熱力滅菌工藝的微生物學(xué)驗證

1、熱力滅菌工藝的微生物學(xué)驗證注射劑無菌保證工藝研究及評價的原則要求注射劑無菌保證工藝是指為實現(xiàn)規(guī)定的無菌保證水平所采取的經(jīng)過充分驗證后的滅菌（無菌）生產(chǎn)工藝。目前，注射劑的無菌保證工藝主要有cmcm兩種:1 終端滅菌工藝：在控制微生物污染量的基礎(chǔ)上，在藥品灌封后，通過濕熱滅菌方式除菌。一般來說，本方法成本低，無菌保證水平高，適宜 于大容量注射劑和小容量注射劑的滅菌。uy2無菌生產(chǎn)工藝：在無菌系統(tǒng)環(huán)境下，通過除菌過濾法或無菌操作法,以防止污染為目的，消除導(dǎo)致污染的各種可能性來保證無菌水平。一般來 說，由于本方法對環(huán)境系統(tǒng)的要求高，且影響無菌操作的因素多而使得無保證水平比終端滅菌工藝低。無菌生產(chǎn)工藝

2、一般適宜于粉針劑，亦可適 宜于臨床需要但不能進行終端滅菌的小容量注射劑。由此，終端滅菌工藝和無菌生產(chǎn)工藝具有不同的系統(tǒng)要求、不同的除方法和不同的無菌保證結(jié)果。評價無菌保證工藝是否有效曾一度主要通過對終產(chǎn)品抽樣進行無菌檢驗來判斷；由于微生物在產(chǎn)品中的分布是不均勻的，且抽檢樣品的數(shù)量有 限，故抽檢的結(jié)果不能真實代表整批產(chǎn)品的無菌狀態(tài)。國際上更為注重?zé)o保證工藝的設(shè)計是否合理、所用的設(shè)備與工藝是否經(jīng)過充分的驗證，在 此基礎(chǔ)上，切實按照驗證后的工藝進行生產(chǎn)，這樣才能保證滅菌（無菌） 工藝的可靠性。在業(yè)界，常用"無菌保證水平” （sterility assurance level,sal）概念

3、來評價滅菌（無菌）工藝的效果，sal的定義為產(chǎn)品經(jīng)滅菌/除菌后微生物 殘存的概率。該值越小，表明產(chǎn)品中微生物存在的概率越小。為了保證注 射劑的無菌安全性，國際上一致規(guī)定，采用濕熱滅菌法的sal不得大于106,即滅菌后微生物存活的概率不得大于百萬分之一；而采用無菌生產(chǎn)工 藝的產(chǎn)品，其sal 般只能達到10二故僅限于臨床必需注射給藥而確實無法耐受終端滅菌的產(chǎn)品。無菌生產(chǎn)工藝只適用于粉針劑或部分小容量注 射劑。、注射劑劑型選擇的原則從無菌保證水平的角度考慮，注射劑劑型選擇的一般原則如下:1.首先要考慮被選劑型可采用的滅菌工藝的無菌保證水平的高低。原 則上首選劑型應(yīng)能采用終端滅菌工藝(f0>8)

4、,以保證sal<10 6o2.對于有充分的依據(jù)證明不適宜采用終端滅菌工藝(f0>8)且臨床必需注射給藥的品種，可考慮選擇采用無菌生產(chǎn)工藝的劑型。通常無菌生產(chǎn) 工藝僅限于粉針劑或部分小容量注射劑o二、無菌保證工藝的技術(shù)要求1.大容量注射劑(1) 應(yīng)采取終端滅菌工藝，建議首選過度殺滅法(f0212),如產(chǎn)品不能耐受過度殺滅的條件，可考慮采用殘存概率法(8<f0<12),但均應(yīng)保證 產(chǎn)品滅菌后的sal不大于io %釆用其它f0值小于8的終端滅菌條件的工藝，原則上不予認可。(2) 如產(chǎn)品不能耐受終端滅菌工藝條件，應(yīng)盡量優(yōu)化處方工藝，以改善制劑的耐熱性。如確實無法耐受，則應(yīng)考慮選

5、擇其他劑型，而非大容 量注射劑。(3) 工藝驗證：應(yīng)進行規(guī)范的滅菌工藝驗證，部分驗證工作可結(jié)合生產(chǎn)線驗證一并進行。主要包括以下試驗: 滅菌前微生物污染水平測定，包括滅菌前產(chǎn)品中的污染菌及其耐熱性d值的測定； 熱穿透試驗; 微生物挑戰(zhàn)試驗：所用生物指示劑的耐熱性及數(shù)量應(yīng)對滅菌工藝構(gòu)成必要的挑戰(zhàn)，生物指示劑的耐熱性應(yīng)大于產(chǎn)品中常見污染菌的耐熱性。2.粉針劑采用無菌生產(chǎn)工藝的粉針劑，應(yīng)能保證sal不大于10=這主要依賴于無菌生產(chǎn)工藝是否嚴格按照藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（gmp）的要求進行 生產(chǎn)與驗證。（1）凍干粉針劑凍干粉針劑無菌生產(chǎn)工藝的驗證中的設(shè)備驗證、環(huán)境監(jiān)測是凍干粉針劑生產(chǎn)線gmp要求的常規(guī)內(nèi)容

6、；培養(yǎng)基灌裝驗證是對設(shè)備、環(huán)境以及人 員操作的一種系統(tǒng)驗證，是判斷無菌保證水平的關(guān)鍵手段。常規(guī)的工藝驗證試驗包括: 培養(yǎng)基模擬灌裝驗證試驗：最少在線灌裝三批，每批的批量詳見附表，每瓶產(chǎn)品均應(yīng)進行無菌檢查，判斷該試驗是否合格的標準見附表。除菌過濾系統(tǒng)適應(yīng)性驗證試驗：包括過濾系統(tǒng)相容性測試、過濾前后濾膜完整性測試、濾膜的微生物截留量測試。（2）無菌分裝粉針劑無菌分裝粉針劑的質(zhì)量保證主要依賴于無菌生產(chǎn)線的基本條件和對生產(chǎn)工藝各環(huán)節(jié)嚴格的質(zhì)量控制。生產(chǎn)工藝的控制和驗證要求對不同的無 分裝產(chǎn)品是一致的。嚴格執(zhí)行g(shù)mp的有關(guān)要求，是無菌粉針劑生產(chǎn)的重 要質(zhì)量保證。工藝驗證工作主要為培養(yǎng)基灌裝驗證試驗。灌裝

7、的批數(shù)、批量與合格標準見附表。對于同時申報無菌分裝用原料藥的產(chǎn)品，需關(guān)注原料藥精制、干燥.包裝應(yīng)在百級環(huán)境下進行。如涉及無菌分裝用輔料，技術(shù)要求同前。3小容量注射劑（1）應(yīng)首選終端滅菌工藝，相關(guān)技術(shù)要求同大容量注射劑。（2）如有充分的依據(jù)證明不能采用終端滅菌工藝的品種，且為臨床必需注射給藥的品種，可考慮采用無菌生產(chǎn)工藝，相關(guān)技術(shù)要求同凍干粉針 劑。(3)對于過濾除菌工藝同時采用了流通蒸汽輔助滅菌的品種，建議修改為終端滅菌工藝，技術(shù)要求同大容量注射劑；對確實無法采用終端滅工藝的品種，應(yīng)修改為無菌生產(chǎn)工藝，技術(shù)要求同凍干粉針劑。對于采用無菌生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的小容量注射劑，生產(chǎn)線的驗證應(yīng)結(jié)合無生產(chǎn)工藝進

8、行。三、其它相關(guān)要求1在劑型選擇的研究中，為判斷滅菌工藝對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，應(yīng)進行滅菌前后產(chǎn)品質(zhì)量對比的研究，且應(yīng)注意考察條件和方法的合理性，考察項目需全面，相關(guān)分析方法需驗證。同時研究用樣品應(yīng)具有代表性。2 容器的密封性對于無菌產(chǎn)品在有效期內(nèi)保持無菌性能具有重要作用，故非常有必要推動此項工作，建議申報單位在工藝研究.包裝材料的 選擇以及穩(wěn)定性研究中，加強容器密封性的考察。、專業(yè)名詞1 滅菌工藝:是指通過適當?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)手段，將一定數(shù)量的活性微生物完全殺滅, 并且使其生命活動不可逆轉(zhuǎn)的過程。目前在制藥工業(yè)中，滅菌就是使一批 產(chǎn)品中的非無菌品 符合一定的概率要求(不超過百萬分之一)。2生物指示劑簡

9、稱為bi：是對特定滅菌工藝具有一定耐受性并且能夠定量測定滅菌效力的微生物制劑。3 帶菌量:原材料、半成品及成品中所有微生物含量的總和。這里專指滅菌前半成品中的微生物含量。4 無菌保證值（sal）：批無菌品中非無菌品概率的負對數(shù)，通常規(guī)定為大于等于6。即每批產(chǎn)品中非無菌產(chǎn)品的概率應(yīng)小于百萬分之一（w106）。sal = -lg（微生物存活概率）在一定溫度下將微生物數(shù)量殺滅90%或下降一個對數(shù)單位所需要的時 間。6z值：滅菌溫度系數(shù)即指使微生物d值改變（增加或減少）一個對數(shù)單位時，溫度應(yīng)變化（降 低或升高）的度數(shù)。是耐熱曲線或熱致死時間曲線斜率的負倒數(shù),7.ft： t°c滅菌時間指滅菌程

10、序賦予被滅菌品在t°c下的等效滅菌時間。8.f0：標準滅菌時間% £3將121 °c作為標準滅菌溫度，當z設(shè)定為10°c時，滅菌程序賦予被滅品121°c下的等效滅菌時間。二.熱力學(xué)滅菌工藝的基本原理（一）、熱對微生物細胞的效應(yīng)熱力學(xué)滅菌是使用最普遍并且研究最為徹底的滅菌方式。當溫度超過細胞的生理活動所需的溫度范圍時，細胞代謝就會減緩，并最終導(dǎo)致停止生長及繁殖。一旦溫度超過上限，微生物細胞中主要的蛋白質(zhì)、酶及核酸便會被永久性破壞，細胞膜被融解，從而導(dǎo)致細胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的死亡。不具備真正核膜結(jié)構(gòu)的原核細胞（如細菌和藍綠藻）最為耐熱。一般說來,微生物

11、的耐熱性可按下列順序排列(耐熱性從高到低):細菌芽胞酵母孔 及霉菌>革蘭陽性細菌革蘭陰性細菌病毒。具備核膜結(jié)構(gòu)的真核微生物, 在60 80°c下就可被迅速殺滅。絕大多數(shù)細菌的營養(yǎng)細胞在45°c以上就ed不能生長，80 100°c下就可被迅速殺滅，但是，某些嗜熱細菌甚至可在 80°c以上的高溫中生存。多數(shù)病毒是熱敏性的。cry需氧菌中的芽胞桿菌屬(bacillus)和厭氧菌中的梭狀芽胞桿菌屬(clostridium ),也具有較強的耐熱性。這些細菌的細胞能產(chǎn)生內(nèi)源性芽胞或胞間休眠休，它們一旦成熟，便會對熱、干燥及有害化學(xué)物質(zhì)等有較強 的抗性。要想使這

12、些芽胞在一分鐘內(nèi)死亡90%,則必須使干熱溫度在100-170°c之間或濕熱溫度在80-129°c之間才能達到這一目的。在這樣的溫度范圍內(nèi)，對芽胞的殺滅效果要相差約io?；騣o55倍。細菌芽胞的耐熱性與很多因素相關(guān)，芽胞形成時，細菌停止生化反應(yīng),并將遺傳物質(zhì)包于芽胞內(nèi)。隨之進行一系列生物物理變化:細胞質(zhì)大量脫水 并體積減小，然后在縮小的原生質(zhì)體周圍形成一層厚殼。此過程中形成了 一種名為卩比旋二竣酸或dpa(毗呢一 2,6 二竣酸)的特殊化學(xué)物質(zhì)。芽胞 形成階段，毗噪二竣酸鈣與dna以及細胞內(nèi)的酶形成復(fù)合物，以保護處 于惡劣環(huán)境中的芽胞。芽胞可以在休眠狀態(tài)下存活多年，一旦條件利

13、于萌 發(fā)，便可在幾分鐘內(nèi)恢復(fù)到生長狀態(tài)。(二) 、影響滅菌效果的因素1 物理/化學(xué)條件在細菌芽胞形成期，環(huán)境因子會影響其耐熱性。例如，在較高溫度下生 長，并且有二價陽離子(如ca 2 fe2+> mg2 mn")存在時，可增強芽胞的耐熱性，當ph值超出6.0 - 8.0的范圍時，或在芽胞形成環(huán)境中存在高濃度的鹽水或磷酸鹽，均會降低芽胞的耐熱性。成熟芽胞的耐熱性亦與環(huán)境條件相關(guān)，如溶液濃度.水活度，ph值或在環(huán)境中存在對芽胞造成物理性損傷或抑制其萌發(fā)的化學(xué)類物質(zhì)，均會影響芽胞的耐熱性。如果芽胞是包裹在晶體或有機物內(nèi)，其耐熱性通常明顯高于非包裹性芽胞。2 濕度水在熱力殺滅細菌芽胞時

14、起著重要作用。濕熱和干熱滅菌均與水相關(guān),當濕度達到飽和時相對濕度(rh)為100%,所進行的熱滅菌方式稱為濕熱滅菌；在其他相對濕度下進行的滅菌都稱為干熱滅菌。現(xiàn)已知道，在90cmcm一 125°c之間，當相對濕度在20% 50%時，細菌芽胞表現(xiàn)出最大的耐熱性，而當相對濕度超出這一范圍時，芽胞的耐熱性將會迅速下降。3 微生物的熱致死特性通過一條半對數(shù)關(guān)系直線最能說明微生物的熱致死性，直線的斜率隨著 溫度升高而增大。這就是說，在特定溫度下，任一時間點的芽胞死亡特性 僅與這個時間點的芽胞濃度相關(guān)。這種一級致死特性是原核細胞獨有的現(xiàn) 象。(三) 、熱力學(xué)滅菌工藝原理簡介1 濕熱滅菌對于適宜采

15、濕熱滅菌方式的產(chǎn)品或物品濕熱滅菌是一種十分經(jīng)濟有效 的方法。通常情況下，濕熱滅菌是指采用一定壓力下的蒸氣進行滅菌，也 采用過熱水噴淋或浸沒。水由液態(tài)變成氣態(tài)時，會吸收大量的熱能 (540cavg),氣態(tài)冷凝成液態(tài)時，會釋放相等的能量(即汽化熱)。蒸氣接觸 到溫度較低的物體就會釋放潛熱而凝結(jié)成水，直到此物體的溫度與蒸氣溫度相等?，F(xiàn)已明確，濕熱滅菌的效應(yīng)是導(dǎo)致細胞內(nèi)的關(guān)鍵性蛋白質(zhì)和酶發(fā)生熱變性或凝固。濕度對該破壞性過程起促進作用，這就是濕熱滅菌較干熱滅需要較低溫度的原因。2 干熱滅菌干熱滅菌是指在非飽和濕度下進行的熱力學(xué)滅菌。干熱滅菌時的相對濕 度范圍可從99.9%至1%以下。干熱滅菌用加熱介質(zhì)就

16、是一定濕度條件下 的空氣，通過強制對流而運動。由于熱空氣會帶走水分，被滅菌物品v包括 芽胞）也會逐漸失水，從而使微生物的滅菌率也發(fā)生相應(yīng)的變化。ctu干熱滅菌與濕熱滅菌的動力學(xué)特征相似，但反應(yīng)機制卻有所不同。干熱滅菌是使微生物氧化而不是蛋白質(zhì)變性，這就是干熱滅菌之所以要求相si對較高溫度的原因。在制藥工業(yè)中，干熱滅菌被廣泛用于不耐受高壓蒸氣的熱穩(wěn)定性物品的滅菌。常用干熱進行滅菌物品有：甘油、油類.凡士林、石蠟以及一些 粉狀藥品，如滑石粉、磺胺類藥物以及玻璃容器和不銹鋼設(shè)備等。3 干熱去熱原革蘭陰性細菌細胞壁中的脂多糖對人有毒性。只有當細胞破裂或溶解 時，這種毒素才釋放出來，故稱之為內(nèi)毒素。由于

17、低劑量內(nèi)毒素注入人體 后便會導(dǎo)致發(fā)熱反應(yīng)，故而也稱之為熱原。任何旨在去除產(chǎn)品中所含的脂 多糖的工藝過程均稱為去熱原工藝。干熱是去熱原最為有效的方法之一。去熱原要求的溫度很高，如170-250°c,甚至更高。在170°c下去熱原速度很慢，需約30分鐘方能使純內(nèi)毒素下降1個對數(shù)單位，而在250°c下達到同樣效果則僅需9秒。對干熱去熱原工藝進行驗證時，通常直接向待去熱原物品中加人已知最的內(nèi)毒 素。然后證明該工藝能使標準內(nèi)毒素至少下降3個對數(shù)單位。（四）、無菌的影響因素?zé)o菌是一個概率函數(shù)，它的影響因素可用下式表示：pnsu=n（） dr其中，pnsu指非無菌品概率；no指

18、滅菌前產(chǎn)品的污染水平；dr指滅&時的殺滅水平。最終產(chǎn)品的無菌質(zhì)量取決于兩個因素:滅菌前的含菌量控制及滅菌工藝的殺滅效果。（五）、熱力學(xué)滅菌的動力學(xué)原理根據(jù)質(zhì)量作用定律，在恒定溫度及保持其他條件不變的情況下，單位時間內(nèi)被殺滅的微生物數(shù)正比于to時原有的數(shù)目，即dn/dt=k（no-nk） 式中，no為t=0時，存活的微生物數(shù)；nk為t時被殺滅的微生物數(shù)；n 為t時存活的微生物數(shù)。將上式積分得到:ignt =lgn0-(k/2.303)t熱滅菌方式下，微生物的死亡是呈幾何級數(shù)變化的，在半對數(shù)圖紙上作圖，可以得到一條相對比較準確的直線。數(shù)與滅菌時間的關(guān)系1.d值(對數(shù)下降值)d值是指在特定滅

19、菌條件下，使微生物數(shù)量下降一個對數(shù)單位或減少90%所需的時間。它是分析滅菌工藝效果的重要生物學(xué)參數(shù)。并且其數(shù)值可通過殘存曲線法或陰性分數(shù)法加以確定。lgn0-lgnt=lgn()/ nt=t(k / 2.303)=100 = 1，所以d=t=2.303 / k.即,d是直線斜率的負倒數(shù)。d值越大，該溫度下微生物的耐熱性就越強，在滅菌中就越難殺滅。tf21p下的暴熱時間(mm)殘存砲于數(shù)的對數(shù)值對某一種微生物而言，在其他條件保持不變的情況下，d值隨滅菌溫度的變化而變化。滅菌溫度升高時，直線方程的斜率變大，即使微生物殺滅90%所需的時間就短。圖37 d值與滅菌溫度關(guān)系在121°c下的d值

20、在153min之間。不同溫度下，不同的微生物在不同的環(huán)境條件下具有各不相同的d值。微生物名稱溫度/c介質(zhì)d值/min微生物名稱溫度/ °c介質(zhì)d值/min嗜熱脂肪桿菌105葡萄糖87.8嗜熱脂肪桿菌121注射用水3.0嗜熱脂肪桿菌110葡萄糖32.0梭狀芽抱桿菌105葡萄糖13嗜熱脂肪桿菌115葡萄糖11.7梭狀芽抱桿菌105注射用水13.7嗜熱脂肪桿菌121葡萄糖2.4梭狀芽抱桿菌105注射用水2.1嗜熱脂肪桿菌121葡萄糖乳酸林格液2.1不同滅菌溫度下的d值表32.d值測定法殘存曲線法該法至少需要測試兩個樣品，分別在設(shè)定溫度下（如121°c）暴熱不同時間。測定每個熱處理

21、樣品及未經(jīng)熱處理的對照樣品中微生物含量。可采用平皿計數(shù)法或經(jīng)薄膜過濾并置于適當?shù)呐囵B(yǎng)基表面培養(yǎng)。培養(yǎng)終了時，計數(shù)每個樣品中的殘存微生物（ns），再將實驗數(shù)據(jù)的平均值取常用對數(shù)（仗）， 并對相應(yīng)的曝?zé)釙r間u（以分鐘為單位）作圖，可得到存活曲線。在殘存曲線上，以一個對數(shù)單位的間隔點分別作與x軸和y軸相平行的直線，就可估測出d值；或是用下式計算:d12rc=u/（lgn0-lgns）o設(shè)在d值測定中，曝?zé)?min, lgn0為5, igns為2,則d121°c=5 / (52) = l7min。d值為存活曲線斜率的負倒數(shù)（一1/k）o因此，d值可在存活曲線的直線段，用最小二次方線性回歸分析

22、法求得5?廠-匕“式中，口為曝?zé)釙r間（min）： y為曝?zé)釛l件下存活菌落數(shù)的平均值;n指實驗組數(shù)。*試驗所用儀器應(yīng)能保持恒溫并迅速升溫，如生物指示劑耐熱性測定儀或毛細管一油浴測定法。陰性分數(shù)法(不生長分數(shù)法)一種稱最可能數(shù)測定法(most probable number method),僅需一次加熱就可估算出d值。將一組樣品(至少10個樣本)置于設(shè)定滅菌溫度下,加熱到設(shè)定時間后，取出并分別作無菌檢查。該方法檢測靈敏度高于平板nito計數(shù)法。假設(shè)條件是微生物存活數(shù)從n。到滅菌終點始終與曝?zé)釙r間呈線性關(guān)系(對數(shù)規(guī)則)。在溫度t下，dt=u /lg1()no-lg2.3o31glo(n / q),式

23、中n樣品總數(shù)，q曝?zé)崽幚砗蟮臒o菌樣品數(shù)。另一種方法實驗時每組至少需要10個樣品，將其置于預(yù)定溫度下，設(shè)置 不同的曝?zé)釙r間，但曝?zé)岬臅r間間隔相同，熱處理后，將樣品取出，放人 無菌液體培養(yǎng)基中，于適宜溫度下培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束時，記錄每組樣品中沒 有微生物生長的樣品數(shù)。通過陰性分數(shù)法估算d值【每組中無微生物生長樣品數(shù)e (f) /每組樣品數(shù)(n)伽121 r下的暴熱時間(血)3579111315170/100/101/103/105/107/1c10/1010/10f0i35710選擇全部生長組(0/10)中暴熱時間最長者到全部不生長組(10/10)中暴熱時間最短者之間的的數(shù)據(jù)計算d值。從表中可知，本次

