yīng) 用于基因療法的大部分rna病毒載體都是源于鼠類白血病逆 轉(zhuǎn)錄病毒。它不能轉(zhuǎn)染非增殖期的細(xì)胞，所以不適用于角膜 內(nèi)皮及視網(wǎng)膜等組織的基因轉(zhuǎn)染。相反，基于人類免疫缺陷 病毒(hum animmuno-deficiencyvirus es,hiv)和猴免疫缺陷 病毒(simianim munodeficien c

12、yviruses, siv)的慢病毒載 體(len tiviralvecto rs),編碼諸如vpr之類的蛋白質(zhì),允 許細(xì)胞核輸入病毒基因組，而不影響相伴隨的有絲分裂。慢 病毒載體(lentiviral vectors):這種載體通常是假表型的, 即為包被另外一種病毒蛋白質(zhì)作準(zhǔn)備。能夠以這種方式搭載 慢病毒，并具有這種特性的細(xì)胞通常是cd4+t細(xì)胞，允許慢 病毒感染多種細(xì)胞。慢病毒含有泡狀口腔炎病毒 (vesicularst omatitisviru s, vsv-g)的糖蛋白，已經(jīng)成功 地用于鼠類視網(wǎng)膜。在一次接種后能感染整個視網(wǎng)膜，并能 至少穩(wěn)定3 moo它需要將染色體整合，才能獲得基因表

13、達(dá), 這提示病毒載體能在rgc進(jìn)行長時期傳導(dǎo)。但是這種載體具 有以下幾種技術(shù)缺陷：任何基于人類的免疫缺陷病毒的載 體系統(tǒng)在可以用于人類之前，都必須證明不會產(chǎn)生野生型人 類免疫缺陷病毒。許多新近的基于病毒載體已經(jīng)刪除了原來 的人類免疫缺陷病毒基因組的重要節(jié)段，因此，進(jìn)一步減少 了產(chǎn)生感染性病毒的危險性。按照目前的滴度，需要30 100 ul重組病毒才能達(dá)到整個人類視網(wǎng)膜。最近，病毒顆粒 的穩(wěn)定性和濃縮技術(shù)已得到明顯改善，因此，容量問題將會 被解決。需要關(guān)心的是基于人類免疫缺陷病毒載體的整合 問題。整合位點似乎是隨機的，因此，可能存在整合所導(dǎo)致 的基因突變。很可能需要更精細(xì)和更大的啟動子以平衡轉(zhuǎn)基

14、 因和內(nèi)源性基因的長期表達(dá)。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)已被認(rèn)為是基因表 達(dá)的重要調(diào)節(jié)子，并強化了近端啟動子不僅僅只是一個重要 想法的思想。病毒載體整合入基因組的位點往往影響治療性 基因的表達(dá)，所以，下一代的啟動子應(yīng)該含有開放性染色質(zhì) 的調(diào)節(jié)子，諸如位點控制元素，它可以在一些情況下以暫時 性的方式上調(diào)或下調(diào)治療性基因產(chǎn)物水平。繼續(xù)研究視網(wǎng)膜 細(xì)胞特殊的啟動子，已被認(rèn)為是基因療法的必要進(jìn)展8。 lotery等9 通過玻璃體切割和視網(wǎng)膜下注射將重組的貓免 疫缺 陷病毒(recombina ntfelineimmu no-deficienc yv讓us, rfiv)載體將b半乳糖酶基因轉(zhuǎn)染入cynomolgus猴 視

15、網(wǎng)膜。結(jié)果表明光感受器和m tiller細(xì)胞有極好的轉(zhuǎn)基因 表達(dá)。局部炎癥反應(yīng)只局限在注射部位。電生理檢查表明, 視功能不因載體注射而受到明顯影響。這提示視網(wǎng)膜下應(yīng)用 rfiv載體能轉(zhuǎn)導(dǎo)非靈長類視網(wǎng)膜各種類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞，r fiv載體具有潛在的治療作用，并可用于人眼的基因療法。loewen等1 0采用視網(wǎng)膜下注射2 n l的貓免疫缺陷病毒 (fe lineimmuno-d eficiencyvir us, fiv)或腺病毒載體，比 較兩種載體行視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)基因的長期表達(dá)情況，在劑量-反應(yīng) 研究中，2x 1 05傳導(dǎo)單位(transducingunits,tu)中，兩種 載體在視網(wǎng)膜的傳導(dǎo)范圍一致

16、；但在長期表達(dá)研究中，在不 同的時間點(lwk； 1, 3, 6 , 12和16mo)fiv載體的表達(dá)程 度(grad e)均比腺病毒載體高。但大部分腺病毒注射眼均出 現(xiàn)了局部巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的聚集和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的破壞。結(jié)果 表明，慢病毒載體經(jīng)隨訪16mo仍能持久表達(dá)，可用于慢性視 網(wǎng)膜疾病的基因治療。非病毒方法包括脂質(zhì)體介導(dǎo)法和受體介導(dǎo)法等。與病毒 方法相比，沒有致癌性，也排除了病毒感染，缺點是整合率低。 近年來，人們對脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移方法有了較多的研究，轉(zhuǎn) 導(dǎo)效率有很大提高，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofecti n及其新一 代產(chǎn)品lipo fectimineo ha ngai等11, 12用其特

17、殊的脂 質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)對視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層取得了較好的轉(zhuǎn)染效果， 但基因表達(dá)時間較用av載體明顯短，注射后30d時基因表達(dá) 已經(jīng)十分微弱或消失。由于脂質(zhì)體介導(dǎo)法還具有安全、方便 的優(yōu)點，所以是一種很有前途的目的基因運載體系。hart等 13用受體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜組織也取得了較好效果。3青光眼的基因治療效果盡管大多數(shù)青光眼的遺傳基因尚不清楚，但編碼眼壓降 低和/或視神經(jīng)保護(hù)基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)可改變相關(guān)細(xì)胞的生 理狀態(tài)和阻止發(fā)病。與其他慢性疾病一樣，應(yīng)用基因治療青 光眼將提供長期有效的治療效果。改善房水循環(huán)目前可用于處理眼前節(jié)組織降低眼壓的 藥物必須每天用藥，那么順從性是個主要問題?；虔煼?以減輕這

18、個問題。減少房水的生成房水的生成主要靠睫狀突非色素上皮 逆濃度梯度，將na+泵入后房。睫狀突非色素上皮細(xì)胞緊密連 接，形成血一房水屏障，在na+/k+atp酶的作用下,na+由細(xì)胞 主動分泌入后房，這是一個耗能過程，且與hc 03-和c1-協(xié)同 轉(zhuǎn)運。而通過a2, b2腎上腺素能受體可調(diào)節(jié)腺昔酸環(huán)化酶 的活性，繼而影響na+/k+atp酶的活性14 o目前許多藥物 都有抑制與房水生成相關(guān)的酶或離子泵的作用，如na+/k+ atp酶對烏巴因（ouabain）敏感，可被其抑制而減少房水的生 成；目前應(yīng)用較多的b2受體阻滯劑，其作用機制就是抑制睫 狀體上皮的離子泵或酶的活性，引起第二信使的改變從而抑

19、 制房水的生成。以上研究結(jié)果提示，可以通過影響與房水生 成相關(guān)的幾個步驟減少房水的生成。根據(jù)房水的生成原理， 目前至少可由以下幾個途徑通過基因敲除的方法減少房水 的生成：基因敲除與房水生成相關(guān)的酶或相關(guān)的離子通道; 基因敲除腺昔酸環(huán)化酶減少房水的生成；基因敲除g蛋 白，減少房水的生成。疏通房水流出通道增加房水的排出將外源基因?qū)胄×壕W(wǎng)以治療青光眼，borras等15將外源基因?qū)胄×壕W(wǎng)細(xì) 胞中，基因可表達(dá)7d。budenz等1 6將含有l(wèi)acz基因的腺 病毒載體注入前房和玻璃體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小梁網(wǎng)細(xì)胞可表達(dá) 持續(xù)14do使用灌注眼培養(yǎng)系統(tǒng),borra s等17將管蛋白(t ubulin)基因?qū)?/p>

20、小梁網(wǎng)細(xì)胞中，可降低眼壓。視神經(jīng)及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)性治療18青光眼 性rgcs凋亡的激發(fā)因素主要有神經(jīng)營養(yǎng)因子的剝奪和興奮 性毒素一氧化氮的毒性作用。高眼壓或低血流灌注壓導(dǎo)致缺 血缺氧等，使rgc軸漿流中斷，靶源性神經(jīng)營養(yǎng)因子供應(yīng)中 斷，同時興奮性毒素大量產(chǎn)生，激活誘導(dǎo)凋亡的基因作用于 細(xì)胞表面受體，啟動rgc凋亡程序。已有研究表明重復(fù)眼內(nèi) 注射神經(jīng)營養(yǎng)因子能暫時性拯救因軸突損傷導(dǎo)致的rgc死亡。 采用基因療法轉(zhuǎn)染這些營養(yǎng)因子，能克服重復(fù)注射帶來的并 發(fā)癥。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(b rain-derived neurotrophic factor,bdnf)是一種重要的rgc存活因子。di

21、polo等19 通過玻璃體腔內(nèi)bdnf表達(dá)的腺病毒載體能暫時性延緩視神 經(jīng)橫斷性損傷后rgc死亡。但是基于腺病毒載體的轉(zhuǎn)基因表 達(dá)有效時間相對較短，而且其本身易引起炎癥反應(yīng)。腺相關(guān) 病毒(aav)載體能夠在視網(wǎng)膜進(jìn)行長期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，引起 的眼部炎癥反應(yīng)很輕微。martin等20通過采用532nm二極 管激光處理大鼠小梁網(wǎng)引起中等程度的慢性眼壓升高，只導(dǎo) 致特異性的rgc喪失，而不損害其他視網(wǎng)膜層。他們采用獨 創(chuàng)的aav-bdn f結(jié)合土撥鼠肝炎逆轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元素(woodchuc khepatitispo sttranscrip tionalregula toryelement, wpre),單

22、次玻璃體腔內(nèi)病毒注射2wk內(nèi)就很容易在大鼠rgc 層神經(jīng)元產(chǎn)生很高的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明實驗性青光眼4wk 后，玻璃體腔內(nèi)注射aav-b dnf-wpre與單純注射生理鹽水或 不含bdnf的對照病毒相比，能明顯增加rgc的存活率(軸突 計數(shù))，進(jìn)一步支持神經(jīng)營養(yǎng)療法可作為青光眼降低眼壓的 補充治療的潛在可行性。dingwell 21 等證實堿性成纖維生長因子(basicfibro blastgrowthf actor, bfgf)在rgc生長發(fā)育過程中是一種潛 在的刺激因子。但cu i 22在視神經(jīng)顱內(nèi)段軸性損傷后，采 用眼內(nèi)注射bfgf蛋白質(zhì)未能顯示rgc再生。據(jù)推測，這是 由于bfgf在體內(nèi)

