DNA測序技術(shù)PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計(jì)學(xué)1DNA測序技術(shù)測序技術(shù)一、DNA序列測定的意義二、測序技術(shù)的建立三、DNA測序技術(shù)的發(fā)展四、DNA測序技術(shù)的展望五、DNA測序技術(shù)的應(yīng)用第1頁/共45頁 DNADNA的序列測定是分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)的序列測定是分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達(dá)與調(diào)控、基因片段的合成和探針組建、基因表達(dá)與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對DNADNA一一級結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了

2、解。級結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解。第2頁/共45頁 人類基因組計(jì)劃（人類基因組計(jì)劃（Human Genome ProjectHuman Genome ProjectHGPHGP）于）于19901990年正式啟動，其主要目標(biāo)有：識別人類年正式啟動，其主要目標(biāo)有：識別人類DNADNA中所有基因（超過中所有基因（超過1010萬個(gè)）；測定組成人類萬個(gè)）；測定組成人類DNADNA的的3030億堿基對的序列億堿基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計(jì)劃可能引發(fā)的發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計(jì)劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會問題。已于倫理、法律和社會問

3、題。已于20032003年完成。年完成。人類基因組計(jì)劃是當(dāng)代生命科學(xué)一項(xiàng)偉大的科學(xué)工人類基因組計(jì)劃是當(dāng)代生命科學(xué)一項(xiàng)偉大的科學(xué)工程，它奠定了程，它奠定了2121世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大意義和商業(yè)上的巨大產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價(jià)值。價(jià)值。第3頁/共45頁19491949年年, Frederick Sanger, Frederick Sanger開發(fā)了測定胰島素兩條肽鏈開發(fā)了測定胰島素兩條肽鏈氨基末端序列的技術(shù)氨基末端序列的技術(shù),1953,1953年測定了胰島素的氨基酸序列年測定了胰島素的氨基酸序列

4、。19501950年年，EdmanEdman提出了蛋白質(zhì)的提出了蛋白質(zhì)的N N端測序技術(shù)端測序技術(shù), ,后來在后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了蛋白質(zhì)自動測序技術(shù)。此基礎(chǔ)上發(fā)展出了蛋白質(zhì)自動測序技術(shù)。19651965年年，SangerSanger等發(fā)明了等發(fā)明了RNARNA的小片段序列測定法的小片段序列測定法, ,并并完成了大腸桿菌完成了大腸桿菌5S rRNA5S rRNA的的120120個(gè)核苷酸的測定。個(gè)核苷酸的測定。同一時(shí)期同一時(shí)期,Holley,Holley完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)tRNAtRNA的序列測定的序列測定。第4頁/共45頁19751975年，年，SangerSanger和

5、和CoulsonCoulson發(fā)明了發(fā)明了“加減法加減法”測定測定DNADNA序列。序列。19771977年年， Sanger Sanger在引入雙脫氧核苷三磷酸在引入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)(ddNTP)后后, ,形成了雙脫氧鏈終止法形成了雙脫氧鏈終止法, ,使得使得DNADNA序列測定的效率和準(zhǔn)確序列測定的效率和準(zhǔn)確性大大提高。性大大提高。19771977年年，MaxamMaxam和和GilbertGilbert報(bào)道了化學(xué)降解法測定報(bào)道了化學(xué)降解法測定DNADNA的序列。的序列。第5頁/共45頁 DNA DNA序列測定技術(shù)出現(xiàn)后序列測定技術(shù)出現(xiàn)后, ,迅速超越了蛋迅速超越了蛋白質(zhì)和白

6、質(zhì)和RNARNA測序技術(shù)測序技術(shù), ,成為現(xiàn)代分子生物學(xué)中成為現(xiàn)代分子生物學(xué)中最重要的技術(shù)。最重要的技術(shù)。第6頁/共45頁第7頁/共45頁第一代第一代DNADNA測序技術(shù)測序技術(shù)： 傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來的各種基礎(chǔ)上發(fā)展來的各種DNADNA測序技術(shù)。測序技術(shù)。 第一代第一代DNADNA測序技術(shù)包括：測序技術(shù)包括：化學(xué)降解法化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終雙脫氧鏈終止法止法、熒光自動測序技術(shù)熒光自動測序技術(shù)和和雜交測序技術(shù)雜交測序技術(shù)。第8頁/共45頁基本原理基本原理: : 利用特異的利用特異的選擇性試劑選擇性試劑，專一性的隨機(jī)

