木薯PHOR1基因的序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)表達(dá)特性

1、    木薯phor1基因的序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)表達(dá)特性    叢漢卿+齊堯堯+朱文麗摘要：為研究木薯中phor1基因如何被逆境信號(hào)調(diào)控，根據(jù)楊樹(shù)2個(gè)phor1同源基因搜索木薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，得到2個(gè)高度同源的木薯phor1基因，即mephor1_1和mephor1_2。序列分析表明，它們都具有e3泛素連接酶家族成員特征：含有u-box和armadillo重復(fù)序列。此外其啟動(dòng)子區(qū)具有乙烯響應(yīng)元件和茉莉酸響應(yīng)元件。以木薯品種華南八號(hào)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為材料，利用qrt-pcr檢測(cè)mephor1_1和mephor1_2基因在乙烯利和茉莉酸甲酯處理后的表達(dá)

2、特性。結(jié)果顯示：在乙烯和茉莉酸甲酯分別處理后的細(xì)胞懸浮液中，2個(gè)phor1基因的表達(dá)變化呈現(xiàn)相似趨勢(shì)，即乙烯處理后，2個(gè)基因的表達(dá)均出現(xiàn)先下降后緩慢上升的趨勢(shì)；而對(duì)茉莉酸信號(hào)則呈現(xiàn)先上升后下降又上升再下降的波動(dòng)性趨勢(shì)，故推測(cè)2個(gè)phor1基因可被乙烯和茉莉酸信號(hào)調(diào)控，并可在后續(xù)的根生長(zhǎng)和淀粉積累等一系列生理生化過(guò)程中發(fā)揮作用。關(guān)鍵詞：木薯；phor1基因；乙烯；茉莉酸；表達(dá)分析：s533.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：a：1002-1302（2016）11-0029-05木薯（manihot esculenta crantz）屬于大戟科（euphorbiaceae）木薯屬（manihot p.miller

3、），原產(chǎn)于熱帶南美洲，是世界三大薯類(lèi)作物之一，是第六大糧食作物，是重要的能源和淀粉作物。木薯的根作為其主要經(jīng)濟(jì)部位，研究其生長(zhǎng)發(fā)育和淀粉積累具有重要意義。amador等在研究馬鈴薯（solanum tuberosum）短日照條件下在上調(diào)表達(dá)的調(diào)控因子中首次獲得了phor1基因，并通過(guò)煙草轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明phor1對(duì)ga信號(hào)途徑具有正調(diào)控作用1。phor1編碼1個(gè)cys-pro-ile motif（cpi）結(jié)構(gòu)域和7個(gè)armadillo（arm）重復(fù)序列的蛋白2。此cpi結(jié)構(gòu)域具有典型的u-box序列特征，u-box結(jié)構(gòu)一般存在于e3泛素連接酶中3，可促進(jìn)特異目標(biāo)蛋白的泛素化4，缺失試驗(yàn)表明，cp

4、i是一種可被ga抑制的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滯留信號(hào)。而arm重復(fù)序列是phor1的核定位信號(hào)，其核定位功能可為cpi所逆轉(zhuǎn)。目前，對(duì)phor1基因的研究已有一定基礎(chǔ)，但在木薯中的表達(dá)特性和基因功能還未被研究。茉莉酸（jasmonic acid，簡(jiǎn)稱ja）和乙烯（ethylene，簡(jiǎn)稱et）是植物逆境響應(yīng)的信號(hào)分子，在涉及植物對(duì)生物性和非生物性逆境脅迫和植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的基因調(diào)控上發(fā)揮著重要作用。ja作為一種逆境脅迫轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，具有誘導(dǎo)植物防御基因的表達(dá)、調(diào)控植物對(duì)機(jī)械傷害、鹽害及紫外線照射等非生物脅迫的反應(yīng)的功能5-6。而et是另外一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，可影響植物多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，對(duì)植物自身來(lái)說(shuō)，乙烯在種