24、試驗中的兩個時.5111間分別是5分鐘和15分鐘。芽胞完全殺滅(殘存芽胞數(shù)小于1)時間(t)可用下式計t=tk-d/2-(d/10xef)，其中，tk指陰性分數(shù)范圍的下限(全部不生 長微生物所需最短時間)，d指暴熱時間間隔。由表121數(shù)據(jù)計算，得到：t=15-2/2-(2/10 x 26) = 8.8分鐘然后，按下式計算d值：d=t/ (lg10no十0.2507),假設(shè)n0=105,則d=8.8/ (5+0.2507)=1.7 分鐘3.z值滅菌溫度系數(shù)z值系指使某一種微生物的d值變化一個對數(shù)單位或90%時，所需要的溫度變化值，它是制藥業(yè)滅菌工藝設(shè)計及過程監(jiān)控中的一個常用參數(shù)。在濕熱滅菌條件下

25、，實驗測得細菌芽胞的z值在8-12ec之間，但計算滅菌率 時，z通常取10°c；而在干熱滅菌條件下，z通常取20°c。分別測定同一種微生物在不同溫度下(其他實驗條件相同)的d值，以log10d與對應(yīng)溫度作圖，就可以得到一條直線。此直線斜率的負倒數(shù)即為溫度系數(shù)值，它反映了微生物的致死性隨溫度變化的特性。z值也可用 下式計算:z= (t2t|)/logio (d2/d)其中,di指溫度為ti時的d值，d2指溫度為t2時的d值。不同的微生物抱子，在不同的溶液中有各不相同的z值。同種抱子的z值 在不同溶液中亦有差異。嗜熱脂肪桿菌在不同溶液中的z值。10.38.4溶液葡萄糖水溶液注射

26、用水葡萄糖乳酸林格氏液ph7磷酸鹽緩沖液7.6平均在沒有特定要求時，z值通常都取10,以簡化計算。z值被用于定量地描述抱子對滅菌溫度變化的敏感程度，z值越大，抱子對溫度變化的敏感性越弱，此時，企圖通過升高滅菌溫度的方式來加速殺滅微生物的收效hjz值與滅mfllt的艾系如果z = 10°c,貝!j1100c下的d值為1899min。z=7°c時，直線的斜率增大，此時d值升到57. 67mino當z=12°c時，情況正相反，d值降至 1238min。當滅菌溫度上升時，這3種微就不明顯。滅菌溫度/°cz=7°cz = 10°cz = 12&

27、#176;cd / mimigdd / mimigdd / mimigd105300.002.47760.001.77832.611.51311057. 691.76118.991.27812.401.09311510.971.0335.970.7764.750.6761202.080.3181.890.2761.820.2601211.500.1761.500.1761.500.176z值與滅菌溫度關(guān)系圖生物抱子相應(yīng)d值變化幅度隨z值的增大而減少的趨勢是顯而易見的。4. ft 值一t(°c)滅菌時間ft值指t(°c)滅菌值，系指一個給定z值下，滅菌程序在溫度t(°

28、;c)下的等效滅菌時間。ft=dtxalgn中，dt為在t(°c)下微生物 的d值；algn為t(°c)下滅菌程序使微生物數(shù)下降的對數(shù)單位數(shù)。當algn=1時ft=dt，當藥液滅菌前微生物總數(shù)為no時，則在t(°c)將其全部殺滅至10°所需的時間為ft=dtxlgn0o因此可以把ft理解為t(°c)滅菌值, 即滅菌程序賦予被滅菌品在t(°c)下的滅菌時間。由于d值隨滅菌溫度的變化而變化，所以不同溫度下達到相同滅菌效果時，ft值將隨d值變化而變化。滅菌溫度高時，所需的t(°c)滅菌時間 就短；滅菌溫度較低時，則所需的t(

29、76;c)滅菌時間就長。5. fo值標準滅菌時間系滅菌過程賦予一個產(chǎn)品121°c下的等效滅菌時間(z = 10°c作為參照標準)。對于干熱滅菌而言，標準參照溫度為170°c滅菌值記作fh。6 滅菌率l指在某一溫度t(°c)下滅菌lmin所獲得的標準滅菌時間。l沒有單位。如果己知(實驗條件下)某微生物的z值，那么滅菌率:l=d/d121c =10(仆冬匚指各個滅菌時段的溫度，標準參照溫度(12fc),常取z=10°cof0=d|2irxalgn, ft=dtxalgn,達到同樣滅菌效果時，algn等值，所以 f（）/ ft=d2i，c / dtz