7、斷裂，專一性的隨機(jī)斷裂DNADNA成不同長短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段成不同長短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的在高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶位置，判上的區(qū)帶位置，判斷斷DNADNA片段末端核苷酸的種類，從而測出片段末端核苷酸的種類，從而測出DNADNA的序的序列。列。第9頁/共45頁 將雙鏈將雙鏈DNADNA樣品變?yōu)闃悠纷優(yōu)閱捂渾捂?每個(gè)單鏈的同一方向末端都用放射每個(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素性同位素標(biāo)記標(biāo)記, ,以便顯示以便顯示DNADNA條帶條帶 分別用不同方法處理分別用不同方法處理, ,獲得只差獲得只差一個(gè)核苷酸的一個(gè)核苷酸的降解降解DN

8、ADNA群體群體 電泳電泳, ,讀取讀取DNADNA的核苷酸順序的核苷酸順序技術(shù)路技術(shù)路線線第10頁/共45頁堿基堿基特異修飾方法特異修飾方法GPh8.0,用用硫酸二甲酯硫酸二甲酯對對 N7進(jìn)行甲基化進(jìn)行甲基化,使使 C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0 哌啶甲酸哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的可使嘌呤環(huán)的N原子化原子化,從而導(dǎo)從而導(dǎo)致脫嘌呤致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵鍵C+T肼肼可打開嘧啶環(huán)可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去除去C1.5mol/L NaCl存在時(shí)存在時(shí),可用可用肼肼除去胞嘧啶

9、除去胞嘧啶Maxam-Gilbert Maxam-Gilbert 法所用的化學(xué)技法所用的化學(xué)技術(shù)術(shù)第11頁/共45頁第12頁/共45頁 化學(xué)降解法剛問世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易為普通化學(xué)降解法剛問世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多。而且化學(xué)降解較之鏈研究人員所掌握，因此用得較多。而且化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測序列來自終止法具有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測序列來自原原DNA分分子子而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時(shí)造成的錯(cuò)而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時(shí)造成的錯(cuò)誤。但化學(xué)降解法操作過程較麻煩，且用到放射性物質(zhì)誤。但化學(xué)降解法操作過程較麻煩，且用到放射

10、性物質(zhì)，逐漸被簡便快速的，逐漸被簡便快速的Sanger法所代替。法所代替。第13頁/共45頁1.2 1.2 雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法 又稱為又稱為SangerSanger法。該法的原理是：法。該法的原理是：利用利用DNADNA聚合聚合酶，以待測酶，以待測單鏈單鏈DNADNA為模板，以為模板，以dNTPdNTP為底物，設(shè)立四為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入種相互獨(dú)立的測序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的不同的雙脫氧核苷三磷酸雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribo nucleoside dideoxyribo nucleoside triphos phatet

11、riphos phate，ddNTPddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測序）作為鏈延伸終止劑。在測序引物引導(dǎo)下，按照堿基配對原則，每個(gè)反應(yīng)體系中合引物引導(dǎo)下，按照堿基配對原則，每個(gè)反應(yīng)體系中合成一系列長短不一的引物延伸鏈，通過高分辨率的變成一系列長短不一的引物延伸鏈，通過高分辨率的變性性聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離，放射自顯影放射自顯影檢測后，從檢測后，從凝膠底部到頂部按凝膠底部到頂部按5353方向讀出新方向讀出新合成鏈序列合成鏈序列，由此推知待測模板鏈的序列由此推知待測模板鏈的序列 。第14頁/共45頁 POHdNTPddNTP POHOH P P P POH第15頁/共45

