實(shí)驗(yàn)七 植物mRNA原位雜交技術(shù)上課講義

1、實(shí)驗(yàn)七 植物mRNA原位雜交技術(shù)mRNA原位雜交技術(shù)的原理原位雜交（insituhybridization）是一種在細(xì)胞水平上研究基因表達(dá)調(diào)控的最直接有效的分子生物學(xué)技術(shù)。RNA原位雜交是用同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記的雙鏈DNA或單鏈反義RNA探針對(duì)組織切片或裝片的不同細(xì)胞中基因產(chǎn)物mRNA或rRNA進(jìn)行原位定位。分布于細(xì)胞中的mRNA與反義RNA探針互補(bǔ)而雜交產(chǎn)生雙鏈的RNA。標(biāo)記在反義鏈上的同位素經(jīng)放射自顯影、非同位素經(jīng)酶促免疫顯色或免疫熒光反應(yīng)，均可顯示mRNA在植物組織細(xì)胞中的分布位置。用標(biāo)記的有義RNA作探針，由于與細(xì)胞內(nèi)的mRNA不互補(bǔ)而不能雜交，可以作為對(duì)照。材料固定混合固定液：混

2、合固定液：1、 FAA固定液：植物組織最常用的固定液。固定時(shí)間不受限制，并且固定后材料可以正常染色。配方：50%或70%酒精90毫升（軟材料用50%酒精，硬材料用70%酒精），冰醋酸5 ml，福爾馬林5 ml。2、卡爾諾氏（Carnoys）固定液：多用于組織和細(xì)胞的固定，滲透力極快，一般情況下，固定根尖和花藥只需40-60分鐘。固定后用95%酒精沖洗，在組織不能立即處理時(shí)，需轉(zhuǎn)入70酒精中保存。配方1：15 ml乙醇和5 ml冰醋酸混合；配方2：30 ml乙醇，5 ml氯仿和1 ml冰醋酸混合。3、納瓦興（Navaschjns）固定液：植物制片技術(shù)中廣泛應(yīng)用。配方：75 ml 1%鉻酸，5 m

3、l冰醋酸和20 ml福爾馬林混合。根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料的種類，目前有很多的改良液，效果更好。材料脫水材料洗滌后，如果材料含有水分，水與石蠟不能相溶，通常用酒精脫水。材料由水入酒精中，由低濃度酒精漸至高濃度酒精。通常由30%、50%、70%、80%到90%酒精，每次須經(jīng)半小時(shí)左右，具體的時(shí)間由材料大小而定。材料可放在70酒精中較長(zhǎng)保存，但在高濃度酒精中不能過(guò)久。因?yàn)榫凭苁共牧嫌不^(guò)久則材料由硬而脆，切片時(shí)易于粉碎。材料透明材料脫水后，仍需除去酒精，脫酒精通常用二甲苯。材料由酒精入二甲苯，也需要漸次進(jìn)行，先經(jīng)酒精和二甲苯的混合液，再入純二甲苯中，純二甲苯須換一、二次才行。時(shí)間每次約半小時(shí)。二甲苯不僅脫

4、去酒精，并且具透明作用，所以又叫透明劑。材料包埋埋蠟是把材料包埋在石蠟里面，便于切片。石蠟質(zhì)地必須純凈，溶點(diǎn)通常在48-56 范圍內(nèi)，以52 的石蠟使用更為方便。將石蠟置陶瓷缽中加熱熔化；在進(jìn)行封埋的全過(guò)程中，石蠟的溫度以高于溶點(diǎn)2 為宜，溫度低則石蠟?zāi)?，溫度過(guò)高則傷害實(shí)驗(yàn)材料。在包埋之前需要對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行浸蠟。浸蠟需要漸次進(jìn)行。一般先用石蠟和二甲苯的混合液浸蠟，再用純石蠟換1-2次，每次時(shí)間視材料大小而定，通常每次半小時(shí)。二、制片（12月3日）切片切片： 1. 先將蠟塊切成小塊，粘固在小木頭樁上。 2. 安裝切片刀，調(diào)好角度和切口部位。 3. 根據(jù)需要調(diào)整切片厚度，進(jìn)行切片。展片展片：將切