23、的半衰期很短，在眼內(nèi)持續(xù)時間有限。 sap i eha等23 采用視神經(jīng)微壓榨傷(m icro-crushle si on) 制作視神經(jīng)損傷模型，用重組aav將bfgf基因轉(zhuǎn)入成年sd 大鼠玻璃體腔，以利于bfgf的持久釋放。與對照組的神經(jīng) 相比，fgf-2基因轉(zhuǎn)染后，視神經(jīng)軸突從病變部位向后的數(shù) 量要多10倍，這種上調(diào)反應(yīng)與fgf受體-1表達(dá)相關(guān)。bfgf 轉(zhuǎn)基因表達(dá)只對受損的rgc起暫時性的保護(hù)作用，而且這種 神經(jīng)營養(yǎng)因子對軸突延伸并不能代表神經(jīng)元存活數(shù)量的增 加。近年來，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(c訂ia ryneurotroph icfactor.cndf)被證明是能改善受損的rgc的存活與再

24、生最 有前途的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一。v anadel等24采用視神經(jīng)橫 斷性損傷作為在體模型，評價具有自我失活的復(fù)制缺陷的慢 病毒相關(guān)的載體轉(zhuǎn)染人類睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(sin-pgk-c nft) 對成年大鼠rgc軸突存活率的影響。他們采用單次玻璃體內(nèi) 注射慢病毒編碼的人cntf (lv-cntf)基因或細(xì)菌b-半乳糖 酶(lv-lacz )作為對照組，在大鼠視神經(jīng)軸性損傷后14d與 21 d檢測rgc的存活情況。結(jié)果表明，與對照組相比，用 lentiviral作為載體應(yīng)用cntf,能明顯增強rgc的存活， 而且效果比單純玻璃體內(nèi)注射重組人cntf要好。色素上皮源性因子(pigme nt epith

25、elium -derivedfac t or,pedf),是一種50kda蛋白質(zhì)，由人胚胎視網(wǎng)膜色素上皮 細(xì)胞分泌。已經(jīng)證明pedf是一種有希望的內(nèi)源性新生血管 形成抑制劑和神經(jīng)保護(hù)蛋白質(zhì)。takita等25采用前房內(nèi)灌 注生理鹽水，將大鼠眼壓升高至110m mhg,持續(xù)60min,制 作壓力誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜缺血-再灌注模型。在模型制作前4d玻 璃體腔內(nèi)注射腺病毒載體表達(dá)的pedf()顆粒。結(jié)果表明，節(jié) 細(xì)胞層細(xì)胞密度明顯多于對照組()；但凋亡細(xì)胞數(shù)(tun el 陽性細(xì)胞)明顯少于對照組。提示腺病毒載體相關(guān)的眼內(nèi) pedf表達(dá)能明顯增加視網(wǎng)膜缺血-再灌注(急性高眼壓)損傷 神經(jīng)元的存活率，這種保

26、護(hù)作用可能源于抑制缺血誘導(dǎo)的凋 亡，并認(rèn)為轉(zhuǎn)基因方法能直接干擾因視網(wǎng)膜缺血所導(dǎo)致的細(xì) 胞程序化死亡。原癌基因bcl-2的過度表達(dá)可以減少細(xì)胞凋亡，但它是 否影響軸突再生尚無定論。be 1-2在胚胎感覺神經(jīng)元的體外 實驗以及生后受損rgc的體內(nèi)、外實驗中可以促進(jìn)軸突生長， 但卻不能誘導(dǎo)新生小鼠軸突重建。在成年嚙齒類動物，即使 去除了髓鞘相關(guān)抑制分子或加入周圍神經(jīng)移植物，bcl-2過 度表達(dá)仍不能進(jìn)一步加強軸突再生。bcl-xl是b cl-2家族 的一個成員，去除該基因可增加發(fā)育性細(xì)胞死亡，而過度表 達(dá)可保護(hù)生后及成年神經(jīng)元免于創(chuàng)傷、缺氧、代謝等損傷 26 。kretz等26將bcl-xl通過腺病