30、=10°c時不同溫度下的滅菌率和121°c下滅菌lmin時所相當?shù)膖(°c)滅菌時間滅菌溫度ex滅菌率l=f0/ft = d121c / dt1221.261200.7941180.5011160.3161140.1991120.126116°c下滅菌lmin對芽抱殺滅效果只有標準滅菌狀態(tài)下的32%； 110°c下1 min,僅為標準滅菌狀態(tài)下的7.9%； 121°c下滅菌lmin相當于110°c下滅菌12. 6min，112°c 下滅菌7 943min； 114°c 下滅菌5 012mino 7.滅菌值

31、（f值）計算實踐中，可用滅菌率計算ft值（或滅菌程序的滅菌值）。ft=（10 （t°-tn）/z dt,也可根據(jù)梯形規(guī)則，將整個滅菌過程（包括升溫、保溫和冷卻階段）的滅菌 率累加，從而估算出某滅菌程序在標準溫度下的等效滅菌時間：ft=at（l1/2+l2+l3+.+ln_1+ln/2） , at指測量溫度的時間間隔。每兩次測量溫度的時間間隔必須相同。在初始及結(jié)束時間段的滅菌率非常小，可將公式簡化為 sfrr=atlo 由 fy=(lgnolgnt)dt，ft/ dt =lgn°lgny,則 lgny =lgn0-ft/dto根據(jù)滅菌設(shè)備內(nèi)溫度監(jiān)控系統(tǒng)所測得的物理參數(shù)，可利用

32、該公式來估測某滅菌程序?qū)ξ⑸锏臍缧Ч４藭r，dt表示某實際微 生物（待滅菌物品中的污染菌）或假設(shè)的微生物（生物指示劑）在t°c下的d 值。例如，假設(shè)f。為8分鐘，耐熱芽胞的dt分=05分鐘，數(shù)量為10訂由 公式可以得出在滅菌結(jié)束時，芽胞的殘存數(shù)量（pusn）為10川。lgnr=68/05=10,在整個滅菌過程中，芽胞數(shù)量的對數(shù)下降:slr=lgno-lgnt=ft / dt =6(10) =8/0.5=16。一、定義生物指示劑生物指示劑，簡稱為bi,是對特定滅菌工藝具有一定耐受性并且能夠定量測定滅菌效力的微生物制劑，適用于制備生物指示劑的微生物多為芽胞類細菌，這是因為，除輻射滅菌

33、外，芽胞類細菌比常規(guī)的生長態(tài)微生物cm對滅菌工藝具有更強的耐受性。生物指示劑既可用來測定一個給定的滅工藝條件的滅菌效果，也可判別它是否符合無菌保證要求。將測溫探頭置于被滅菌物品內(nèi)，可獲得良多有價值的數(shù)據(jù)。盡管可用熱穿透數(shù)據(jù)來估測滅菌程序?qū)ξ⑸锏闹滤佬?，但采用生物指示劑做對照試驗，進行完全或部分殺滅，是評判一個滅菌程序有效性的直接方法而且cm也是最佳方法。生物指示劑有不同的形式，可將細菌芽胞置于濾紙.玻璃纖維或不銹鋼等載體上，或直接接種到產(chǎn)品中。通常，當芽胞接種到液體產(chǎn)品時，其耐熱性會有所增強或降低;而有時所用耐熱芽胞與產(chǎn)品不相適應(yīng)。如碰到后1=1一情況，可用生理鹽水或其他溶液代替產(chǎn)品進行實驗

34、，但必須保證所用的替代品與產(chǎn)品具有相似的物理和化學(xué)性質(zhì)（如粘度和ph）,并且耐熱芽胞在替代品中的d值不得小于在產(chǎn)品中的d值。二、組成形式常用于滅菌工藝驗證的生物指示劑主要有三種形式，它們都是用對特定滅菌工藝具有一定耐受性并已知其種類的微生物芽胞制備而成。（一）芽胞條 將芽胞加在載體上，如接種于濾紙片.玻璃1塑料等薄片或條狀物，并用特定的材料包起來以保持其完整性和生物活性，俗稱芽胞條。此類指示劑比較適用于驗證和監(jiān)控非溶液類物品的滅菌工藝。（二）芽胞懸浮液 芽胞懸浮液可被接種于代表性的待滅菌產(chǎn)品溶液或模擬產(chǎn)品溶液中?？捎么搜堪麘腋∫褐苯咏臃N于產(chǎn)品內(nèi)或產(chǎn)品外表面, 這樣能更加直觀地考察產(chǎn)品的實際滅菌