5、好的石蠟材料平展在玻片上，一般借助水將石蠟切片展開。粘片粘片：通過(guò)加熱使切好蠟帶平展在載玻片上。用濾紙吸去載玻片上多余水分，同時(shí)以記號(hào)筆在玻片上編號(hào)以確定材料方位，放入42溫箱中烘干，約12小時(shí)。粘片（載玻片的處理）多數(shù)采用多聚賴氨酸作為粘貼劑，多聚賴氨酸常用PBS配制。方法：用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內(nèi)，使其溫度回升至室溫（一般為18-26 ）。將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液中5-30分鐘。然后在60 烘箱干燥1小時(shí)，或室溫18-26 過(guò)夜干燥，待用。三、探針制備RNA探針是指帶有標(biāo)記的能與組織內(nèi)相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。根據(jù)在RNA雜交中所使用的探

6、針依其來(lái)源可分為三種：1、特異性特異性cDNA： cDNA中不存在內(nèi)含子及其它高度重復(fù)序列，又克服了雙鏈cDNA探針在雜交反應(yīng)中兩條鏈之間復(fù)性的缺點(diǎn)，從而提高了雜交反應(yīng)的敏感性2、cRNA探針探針：以cDNA為模板，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄而獲得的。因?yàn)樗且环N單鏈探針，因此也避免了應(yīng)用雙鏈cDNA探針做雜交反應(yīng)時(shí)存在的兩條鏈之間的復(fù)性問(wèn)題。cRNA與RNA之間形成的雜交體要比cDNA-RNA雜交體穩(wěn)定。cRNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響。因此雜交反應(yīng)后可用RNA酶處理，以除去未結(jié)合的探針。3、人工合成寡核苷酸探針人工合成寡核苷酸探針：人工合成的寡核苷探針是以核苷酸為原料，通過(guò)DNA合成儀

7、合成，避免了真核細(xì)胞中存在的高度重復(fù)序列帶來(lái)的不利影響。它與mRNA形成的雜交體不如cRNA-RNA雜交體穩(wěn)定，再則探針較短，所攜帶的標(biāo)記物少，敏感性較低。探針標(biāo)記同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針1、同位素標(biāo)記：主要包括3H、35C、32P和125I等，不同的同位素探針其穿透力、定位和半衰期各不相同，無(wú)一種同位素探針具有穿透力強(qiáng)、定位好和半衰期長(zhǎng)所有優(yōu)點(diǎn)。2、非同位素標(biāo)記;標(biāo)記物主要有生物素、地高辛、酶和熒光標(biāo)記等。其中地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過(guò)程中受組織內(nèi)源性生物素干擾等缺點(diǎn)，其應(yīng)用

8、越來(lái)越廣泛。標(biāo)記探針的方法酶反應(yīng)法：酶反應(yīng)法：用于RNA探針的酶反應(yīng)法主要為末端標(biāo)記法與體外轉(zhuǎn)錄法。1、末端標(biāo)記末端標(biāo)記：適用于合成寡核苷酸探針的標(biāo)記，用末端標(biāo)記制備的探針一般攜帶的標(biāo)記分子較少。2、體外轉(zhuǎn)錄法體外轉(zhuǎn)錄法是一種制備與片段序列相同的單鏈RNA探針的方法。進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)，先將靶核苷酸序列轉(zhuǎn)入到含噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的載體中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA為模板，以含有標(biāo)記的三磷酸苷為原料，對(duì)啟動(dòng)子下游的序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，而啟動(dòng)子本身并不被轉(zhuǎn)錄。體外轉(zhuǎn)錄法制備探針體外轉(zhuǎn)錄常用噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，如沙門氏菌噬菌體和大腸桿菌噬菌體T3、T7。當(dāng)兩個(gè)不同的噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子結(jié)合在載體多位點(diǎn)的兩側(cè)

9、，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶在插入序列的下游將質(zhì)粒線性化。SP6噬菌體的RNA聚合酶對(duì)SP6啟動(dòng)子序列具有高度的親和性，從而啟動(dòng)下游的轉(zhuǎn)錄，在4種三磷酸核糖核苷和相應(yīng)的噬菌體RNA聚合酶存在的條件下，即轉(zhuǎn)錄成RNA。如反應(yīng)物中含有標(biāo)記的三磷酸核糖苷核，所有的RNA就被標(biāo)記。體外轉(zhuǎn)錄法中常使用的載體mRNA雜交探針（體外轉(zhuǎn)錄）T7 promoter55 與mRNA序列相同，對(duì)照探針與mRNA序列互補(bǔ)，探針T3 promoterHind III探針長(zhǎng)度（200-500bp）通過(guò)限制性內(nèi)切酶的酶切控制體外轉(zhuǎn)錄合成探針的長(zhǎng)度！體外轉(zhuǎn)錄制備探針的步驟1、將目的基因的特異性片段構(gòu)建在合適的載體中；2、通過(guò)限制性