12、頁雙雙脫脫氧氧鏈鏈末末端端終終止止法法測測序序原原理理示示意意圖圖 第16頁/共45頁 Sanger Sanger法因操作簡便，得到廣泛的應(yīng)用。后法因操作簡便，得到廣泛的應(yīng)用。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNADNA測序技術(shù)，其中測序技術(shù)，其中最重要的是最重要的是熒光自動測序技術(shù)熒光自動測序技術(shù)。第17頁/共45頁1.3 1.3 熒光自動測序技術(shù)熒光自動測序技術(shù) 熒光自動測序技術(shù)基于熒光自動測序技術(shù)基于SangerSanger原理，用原理，用熒光標(biāo)記代替熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo)記同位素標(biāo)記，并用，并用成像系統(tǒng)成像系統(tǒng)自動檢測，從而大大提高了自動檢測，從而大大提高了DNADNA測序

13、的速度和準(zhǔn)確性。測序的速度和準(zhǔn)確性。 目前，應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司目前，應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(applied (applied biosystemsbiosystems ，ABI)3730ABI)3730系列自動測序儀即是基于系列自動測序儀即是基于毛細(xì)管毛細(xì)管電泳電泳和和熒光標(biāo)記技術(shù)熒光標(biāo)記技術(shù)的的DNADNA測序儀測序儀。如。如ABI3730XLABI3730XL測序儀測序儀擁有擁有9696道毛細(xì)管，道毛細(xì)管，4 4種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記，在通過毛細(xì)管時(shí)不同長度的，在通過毛細(xì)管時(shí)不同長度的DNADNA片段上的片段上的4

14、4種熒種熒光基團(tuán)被激光激發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，被光基團(tuán)被激光激發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，被CCDCCD檢測系檢測系統(tǒng)識別，并直接翻譯成統(tǒng)識別，并直接翻譯成DNADNA序列。序列。第18頁/共45頁目前所用自動測序技術(shù)的改進(jìn)目前所用自動測序技術(shù)的改進(jìn)第19頁/共45頁3730全自動測序儀第20頁/共45頁1.41.4雜交測序技術(shù)雜交測序技術(shù) 該方法不同于化學(xué)降解法和該方法不同于化學(xué)降解法和SangerSanger法，是利用法，是利用DNADNA雜交原理，將一系列雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片已知序列的單鏈寡核苷酸片段段固定在基片上，把待測的固定在基片上，把待測的DNADNA樣品片段變

15、性后與其樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。 雜交測序檢測速度快，采用標(biāo)準(zhǔn)化的高密度雜交測序檢測速度快，采用標(biāo)準(zhǔn)化的高密度寡核寡核苷酸芯片苷酸芯片能夠大幅度降低檢測的成本，具有部分第二能夠大幅度降低檢測的成本，具有部分第二代測序技術(shù)的特點(diǎn)。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)代測序技術(shù)的特點(diǎn)。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)測定。測定。第21頁/共45頁 通過幾十年的逐步改進(jìn)通過幾十年的逐步改進(jìn), , 第第1 1 代測序儀的讀長可以代測序儀的讀長可以超過超過1000 bp, 1000 bp, 原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)99

16、.999%, 99.999%, 測定每千堿基序列的成本是測定每千堿基序列的成本是0.5 0.5 美元美元, , 每天的數(shù)據(jù)通量每天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到可以達(dá)到600000 600000 堿基。堿基。第22頁/共45頁 第一代測序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過重要的作第一代測序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過重要的作用用, ,如人類基因組計(jì)劃如人類基因組計(jì)劃(human genome projec(human genome project t,HGP),HGP)主主要基于第一代要基于第一代DNADNA測序技術(shù)。目前基于熒光標(biāo)記和測序技術(shù)。目前基于熒光標(biāo)記和SangerSanger的雙脫氧鏈終止法原理的的