5、子萌發(fā)、開(kāi)花、葉片伸展、根的生長(zhǎng)、果實(shí)成熟及器官衰老等方面發(fā)揮著作用；對(duì)植物與外界環(huán)境的關(guān)系來(lái)說(shuō)，乙烯主要參與植物面對(duì)外界生物與非生物脅迫的反應(yīng)過(guò)程。很多涉及上述相關(guān)過(guò)程的基因序列上都有乙烯響應(yīng)元件7-8。楊樹(shù)中的phor1同源基因被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控芽和根生長(zhǎng)、淀粉積累、木質(zhì)部形成的功能9。根據(jù)楊樹(shù)phor1同源基因ptphor1_1（poptr_0007s03730）和ptphor1_2（poptr_0005s05880）的序列在jgi的木薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù) v6.110中搜索獲得2個(gè)高度同源序列：manes.12g152200和manes.13g071800，分別命名為mephor1_1和meph

6、or1_2。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其具有典型的u-box結(jié)構(gòu)和arm重復(fù)序列，且mephor1_1啟動(dòng)子區(qū)具有1個(gè)乙烯響應(yīng)元件和1個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件，mephor1_2具有2個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件。同時(shí)利用木薯懸浮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)其et和ja甲酯誘導(dǎo)表達(dá)特性分析中也發(fā)現(xiàn)，phor1基因可受et和ja信號(hào)調(diào)控，并呈現(xiàn)不同的表達(dá)趨勢(shì)。本研究旨在通過(guò)序列分析和表達(dá)分析，確定et和ja信號(hào)是否能對(duì)phor1基因表達(dá)造成影響，并初步探索表達(dá)變化特性及其機(jī)制，為進(jìn)一步研究逆境信號(hào)通過(guò)phor1基因在木薯塊根發(fā)育和淀粉積累過(guò)程中所發(fā)揮的作用提供參考。1 材料與方法1.1 材料與試劑木薯（manihot esculenta

7、crantz）品種華南八號(hào)（sc8）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞通過(guò)葉片愈傷組織建立，保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所。axygen總rna小量制備試劑盒（axygen）；primescripttm reverse transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒（takara）；sybr premix ex taqtm （pefect real time）實(shí)時(shí)定量試劑盒（takara）；引物由invitrogen（上海）貿(mào)易有限公司合成。1.2 方法1.2.1 材料處理吸取處于指數(shù)增長(zhǎng)期的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 1 ml 于離心管中并置于搖床25 穩(wěn)定0.5 h，分為3組，其中2組分別以濃度為400 l/

8、l的乙烯利（ethephon）（solarbio）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，簡(jiǎn)稱meja）（sigma-aldrich）處理，另一組不進(jìn)行任何處理作為對(duì)照。選取處理后0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品，微離心后棄上清液氮速凍-80 冰箱保存。此步驟重復(fù)3次，獲得3批生物學(xué)重復(fù)。1.2.2 phor1基因及啟動(dòng)子區(qū)序列分析使用jgi的木薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pz/portal.html#！info？alias=org_mesculenta_er）獲得mephor1_1和mephor1_2的cds序列

9、（coding sequence）和dna序列（genomic sequence）10。用netgene2 v2.4（http：/www.cbs.dtu.dk/services/netgene2/）分析基因結(jié)構(gòu)11-12。用gsds（http：/）分析內(nèi)含子相位13。用tssp（http：/ 1.2.3 phor1蛋白分析使用blast工具對(duì)預(yù)測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，用portparam（http：//protparam/）預(yù)測(cè)其蛋白分子量和等電點(diǎn)16，使用interpro（http：/www.ebi.ac.uk/interpro/）預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域17。利用meme

10、（http：//tools/meme）18和mast（http：//tools/mast）19分析木薯phor1蛋白的基序，基序數(shù)目設(shè)為10，e-values為默認(rèn)的1.0。用tmhmm server在線工具（http：/www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/）進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)20，使用subloc在線工具（http：/1.2.4 序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析鑒于目前只有少數(shù)作物對(duì)phor1進(jìn)行了研究，目前我們只找到了除木薯外的已報(bào)道的6種植物中的phor1基因。來(lái)自木薯的2個(gè)phor1基因mephor1_1和mephor1_

11、2、楊樹(shù)（populus trichocarpa）的phor1基因ptphor1_1（poptr_0007s03730）和ptphor1_2（poptr_0005s05880）9、馬鈴薯（solanum tuberosum）stphor1（aj306423）1、番茄（lycopersicon esculentum）的lephor1（solyc04g071030）25、擬南芥（arabidopsis thaliana）him1/him2/him33、龍眼（dimocarpus longan l.）dlphor126、白羽扇豆（lupinus albus）中具有完整cds的3條phor1同源con

12、tigs（lagi01_34089、lagi01_33328、lagi01_27558）27。使用mega 6對(duì)其氨基酸進(jìn)行序列比對(duì)，并構(gòu)建鄰接（neighbor-joining，n-j）聚類(lèi)進(jìn)化樹(shù)。使用bootstrap方法1 000次重復(fù)對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。1.2.5 phor1誘導(dǎo)表達(dá)的qrt-pcr檢測(cè)提取rna后進(jìn)行cdna反轉(zhuǎn)錄，利用qrt-pcr檢測(cè)木薯phor1基因在懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中受乙烯利和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)表達(dá)情況，所有的qrt-pcr反應(yīng)均來(lái)自同一批反轉(zhuǎn)錄的cdna產(chǎn)物，18s rrna為內(nèi)參。所用phor1基因及18s rrna的引物為primer premier 5.0軟件設(shè)

13、計(jì)（表1）。2 結(jié)果與分析2.1 基因結(jié)構(gòu)分析基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，mephor1_1和mephor1_2基因僅有1個(gè)外顯子，都沒(méi)有內(nèi)含子。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示：mephor1_1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游 857 bp 處，而mephor1_2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游1 282 bp處。順勢(shì)作用元件位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)：mephor1_1基因啟動(dòng)子區(qū)域包含典型啟動(dòng)子調(diào)控元件 caat-box 和 tata-box及多個(gè)光響應(yīng)順式元件、1個(gè)乙烯響應(yīng)元件和1個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件；此外還包含真菌誘導(dǎo)子響應(yīng)元件、myb結(jié)合位點(diǎn)以及參與細(xì)胞周期和胚乳表達(dá)響應(yīng)元件。而mephor1_2除具有典型啟

14、動(dòng)子調(diào)控元件caat-box和 tata-box外，也存在多個(gè)光響應(yīng)順式元件和2個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件，但不具有乙烯響應(yīng)元件；另外還包含厭氧誘導(dǎo)的響應(yīng)元件、真菌誘導(dǎo)子響應(yīng)元件、myb結(jié)合位點(diǎn)以及生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（表2）。2.2 蛋白分析mephor1_1有418個(gè)氨基酸，分子量為46 610.3 u，理論等電點(diǎn)為8.28。mephor1_2有418個(gè)氨基酸，分子量為 46 795.6 u，理論等電點(diǎn)為7.47?？缒^(qū)分析顯示此蛋白可能無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，這2個(gè)蛋白有可能定位在核上。二者具有相同基序。符合e-value<1的基序有6個(gè)，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)mephor1_1和mephor1_2

15、有22個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)，可參考其三維預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)（圖1）。pfp蛋白功能預(yù)測(cè)顯示：mephor1_1和mephor1_2基因最符合gene ontology（go）中的go：0005515條目，具有蛋白結(jié)合功能。2.3 phor1基因進(jìn)化樹(shù)分析從進(jìn)化樹(shù)可以看出，同一科植物的phor1基因基本聚為一類(lèi)，木薯作為大戟科植物，2個(gè)phor1處于一個(gè)單獨(dú)分支上，且在親緣關(guān)系上較為接近楊樹(shù)和龍眼（圖2）；楊樹(shù)與龍眼作為木本植物處于同一分支，且龍眼的dlphor1與楊樹(shù)ptphor1_1的親緣關(guān)系要近于楊樹(shù)自身的ptphor1_2；此外擬南芥的3個(gè)基因也處于同一分支；馬鈴薯和番茄同為茄科植物，處于同一分支；與此親緣