27、毒載體在體外、體 內(nèi)受損的rgc中過度表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)能使培養(yǎng)的rgc軸突的數(shù) 目、總長度增加，活體視網(wǎng)膜內(nèi)rgc的軸突可以長入鄰近的 視神經(jīng)斷端，但不能通過瘢痕形成的區(qū)域。其中機制有待闡 明，bcl-2和bcl-xl很可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和再生的通 路而起作用的。抑制濾過泡的瘢痕化27,28眼壓升高是青光眼的主要 危險因素，施行手術(shù)降低眼壓仍然是治療青光眼的主要手段。 濾過性手術(shù)是目前常用的抗青光眼手術(shù)，但術(shù)后濾過道的疤 痕形成將導(dǎo)致手術(shù)失敗，因此常常在術(shù)中或術(shù)后聯(lián)合應(yīng)用抗 代謝藥物，如絲裂霉素c(mitomyc in,mmc)和5-氟尿11 密噪以 減少濾過道的疤痕形成。但它們同時也會產(chǎn)生意

28、想不到的副 作用，如低眼壓和由于細(xì)胞破壞導(dǎo)致的組織變性?；虔煼?能預(yù)防青光眼濾過性手術(shù)后增殖的傷口愈合反應(yīng)。perkins 等29給新西蘭白兔施行全層鞏膜切除術(shù)，并在以角膜緣為 基底的結(jié)膜瓣下放置浸有含人p21基因()的復(fù)制缺陷的重組 腺病毒、非特異的綠熒光蛋白標(biāo)記基因(greenfluor escentprotei n, gfp)、b -半乳糖酶(beta-galactosidase)、 mm c(/l)及平衡鹽溶液的纖維素海綿5mino結(jié)果表明，經(jīng)基 因處理的筋膜成纖維細(xì)胞dna合成和細(xì)胞生長呈現(xiàn)劑量依賴 性抑制。但mmc引起薄壁濾過泡、前房積膿等并發(fā)癥，在基 因處理組未發(fā)現(xiàn)。兩組在實驗

29、結(jié)束時均可見功能性濾過泡。 這提示基因療法能為青光眼濾過性手術(shù)提供有效的抗纖維 增殖作用，但沒有mmc相關(guān)的并發(fā)癥發(fā)生。為進(jìn)一步了解基 因的適應(yīng)證，w en等30研究了兔眼結(jié)膜局部轉(zhuǎn)染腺病毒 p21基因后，載體傳送、靶組織的轉(zhuǎn)基因表達(dá)、炎癥反應(yīng)、非 靶組織的生物分布和免疫反應(yīng)等特征。結(jié)果表明，結(jié)膜下注 射后，其生物分布只局限于眼組織；濾過性手術(shù)后，將轉(zhuǎn)染 至結(jié)膜下，術(shù)后早期引起急性炎癥反應(yīng)，但到第14天時與 安慰劑對照組無明顯區(qū)別。這些結(jié)果顯示，將基因局部轉(zhuǎn)染 至結(jié)膜是一個非常合適的眼部基因轉(zhuǎn)染模型。heatle y等31先采用重組腺病毒將人類p21 (waf -1/cip-l)基因引入猴高眼

30、壓眼，然后施行小梁切除術(shù)，結(jié) 果表明經(jīng)p21處理眼造痿口在功能上、組織學(xué)上均保持開放, 并沒有發(fā)現(xiàn)在對照眼上出現(xiàn)絲裂霉素c治療的副作用。yo on 等32在正常兔眼施行青光眼濾過性手術(shù)后，結(jié)膜下注射2 u ghuma nrad50(hrad5 0)基因，采用光鏡和電鏡比較hrad50 處理組與mmc處理組和正常對照組的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果表明， 局部應(yīng)用rad50的抗纖維增殖作用與mmc相同，但沒有結(jié)膜 上皮基質(zhì)層的損害，提示hrad50可作為一種可能的抗纖維 增殖藥物用于青光眼濾過性手術(shù)，但需要更進(jìn)一步研究其可 能存在的全身并發(fā)癥。4與青光眼組織相關(guān)的潛在的靶基因小梁網(wǎng)細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白：通過破壞