17、雙脫氧鏈終止法原理的熒光自動測序儀熒光自動測序儀仍被廣泛仍被廣泛地應(yīng)用。地應(yīng)用。 隨著人類基因組計(jì)劃的完成隨著人類基因組計(jì)劃的完成, ,人們進(jìn)入了后基因組時(shí)代人們進(jìn)入了后基因組時(shí)代, ,即功能基因組時(shí)代即功能基因組時(shí)代, ,傳統(tǒng)的測序方法已經(jīng)不能滿足傳統(tǒng)的測序方法已經(jīng)不能滿足深度測深度測序序和和重復(fù)測序重復(fù)測序等大規(guī)模基因組測序的需求等大規(guī)?；蚪M測序的需求, ,這促使了新一代這促使了新一代DNADNA測序技術(shù)的誕生。新一代測序技術(shù)即測序技術(shù)的誕生。新一代測序技術(shù)即第二代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)。第23頁/共45頁 第二代測序技術(shù)，主要包括羅氏第二代測序技術(shù)，主要包括羅氏454454公司的公司的

18、GS FLXGS FLX測序平臺、測序平臺、IlluminaIllumina公司的公司的Solexa Genome AnalyzerSolexa Genome Analyzer測序平臺和測序平臺和ABIABI公司的公司的SOLiDSOLiD測序平臺。測序平臺。 第二代測序技術(shù)最顯著的特征是第二代測序技術(shù)最顯著的特征是高通量高通量, ,一次能對幾十一次能對幾十萬到幾百萬條萬到幾百萬條DNADNA分子進(jìn)行序列測序分子進(jìn)行序列測序, ,使得對一個(gè)物種的轉(zhuǎn)使得對一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組測序或基因組深度測序變得方便易行錄組測序或基因組深度測序變得方便易行。第24頁/共45頁 第二代測序技術(shù)將片段化的基因組第二代

19、測序技術(shù)將片段化的基因組DNADNA兩側(cè)連上接兩側(cè)連上接頭頭, ,隨后用不同的方法產(chǎn)生幾百萬個(gè)隨后用不同的方法產(chǎn)生幾百萬個(gè)空間固定的空間固定的PCRPCR克隆克隆陣列陣列。每個(gè)克隆由單個(gè)文庫片段的多個(gè)拷貝組成。然后。每個(gè)克隆由單個(gè)文庫片段的多個(gè)拷貝組成。然后進(jìn)行進(jìn)行引物雜交引物雜交和和酶延伸反應(yīng)酶延伸反應(yīng)。由于所有的克隆都在同一。由于所有的克隆都在同一平面上平面上, ,這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進(jìn)行這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進(jìn)行, ,每個(gè)延伸反應(yīng)所每個(gè)延伸反應(yīng)所摻入的摻入的熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記的成像檢測也能同時(shí)進(jìn)行的成像檢測也能同時(shí)進(jìn)行, ,從而獲得測序從而獲得測序數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)。DNADNA序列延伸和成

20、像檢測不斷重復(fù)序列延伸和成像檢測不斷重復(fù), ,最后經(jīng)過最后經(jīng)過計(jì)算計(jì)算機(jī)分析機(jī)分析就可以獲得完整的就可以獲得完整的DNADNA序列信息。序列信息。 第二代測序技術(shù)包括：第二代測序技術(shù)包括：454454測序技術(shù)測序技術(shù)、SolexaSolexa測序測序技術(shù)技術(shù)和和SOLiDSOLiD測序技術(shù)測序技術(shù)。第25頁/共45頁2.1 4542.1 454測序技術(shù)測序技術(shù) 原理：在原理：在DNADNA聚合酶聚合酶、ATPATP硫酸化酶硫酸化酶、熒光素酶熒光素酶和和雙磷酸酶雙磷酸酶的作用下，將每一個(gè)的作用下，將每一個(gè)dNTPdNTP的聚合與一次的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學(xué)發(fā)光信化學(xué)發(fā)

21、光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學(xué)發(fā)光信號的有無和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測號的有無和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測DNADNA序列的目的。序列的目的。 第26頁/共45頁第27頁/共45頁 454 454生命科學(xué)公司在生命科學(xué)公司在20052005年最早推出了第二代測序平年最早推出了第二代測序平臺臺Genome Sequencer 20Genome Sequencer 20，并測序了支原體，并測序了支原體MycoplasmaMycoplasma genitaliumgenitalium的基因組。的基因組。 并在并在20072007年推出性年推出性能更優(yōu)的第二代基因組測序系統(tǒng)一能更優(yōu)的第二代基因組測序系統(tǒng)一Gen

22、ome Sequencer Genome Sequencer FLX System(GS FLX)FLX System(GS FLX)。羅氏在。羅氏在20052005年便與年便與454454公司洽談公司洽談并購事宜，并購事宜，20072007年完成并購，緊接著公布了年完成并購，緊接著公布了DNADNA雙螺旋的雙螺旋的發(fā)現(xiàn)者之一發(fā)現(xiàn)者之一沃森沃森(Jim Watson)(Jim Watson)的個(gè)人基因組，測序總的個(gè)人基因組，測序總花費(fèi)不到一百萬美元?；ㄙM(fèi)不到一百萬美元。第28頁/共45頁2.2 Solexa2.2 Solexa測序技術(shù)測序技術(shù) 核心技術(shù)：核心技術(shù)：“DNADNA簇簇”和和“可逆

23、性末端終止可逆性末端終止” ” 。 原理：將基因組原理：將基因組DNADNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即面（即Flow cellFlow cell），這些），這些DNADNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴(kuò)增后，片段經(jīng)過延伸和橋式擴(kuò)增后，在在Flow cellFlow cell上形成了數(shù)以億計(jì)上形成了數(shù)以億計(jì)ClusterCluster，每個(gè)，每個(gè)ClusterCluster是具有是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBSS

24、BS（邊合成邊測序）（邊合成邊測序）技術(shù)對待測的模板技術(shù)對待測的模板DNADNA進(jìn)行測序。進(jìn)行測序。 Illumina Illumina公司的新一代測序儀公司的新一代測序儀Genome AnalyzerGenome Analyzer最早由最早由SolexaSolexa公司研發(fā)，利用合成測序公司研發(fā)，利用合成測序( (SequencingbySequencingby Synthesis) Synthesis)的原理，實(shí)現(xiàn)自動化樣本制備及大規(guī)模平行測序。的原理，實(shí)現(xiàn)自動化樣本制備及大規(guī)模平行測序。第29頁/共45頁 Genome Analyzer Genome Analyzer系統(tǒng)需要的系統(tǒng)需要的

25、樣品量低至樣品量低至100ng100ng，文，文庫構(gòu)建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時(shí)間，配對庫構(gòu)建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時(shí)間，配對末端讀長可達(dá)到末端讀長可達(dá)到2 250 50 bpbp，每次運(yùn)行后可獲得超過，每次運(yùn)行后可獲得超過20 20 GBGB的高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)，且運(yùn)行成本較低，是性價(jià)比較的高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)，且運(yùn)行成本較低，是性價(jià)比較高的新一代測序技術(shù)。高的新一代測序技術(shù)。第30頁/共45頁 SOLID SOLID通過連接反應(yīng)進(jìn)行測序。其基本原理是以四色熒通過連接反應(yīng)進(jìn)行測序。其基本原理是以四色熒光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行多次連接合成

26、，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。具體步驟包括：接反應(yīng)。具體步驟包括：文庫準(zhǔn)備文庫準(zhǔn)備擴(kuò)增擴(kuò)增微珠與玻片連接微珠與玻片連接連接測序連接測序 超高通量是超高通量是SOLIDSOLID系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前SOLID 3SOLID 3單單次運(yùn)行可產(chǎn)生次運(yùn)行可產(chǎn)生50 GB50 GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于1717倍人類基兇組覆倍人類基兇組覆蓋度。蓋度。2.3 SOLiD2.3 SOLiD測序技術(shù)測序技術(shù)第31頁/共45頁第32頁/共45頁 第三代測序技術(shù)是以第三代測序技術(shù)是以單分子測序單分子測序?yàn)樘攸c(diǎn)的測序技術(shù)。為特點(diǎn)的測序技術(shù)。如生物科學(xué)公司如生物科學(xué)公司( (Bio

27、ScienceBioScience Corporation) Corporation)的的HeliScopeHeliScope單分子測序儀單分子測序儀(HeliScope SingleMolecular Sequencer)(HeliScope SingleMolecular Sequencer)以及正在研制的太平洋生物科學(xué)公司以及正在研制的太平洋生物科學(xué)公司(Pacific (Pacific Biosciences)Biosciences)的的單分子實(shí)時(shí)單分子實(shí)時(shí)DNADNA測序技術(shù)測序技術(shù)SingleMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing Singl

28、eMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing technologytechnology和牛津納米孔技術(shù)公司和牛津納米孔技術(shù)公司(Oxford (Oxford NanoporeNanopore TechnologiesLtdTechnologiesLtd) )的的納米孔單分子測序技術(shù)納米孔單分子測序技術(shù)等。等。第33頁/共45頁 目前目前, ,我國也啟動了第三代測序技術(shù)的研究。我國也啟動了第三代測序技術(shù)的研究。20092009年年1212月月, ,中科院北京基因組研究所與浪潮成立中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院中科院北京基因組研究所北京基因組研究所浪潮

29、基因組科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室”,”,利用利用各自的優(yōu)勢聯(lián)合研發(fā)國產(chǎn)第三代測序儀各自的優(yōu)勢聯(lián)合研發(fā)國產(chǎn)第三代測序儀, ,第一臺樣機(jī)預(yù)計(jì)第一臺樣機(jī)預(yù)計(jì)20132013年問世年問世, ,屆時(shí)有望緩解測序儀核心技術(shù)受制于國外屆時(shí)有望緩解測序儀核心技術(shù)受制于國外公司的現(xiàn)狀。公司的現(xiàn)狀。 第二代的高通量測序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和第二代的高通量測序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用應(yīng)用, , 但是由于其但是由于其測序速度、成本、準(zhǔn)確度測序速度、成本、準(zhǔn)確度等關(guān)鍵問題等關(guān)鍵問題的解決仍存在困難的解決仍存在困難, ,研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的測序解決方案。

30、的測序解決方案。 單分子測序也就應(yīng)運(yùn)而生。單分子測序也就應(yīng)運(yùn)而生。第34頁/共45頁第三代測序技術(shù)第三代測序技術(shù)非常驚人！非常驚人！1 1、它實(shí)現(xiàn)了、它實(shí)現(xiàn)了DNADNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測一秒可以測1010個(gè)堿基個(gè)堿基，測序速度是化學(xué)法測序的，測序速度是化學(xué)法測序的2 2萬倍。萬倍。2 2、它實(shí)現(xiàn)了、它實(shí)現(xiàn)了DNADNA聚合酶內(nèi)在自身的聚合酶內(nèi)在自身的processivityprocessivity（延續(xù)性（延續(xù)性，也就是，也就是DNADNA聚合酶一次可以合成很長的片段），聚合酶一次可以合成很長的片段），一個(gè)反一個(gè)反應(yīng)就可以測非常長的序列應(yīng)就可以測非

31、常長的序列。 二代測序現(xiàn)在可以測到上百個(gè)二代測序現(xiàn)在可以測到上百個(gè)堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個(gè)堿基。這為基因組堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個(gè)堿基。這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條件。的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條件。3 3、它的、它的精度非常高精度非常高，達(dá)到，達(dá)到99.9999%99.9999%。4 4、可直接測、可直接測RNARNA序列。序列。5 5、可直接測、可直接測甲基化的甲基化的DNADNA序列。序列。第35頁/共45頁 2008 2008年年4 4月，月，HelicoHelico BioScienceBioScience公司的公司的TimothyTimot

32、hy等人在等人在ScienceScience上報(bào)道了他們開發(fā)的真正的單分子測序上報(bào)道了他們開發(fā)的真正的單分子測序技術(shù)技術(shù), ,并利用該技術(shù)對一個(gè)并利用該技術(shù)對一個(gè)M13M13病毒基因組進(jìn)行重測序病毒基因組進(jìn)行重測序。 這項(xiàng)技術(shù)之所以被稱為真正的單分子測序這項(xiàng)技術(shù)之所以被稱為真正的單分子測序, ,是因?yàn)樗且驗(yàn)樗耆邕^了前述完全跨過了前述3 3種高通量測序依賴的基于種高通量測序依賴的基于PCRPCR擴(kuò)增的擴(kuò)增的信號放大過程信號放大過程, ,真正達(dá)到了讀取單個(gè)熒光分子的能力。真正達(dá)到了讀取單個(gè)熒光分子的能力。 斯坦福大學(xué)的科學(xué)家最近利用斯坦福大學(xué)的科學(xué)家最近利用HeliscopeHeliscop