16、關(guān)系較遠(yuǎn)的白羽扇豆位于一個(gè)距離較遠(yuǎn)的獨(dú)立分支上。2.4 茉莉酸甲酯和乙烯誘導(dǎo)木薯phor1表達(dá)水平變化為排除phor1基因本底變化造成的影響，將茉莉酸甲酯和乙烯誘導(dǎo)后的qrt-pcr表達(dá)量值除以相應(yīng)對(duì)照的表達(dá)量值，值1.0為本底表達(dá)水平。最終獲得其在2種處理下的表達(dá)趨勢(shì)，結(jié)果顯示兩者呈現(xiàn)不同趨勢(shì)：mephor1_1在茉莉酸甲酯的響應(yīng)整體呈現(xiàn)波浪狀，處理0.5 h后表達(dá)量提升至1.7左右，又在1 h快速下降至0.7水平，后在4 h時(shí)，逐漸恢復(fù)到初始水平，但又在8 h出現(xiàn)劇烈下降至最低水平。而乙烯信號(hào)對(duì)其的影響呈現(xiàn)先在1 h下降至最低點(diǎn)后又逐漸上升的趨勢(shì)（圖3-a）。茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，mephor

17、1_2的趨勢(shì)與mephor1_1較為類(lèi)似，也呈現(xiàn)波浪狀，但表達(dá)水平有較大差異，處理0.5 h后表達(dá)量提升至2.0以上，又在 1 h 快速下降至初始水平以下，但在4 h時(shí)提升到4.0，后又在8 h出現(xiàn)劇烈下降。而乙烯信號(hào)對(duì)其沒(méi)有非常明顯的影響，趨勢(shì)線較為平直得維持在略低于初始水平的狀態(tài)下（圖3-b）。 3 結(jié)論與討論植物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中研究信號(hào)傳遞和基因響應(yīng)的常用方法。加入外源信號(hào)物質(zhì)刺激后，信號(hào)物質(zhì)可快速、均勻地分布在每個(gè)細(xì)胞周?chē)僮骱?jiǎn)易，為試驗(yàn)結(jié)果的一致性和重復(fù)性提供了保障。本研究選用的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞大小接近、生長(zhǎng)迅速且生長(zhǎng)周期基本一致。本試驗(yàn)中，phor1基因在逆境信號(hào)物質(zhì)施

18、加后0.5 h內(nèi)即作出了響應(yīng)，并且在整個(gè)過(guò)程中表達(dá)量最高可達(dá)初始水平的4倍，表明本試驗(yàn)所選用的材料適用于基因表達(dá)分析研究。如同楊樹(shù)ptphor19，木薯phor1基因也是一類(lèi)較為保守的基因，mephor1_1和mephor1_2兩者具有很高的序列相似性。在蛋白結(jié)構(gòu)上具有和已知的植物phor1基因類(lèi)似的u-box結(jié)構(gòu)和arm重復(fù)序列。進(jìn)化樹(shù)分析中，與楊樹(shù)的ptphor1和龍眼的dlphor1基因具有較近的親緣關(guān)系，可以推斷mephor1是一類(lèi)典型的phor1基因。同時(shí)啟動(dòng)子區(qū)分析發(fā)現(xiàn)mephor1具有乙烯響應(yīng)因子ere及茉莉酸響應(yīng)元件cgtca-motif和tgacg-motif，初步解釋了乙烯

19、和茉莉酸信號(hào)可影響phor1基因的表達(dá)。盡管mephor1_1有1個(gè)乙烯響應(yīng)元件，但乙烯響應(yīng)的變化趨勢(shì)卻是下調(diào)的，可能有其他調(diào)控機(jī)制抑制了乙烯信號(hào)的順勢(shì)調(diào)控，具體原因還須進(jìn)一步探索。mephor1_2沒(méi)有乙烯響應(yīng)元件，其et處理后的變化曲線盡管略低于本底水平1.0，但趨勢(shì)較為平緩，從一個(gè)角度解釋了mephor1_2為何對(duì)乙烯信號(hào)不敏感。此外，mephor1_2在0.5 h和4.0 h對(duì)ja響應(yīng)的表達(dá)量要明顯高于mephor1_1，推測(cè)與其具有2個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件有一定關(guān)系。在乙烯和茉莉酸處理后0.5 h內(nèi)，phor1呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)趨勢(shì)，et導(dǎo)致下調(diào)而ja導(dǎo)致上調(diào)，表明雖同為逆境信號(hào)物質(zhì)，卻對(duì)p