31、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu), 刺激房水流出增加;(2)myocilin基因：高度表達(dá)野生型位點, 競爭突變位點；金屬蛋白酶：細(xì)胞外基質(zhì)重新塑型3。睫狀上皮調(diào)節(jié)房水生成24h節(jié)律的基因：減少夜間房 水生成增加所導(dǎo)致的潛在性的危險眼壓水平。b腎上能受 體增進(jìn)睫狀體細(xì)胞對藥物反應(yīng)的潛能，抑制房水生成。減 少房水生成的其他基因(神經(jīng)多肽鏈)：調(diào)整小梁網(wǎng)和睫狀肌 的功能3。睫狀肌細(xì)胞x基因：上調(diào)前列腺素的合成；金屬蛋 白酶：產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，增加葡萄膜鞏膜通道房水流出 3。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)素受體(trkb):增加rgc 對神經(jīng)營養(yǎng)因子反應(yīng)的潛能；神經(jīng)營養(yǎng)素基因(bcix):增 加內(nèi)源性抗凋亡基因產(chǎn)物水平以拮

32、抗bax功能;bax基因： 反義結(jié)構(gòu)以減少bax蛋白水平；hsp70/72基因：增進(jìn)rgc 對內(nèi)源性刺激反應(yīng)能力，以抵抗損害性刺激3。mu iler細(xì)胞glast :上調(diào)內(nèi)源性谷氨酸鹽運輸體， 增進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)谷氨酸鹽水平；神經(jīng)營養(yǎng)素基因：為rgc 提供神經(jīng)營養(yǎng)素的替代資源3。5青光眼基因治療存在的問題和展望基因治療最常見的負(fù)面反應(yīng)表現(xiàn)在前房內(nèi)出現(xiàn)的主要 由單核細(xì)胞浸潤組成的炎癥反應(yīng)。這種反應(yīng)在靈長類比嚙齒 類更常見，至少發(fā)生在hsv載體中。在注射高濃度腺病毒載 體時，兔眼和猴眼都可能出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，這可能與載 體病毒誘導(dǎo)的炎癥前細(xì)胞激酶的作用有關(guān)。而且，這種炎癥 反應(yīng)是劑量依賴性的，但aa

33、v和lv載體并不誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。目前，青光眼基因治療在眼科領(lǐng)域尚處于實驗起始階段, 既面臨基因治療普遍碰到的問題，也有青光眼治療中的特殊 問題，還有許多理論、技術(shù)等方面的問題亟待解決。我們需 要更好地理解小梁細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞骨架改型和細(xì)胞 信號事件；更好地理解房水的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)，睫狀上皮釋放的 能改變小梁網(wǎng)功能的因子；更好地理解rgc在經(jīng)受各種刺激 和升高與不升高眼壓條件下細(xì)胞死亡的激活通路；更好地理 解機體對各種載體系統(tǒng)的內(nèi)在的和抗原特性的免疫反應(yīng)；更 好地理解這些反應(yīng)在嚙齒類和靈長類動物的差別以減輕這 些反應(yīng)類型。同時需要能夠模仿導(dǎo)致眼壓升高的小梁網(wǎng)和睫狀上皮變化的動物模型以檢測基因治療

34、的效果。努力確認(rèn)與 青光眼相關(guān)的其他基因?qū)楦玫幕蛑委煵呗蕴峁┲匾?線索。最后，關(guān)鍵是要理解為什么源于不同載體的異位基因 表達(dá)會在不同的眼組織細(xì)胞中終止；關(guān)鍵是要證實啟動子或 其他基因表達(dá)元件能夠提供長期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)3。總之，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展與基因工程的日新月 異，過去的困難現(xiàn)已迎刃而解，相信在不久的將來，青光眼基 因治療一定會在臨床上逐步展現(xiàn)其優(yōu)越性?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】inashms,osbornenn. assessmentofthy一1mrnalevelsas anindexofret inalganglion celldamage investophthal molvissci,

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