10、酶切控制轉(zhuǎn)錄合成探針的大??；3、體外轉(zhuǎn)錄（同時(shí)標(biāo)記探針）地高辛標(biāo)記的體外轉(zhuǎn)錄（12月3日）1、按照下表將各成分加入EP管中，混勻后在37 保溫2小時(shí)；2、加入2 l無(wú)RNase的DNaseI，37保溫15分鐘；3、加入2 l 0.2 mol/L EDTA終止反應(yīng)；4、加入2.5 l 4 mol/L LiCl 和75 l冰冷的100%乙醇，沉淀過(guò)夜；5、12000 rpm，4 離心15分鐘。用70%冷乙醇清洗后在室溫下進(jìn)行干燥。6、根據(jù)沉淀物的多少（一般為6-10 g），重懸于30-50 l DEPC-H2O中， 并加入20 U RNase抑制劑，-20 保存。四、預(yù)雜交預(yù)雜交（12月月4日上午

11、）日上午）1將已粘片的石蠟切片在二甲苯中脫蠟30分鐘。2在二甲苯：乙醇（1:1）、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、30%乙醇和DEPC-H20中復(fù)水，每級(jí)2-5分鐘。3在0.2 mol/L HCl中浸20分鐘。4在2 SSPE中洗2次，DEPC-H2O中洗2次，每次5分鐘。5在含有1%牛血清白蛋白的10 mmol/L Tris-HCl（pH 8）中浸10分鐘。6DEPC-H2O中洗2次，每次5分鐘。7經(jīng)30%，70%，95%，100%乙醇系列脫水，每次2-5分鐘，室溫晾干。五、雜交（12月月4日）日）1、將轉(zhuǎn)錄物用稀釋液（50%甲酰胺，10 mM二硫蘇糖醇（DTT），用DEPC-H2O定

12、容）稀釋。2、70加熱5分鐘，再加入雜交緩沖液。3、每玻片上加雜交液100 l，輕輕蓋上經(jīng)180 烘烤8小時(shí)以上的蓋玻片。4、在濕盒中60 保溫過(guò)夜。（約12-16小時(shí)）雜交緩沖液配方雜交緩沖液配方10鹽：3 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl （pH 6.8），0.1 mol/L Na2HPO4， 50 mmol/L EDTA，溶于DEPC-H2O。六、雜交后處理（12月5日上午）1、讓蓋玻片在2 SSC中自由滑落，室溫浸泡15分鐘。2、轉(zhuǎn)入另一2 SSC中浸泡15分鐘。3、1 SSC中15分鐘。4、0.5 SSC中15分鐘。七、免疫反應(yīng)（12月5上午）1、在緩沖液I

13、（100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.5）中5分鐘。2、每片滴加約500 l含2%正常兔血清，0.3% Triton X-100的緩沖液I，室溫放置30分鐘，作封阻反應(yīng)。3、將anti-DIG-AP按1:500的比例用含1正常兔血清，0.15% Triton X-100的緩沖液稀釋。4、倒掉封阻液，每片滴加100 l稀釋的anti-DIG-AP，室溫條件下，在濕盒中放置2-4小時(shí)。八、顯色反應(yīng)（12月5日下午） 1、玻片在緩沖液I中浸2次，每次15分鐘。2、緩沖液II（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2，pH 9.5）中5分鐘。3、將10%聚乙烯醇（PVA）90 溶于100 mmol/L Tris-HCl（pH 9.5），100 mmol/L NaCl中，冷卻至室溫后，每ml PVA溶液中加50 l 1 mol/L MgCl2，5 l氮藍(lán)四唑（NBT），3.75 l 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）配成顯色液。4、每片滴加200 l顯色液，置濕盒中37 黑暗處顯色6-12小時(shí)。九、封片觀察（12月6日）1、將載玻片轉(zhuǎn)入緩沖液III（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmo