ELISA及相關(guān)免疫分析技術(shù)學習教案

1、會計學1ELISA及相關(guān)免疫分析技術(shù)及相關(guān)免疫分析技術(shù)2021-12-5JSCCL XUBIN第1頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第2頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBINE EE EE EE EA bA bA bA bA bA bA bA bA bA bA bA bA bA bA bA bA gA gA gA gA gA gA g 待 測 抗 原用 抗 體 包 被微 量 滴 定 板 孔加 入 抗 原 溫 育加 入 酶 聯(lián) 抗 體溫 育加 入 底 物 并 觀 察顏 色 變 化 或 熒 光封 閉洗 滌洗 滌雙 抗 體 夾 心 E L IS A 法 檢 測 可 溶

2、 性 抗 原A g = 抗 原 ， A b = 抗 體 ， E = 酶第3頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN固相包被抗原待測抗體酶標記第二抗體底物第4頁/共54頁固相包被抗原待測抗體酶標記特異抗體底物第5頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第6頁/共54頁固相包被抗鏈抗體捕獲的IgM抗體酶標記抗原底物第7頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第8頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第9頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第10頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN 第11頁/共54頁2021-12-5

3、JSCCL XUBIN第12頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第13頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第14頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第15頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN基因型血清型基因長度 表達（前s1-55aa，s-226aa） 突變頻率流行地域前s2聚合酶核心前C區(qū)（G1896A）核心啟動子（1762/1764）Aadw2,ayw132211198451856.5%45%歐美非Badw2,ayw1321511984318350%16%亞洲Cayr,adrq+,adrq-,adw23215119843183

4、50%58%亞洲,澳洲,美國Dayw2,ayw3,ayw4318210883218343%12%地中海,俄美,印度Eayw4321211884218327%7%西非Fayw4,adw2,321511984318316%中南美洲Gadw23248108842195100%中北美洲Hadw43215119843183美洲第16頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第17頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第18頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBINn經(jīng)濟性：試劑在同等質(zhì)量條件下通過大規(guī)模生產(chǎn)或技術(shù)進步降低成本而市場價格比較合理。第19頁/共54頁2021

5、-12-5JSCCL XUBIN第20頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第21頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第22頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第23頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第24頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第25頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN加樣器合格標準水合格標準第26頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第27頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第28頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第29頁/共54頁20

6、21-12-5JSCCL XUBIN第30頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第31頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第32頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN 水浴法 孵箱法 微波法A中央（S） 0.307（0.023） 0.282（0.028） 0.151（0.059） A周圍（S） 0.290（0.038） 0.357（0.047） 0.097（0.038） P 0.05 0.01 0.01第33頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第34頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第35頁/共54頁2021-12-

7、5JSCCL XUBIN第36頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第37頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第38頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBINCV為該試劑的批內(nèi)CV (一般在15-20%間）；2）C.O2s，s為實驗室做室內(nèi)質(zhì)控ROC的s。第39頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第40頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第41頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第42頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第43頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN第44頁/共5

8、4頁2021-12-5JSCCL XUBINHBsAg HBeAg HBcAb-IgG HBcAg-IgM HBeAb HBsAb 臨床意義臨床意義 + + 急性急性HBV感染早期感染早期HBV復制活躍復制活躍 + + + + 急慢性急慢性HBV感染，感染，HBV復制活躍復制活躍 + + + 急慢性急慢性HBV感染，感染，HBV復制中躍復制中躍 + + + + 急慢性急慢性HBV感染，感染，HBV復制低躍復制低躍 異型慢性乙型肝炎異型慢性乙型肝炎 + + + HBV復制停止或極低復制停止或極低 + + 平靜的平靜的HBV攜帶狀態(tài)，攜帶狀態(tài)，HbsAg 極低測不出，極低測不出，HBsAg/抗抗H

9、Bs空白空白期期 + HBV既往感染，未產(chǎn)生抗既往感染，未產(chǎn)生抗-HBs + + + 抗抗HBs出現(xiàn)前期，出現(xiàn)前期，HBV復制低復制低 + + + HBV感染恢復期感染恢復期 + + HBV感染恢復期感染恢復期 + + + 不同亞型再感染不同亞型再感染+ 整合整合 病后或接種疫苗后獲得免疫病后或接種疫苗后獲得免疫第45頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBINHBsAg A. 急、慢性肝炎的診斷。 B. 獻血員和各種血制品的篩選。 C. 急性肝炎最早期的預后指標。 D.流行病學調(diào)查。 注意事項注意事項：一、 HBsAg假陽性 血清分離不佳或肝素抗凝血；二、 HBsAg假陰性 感染早期

10、易形成抗原抗體復合物，這種情況需要檢測抗HBc-IgM及HBV DNA； 多數(shù)商用試劑盒檢測系統(tǒng)采用的為多克隆抗體檢測HBsAg的adr、ayw型，S區(qū)的點突變即可導致臨界測定值或陰性結(jié)果； 由于慢性病毒攜帶者（低水平HBsAg攜帶者）或HBV感染潛伏期， HBsAg濃度低于檢測水平的下限。 第46頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN抗抗-HBs： A. 預后預后：抗HBs經(jīng)常在肝炎癥狀出現(xiàn)后4-6個月出現(xiàn)，一般表示病毒清除，感染開始恢復。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在抗HBs 陽性患者體內(nèi)有5%HBV DNA陽性，慢性肝炎中的一些抗HBs陽性者，肝細胞中可檢出HBsAg、HBeAg、HB