20、hor1具有不同的調(diào)控作用。植物中茉莉酸和乙烯與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的激素的交叉相互作用在整個(gè)生活周期內(nèi)、不同組織器官間、不同類(lèi)型細(xì)胞中一直存在。不同激素信號(hào)的整合共同介導(dǎo)了植物的生長(zhǎng)發(fā)育、對(duì)環(huán)境的反應(yīng)及衰老死亡。此外，2個(gè)phor1基因的啟動(dòng)子區(qū)還有各自獨(dú)有的調(diào)控元件，如生長(zhǎng)素響應(yīng)、myb結(jié)合位點(diǎn)等。故此推測(cè)，2種不同逆境信號(hào)施加后與其他不同激素的綜合作用，產(chǎn)生了迥異的調(diào)控模式，最終造成phor1基因不同的表達(dá)特性。楊樹(shù)中phor1基因受到抑制后，其莖部和根部的淀粉積累出現(xiàn)了上升9，馬鈴薯中，phor1的下調(diào)可以促進(jìn)塊莖的生長(zhǎng)1。phor1具有抑制根和芽生長(zhǎng)的功能，眾所周知，當(dāng)不利環(huán)境來(lái)臨時(shí)，

21、植物開(kāi)始大量合成貯藏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并伴隨著生長(zhǎng)的停滯28。因此，phor1是一種當(dāng)不利環(huán)境來(lái)臨時(shí)植物將碳水化合物從用于生長(zhǎng)轉(zhuǎn)為用于貯藏的調(diào)控機(jī)制的一部分。phor1調(diào)控淀粉代謝的方式可能與ga信號(hào)途徑有關(guān)29。phor1基因可能在根的發(fā)育過(guò)程中起一定的控制作用，楊樹(shù)phor1基因的過(guò)量表達(dá)會(huì)顯著減少生根9。有研究表明，ga會(huì)嚴(yán)重影響生長(zhǎng)素的運(yùn)輸30-32。因此，phor1作為ga信號(hào)的一部分，可能會(huì)干擾生長(zhǎng)素的運(yùn)輸和其感知定位生長(zhǎng)素濃度信息的能力，這對(duì)根的形成至關(guān)重要?？傊?，phor1基因即可受光誘導(dǎo)，又可與ga信號(hào)互相影響，說(shuō)明其是鏈接光信號(hào)途徑和ga途徑的一個(gè)橋梁1。由此推測(cè)：隨著季節(jié)更替，日

22、照時(shí)間發(fā)生變化，這一光信號(hào)將影響到植物phor1基因的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)調(diào)節(jié)ga影響植株芽和根的生長(zhǎng)，并促進(jìn)淀粉積累，以迎接即將到來(lái)的秋冬季節(jié)的低溫不利環(huán)境。木薯作為重要的糧食作物及工業(yè)乙醇和淀粉來(lái)源33-34，根作為其主要經(jīng)濟(jì)部位，其生長(zhǎng)發(fā)育和淀粉的積累具有重要的科研意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，phor1基因作為可以調(diào)控此二者的重要基因，研究逆境信號(hào)如何對(duì)其造成影響并探索相關(guān)機(jī)制，可以進(jìn)一步為木薯產(chǎn)量的提高和質(zhì)量的提升奠定理論基礎(chǔ)。目前我們已知木薯的phor1基因可受到乙烯和茉莉酸信號(hào)影響，并初步確定其表達(dá)特性，但具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑及此蛋白的具體功能，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證和探索。參考文獻(xiàn)：1amador v，m

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