33、e單分子測單分子測序儀序儀, ,用了用了48 00048 000美元的試劑和美元的試劑和4 4個(gè)星期的時(shí)間個(gè)星期的時(shí)間, ,對一名對一名白人男子的基因組進(jìn)行了測序。測序的覆蓋度達(dá)白人男子的基因組進(jìn)行了測序。測序的覆蓋度達(dá)2828倍倍, ,覆蓋了覆蓋了90%90%的人類參考基因組。序列讀長的人類參考基因組。序列讀長24-70 24-70 bpbp, ,平均讀長為平均讀長為32 32 bpbp, ,并鑒定出并鑒定出280280萬個(gè)萬個(gè)SNPSNP位點(diǎn)和位點(diǎn)和752752個(gè)拷貝數(shù)變異。個(gè)拷貝數(shù)變異。3.1 HeliScope3.1 HeliScope單分子測序儀單分子測序儀第36頁/共45頁 Pac

34、ific bioscience Pacific bioscience 在在ScienceScience上報(bào)道了他們的上報(bào)道了他們的基基于于SMARTSMART技術(shù)的單分子測序技術(shù)技術(shù)的單分子測序技術(shù), ,該技術(shù)利用單分子該技術(shù)利用單分子技術(shù)和技術(shù)和DNADNA聚合酶聚合酶, ,在聚合反應(yīng)的同時(shí)就可以讀取測序在聚合反應(yīng)的同時(shí)就可以讀取測序產(chǎn)物產(chǎn)物, ,目前一期的讀取速度為目前一期的讀取速度為3bp / s,3bp / s,但他們聲稱在但他們聲稱在2013 2013 前實(shí)現(xiàn)三分鐘讀完人類基因組。前實(shí)現(xiàn)三分鐘讀完人類基因組。PacificPacific技術(shù)目技術(shù)目前在研究大腸桿菌基因組時(shí)的評價(jià)讀長為

35、前在研究大腸桿菌基因組時(shí)的評價(jià)讀長為586586個(gè)堿基個(gè)堿基, ,有些能達(dá)到有些能達(dá)到28052805堿基堿基, ,新儀器的單個(gè)讀長已達(dá)新儀器的單個(gè)讀長已達(dá)1035110351個(gè)堿基個(gè)堿基, ,而且有望實(shí)現(xiàn)更大的讀長而且有望實(shí)現(xiàn)更大的讀長, ,而且準(zhǔn)確率而且準(zhǔn)確率99.9999%99.9999%。 3.2 3.2 單分子實(shí)時(shí)單分子實(shí)時(shí)DNADNA測序技術(shù)測序技術(shù)第37頁/共45頁 英國牛津納米公司成功研制出了英國牛津納米公司成功研制出了基于納米孔的單分基于納米孔的單分子測序技術(shù)子測序技術(shù), ,該技術(shù)讀取數(shù)據(jù)的速度更快該技術(shù)讀取數(shù)據(jù)的速度更快, ,而且成本會大而且成本會大大降低大降低 。 在該測

36、序技術(shù)平臺中在該測序技術(shù)平臺中,DNA,DNA分子以一次一個(gè)堿分子以一次一個(gè)堿基的速度依次通過納米小孔基的速度依次通過納米小孔, ,利用核酸外切酶的特性來識利用核酸外切酶的特性來識別出不同的別出不同的DNADNA堿基堿基, ,同時(shí)還能檢測出堿基是否被甲基同時(shí)還能檢測出堿基是否被甲基化等相關(guān)的重要信息?；认嚓P(guān)的重要信息。3.3 3.3 納米孔單分子測序技術(shù)納米孔單分子測序技術(shù)第38頁/共45頁 據(jù)據(jù)2010 2010 年年7 7 月月30 30 日日Xiao YanXiao Yan（NanoNano LettLett，July July 3030，20102010）報(bào)道，美國賓夕法尼亞大學(xué)的研究人員開）報(bào)道，美