11、V DNA，因此盡管自然感染者抗HBs陽轉(zhuǎn)后，大多數(shù)預后良好，但也不能過于樂觀，應定期復查。 B. 流行病學調(diào)查。流行病學調(diào)查。 C. 疫苗接種對象的篩選和效果觀察疫苗接種對象的篩選和效果觀察。接種疫苗后，抗HBs濃度超過10 IU/L，表明其具有保護性。加強免疫后4-8周，大于100 IU/L，即便以后有所降低，其免疫力能維持10年以上。 注意事項：注意事項： A 懷疑假陽性結(jié)果時要進行中和試驗。 B 抗HBs經(jīng)常在HBsAg消失幾周至幾月后方呈陽性（窗期），極少數(shù)在HBsAg消失后即為陽性，同時可檢出抗同時可檢出抗HBs及及HBsAg見于以下幾種情形見于以下幾種情形：前后或同時感染兩種亞型

12、HBV，抗HBs及HBsAg同時檢出通常要持續(xù)很久，且濃度均很高； 抗HBs假陽性；編碼HBsAg的基因變異使得HBsAg抗原性改變，原型抗HBs不能將其清除。第47頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBINHBeAg： A. 評價血清傳染性：慢性HBsAg攜帶者中，HBeAg及HBV-DNA檢測可以用來評估其傳染危險性，90% HBeAg陽性HBsAg攜帶者可以傳染給她們的新生兒，而HBeAg陰性或抗HBe陽性的孕婦中只有10%會傳染給嬰兒。 B. 預后：急性期HBeAg的消失通常伴隨ALT的降低，預示著疾病的好轉(zhuǎn)；HBeAg持續(xù)陽性超過12周，提示HBV感染趨向慢性；HBeAg陽

13、性的無癥狀者較少。 注意事項：注意事項： （1）假陰性：前C區(qū)基因變異導致不能生成和分泌HBeAg，血清中HBeAg陰性，但這種突變并不影響乙肝病毒的復制，仍可形成完整的病毒顆粒，該種情況下盡管檢測不到HBeAg，慢性HBV感染炎癥反應也相當強。HOOK 效應 （2）假陽性： 包被抗體不純（含有抗C）第48頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN電化學發(fā)光HBeAg檢測的高線性第49頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN抗抗-HBe： A、反映血清感染性：通常情況下HBsAg（+）、抗HBe（+）病例的傳染性較低； B、監(jiān)視急性和慢性HBV感染：血清HBeAg消失、抗

14、HBe出現(xiàn)對監(jiān)視急慢性HBV感染很有診斷價值，特別是抗HBe出現(xiàn)更有預見價值，在干擾素治療中出現(xiàn)表明疾病狀況的改善； C、預后：抗HBe陽轉(zhuǎn)出現(xiàn)在HBeAg陰轉(zhuǎn)后早期（2周內(nèi)），可能預示急性肝炎恢復順利；如出現(xiàn)在晚期（HBeAg陰轉(zhuǎn)后6周以上）或不出現(xiàn)抗HBe，可能發(fā)展為慢性肝炎。 注意事項：注意事項： 抗HBe不宜作流行病學調(diào)查，因為其陽性率遠遠低于抗HBc，且實際上抗HBe陽性者抗HBc 往往也呈陽性。 HBeAg和抗HBe測定一般適用于HBsAg陽性者，幾乎所有急性感染者均出現(xiàn)HBeAg或抗HBe陽性，偶爾兩者同時陽性，只有少數(shù)HBsAg攜帶者（通常其濃度較低）， HBeAg和抗HBe均

15、陰性。 第50頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN乙肝抗原/抗體檢測的血清轉(zhuǎn)型(Seroconversion)第51頁/共54頁2021-12-5JSCCL XUBIN抗抗-HBc： A、診斷急慢性HBV感染：急性HBV感染時抗HBc的滴度平均為1:500-1:1000，健康攜帶者的滴度一般為1:10，慢性HBV感染者一般為1:100，HBsAg(-)若抗HBc滴度很高提示為慢性HBV感染（隱匿性感染）。 B、調(diào)查特定人群HBV感染的流行率或危險性；該指標在感染后可持續(xù)存在幾年至幾十年，因此很適合調(diào)查感染的流行率性。 C、驗證抗HBs及HBsAg陽性結(jié)果。 注意事項：注意事項：

16、A、 臨界陽性一般是假陽性，是由于臨界陽性一般是假陽性，是由于IgM型引起的交叉反應。型引起的交叉反應。B、 抗抗HBc陰性而陰性而HBsAg陽性一般發(fā)生在免疫缺陷病例，這時存在陽性一般發(fā)生在免疫缺陷病例，這時存在HBV復制的其復制的其他標志如他標志如 HBeAg及高滴度的及高滴度的HBV DNA。C、 對抗對抗HBc單獨陽性，排除假陽性后，美國單獨陽性，排除假陽性后，美國CDC有以下解釋：有以下解釋： 急性感染后的恢復早期（窗期）在急性感染后的恢復早期（窗期）在HBV急性感染消退時，急性感染消退時，HBsAg減少甚至消失，減少甚至消失，抗抗HBs尚未出現(xiàn)，抗尚未出現(xiàn)，抗HBc是唯一能檢出的特異性指標，此時抗是唯一能檢出的特異性指標，此時抗HBc IgM也為陽性。也為陽性。 被動轉(zhuǎn)移：被動轉(zhuǎn)移：