35、效果;如果芽胞懸浮液不宜被直接 接種于產(chǎn)品內(nèi)（或外），則可用模擬產(chǎn)品替代，但要注意的是，芽胞在模擬 產(chǎn)品內(nèi)（或外）的耐熱性不得比在實際產(chǎn)品內(nèi)的低，否則將影響到滅菌工藝 驗證或日常監(jiān)控的可靠性。因此，在使用此類生物指示劑之前，務(wù)必側(cè)定 芽艷在產(chǎn)品或模擬產(chǎn)品內(nèi)（或外）的數(shù)量，d值、z值以及存活時間和死亡 時間。（三）自含型生物指示劑 這種指示劑的一種形式是將芽胞條（或片）加人到含有指示劑的培養(yǎng)基包裝內(nèi)（如：小瓶內(nèi)），這些培養(yǎng)基事先單獨包裝 井與芽胞載體分離，經(jīng)滅菌處理后，擠碎培養(yǎng)基小瓶使芽地條（或片）浸沒 在培養(yǎng)基內(nèi)，在適當溫度和時間內(nèi)培養(yǎng)，通過觀察培養(yǎng)基內(nèi)的酸堿指示劑 的顏色變化判斷其生長狀況;

36、另一種形式是將芽胞直接接種在含有指示劑 的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后生長的微生物使ph值發(fā)生變化，引起顏色變化來 以指示是否有微生物生長。自含型生物指示劑的耐熱性與其載體、包裝的 材質(zhì).結(jié)構(gòu)有很大的相關(guān)性；生物指示劑的包裝要易于殺菌劑透過、因此,側(cè)定d值時務(wù)必要考慮這些因素，尤其是包裝可能會引起殺菌效來的滯后.因此，不能僅側(cè)定芽胞條（或片）的d值。當生物指示劑經(jīng)受挑戰(zhàn)試驗后，宜在4小時內(nèi)培養(yǎng)。從質(zhì)量保證角度來看，我們應(yīng)當盡可能地在較短時間內(nèi)培養(yǎng)經(jīng)受挑戰(zhàn)后的生物指示劑。每 個企業(yè)應(yīng)根據(jù)自身的條件和特點制定適當?shù)臅r間限度。有兩種方法可用來判斷生物指示劑的芽胞生長狀況，一種是通過肉眼觀察培養(yǎng)基的顏色變化（酸

37、堿指示劑）或濁度變化來判斷是否呈陽性;另一種則是借助于相差顯微鏡觀察，在相差顯微鏡的視野中，生長態(tài)細胞呈現(xiàn)暗色，而芽胞則呈現(xiàn)亮色。對一特定的滅菌工藝而言，盡可能購買同一類型的生物指示劑，這樣可以大大減少實驗室花費在生物指示劑的質(zhì)量復(fù)核及滅菌工藝驗證評價方 面的工作量。三.制備如必要用環(huán)境中的分離菌來驗證滅菌程序時，有條件的微生物實驗室可自行制備生物指示劑，包括選種、大規(guī)模芽胞培養(yǎng)、收集芽胞、純化和保藏等。cm種儲備液內(nèi)不得含有營養(yǎng)性物質(zhì)以保證芽胞始終處于休眠狀態(tài)0對自制生物指示劑芽胞的貯存條件和貯存時間應(yīng)予驗證，以確保芽胞數(shù)量 和d值的穩(wěn)定性。實驗室自制生物指示劑時，應(yīng)按生物指示劑生產(chǎn)商的規(guī)范

38、要求制備生物 指示劑。有關(guān)生物指示劑的記錄均應(yīng)具有可追溯性，如種源.轉(zhuǎn)種時間、 傳代代數(shù)、培養(yǎng)及制芽胞用培養(yǎng)基和芽胞收集前后的熱處理方式等。參照 實驗室菌種制備、保藏和使用要求管理滅菌工藝用生物指示劑。四、生物指示劑的選擇和使用一種生物指示劑不是萬能的，要根據(jù)滅菌方式及工藝條件選擇適當?shù)纳?物指示劑。事先要了解生物指示劑對相關(guān)滅菌工藝的耐受性能，以保證所 用生物指示劑的挑戰(zhàn)性大于自然存在于產(chǎn)品內(nèi)（或外）的微生物的挑戰(zhàn)性。生物指示劑對滅菌工藝的耐受性，不僅取決于生物指示劑本身，而且也取決于滅菌時其所處的環(huán)境條件，如生物指示劑包裝材料對殺菌劑的穿 透效果，芽胞溶液的ph值.粘度、金屬離子的濃度等都

39、是生物指示劑耐 受性的主要影響因素。為了確保生物指示劑在產(chǎn)品滅菌程序開發(fā)、驗證和 日常監(jiān)控中的有效使用，務(wù)必要充分了解相關(guān)產(chǎn)品的組分及其包裝材料的cry性能。需要確保所用生物指示劑賦予產(chǎn)品滅菌工藝的挑戰(zhàn)效果大于產(chǎn)品中 實際污染菌的挑戰(zhàn)性。如果因產(chǎn)品對滅菌條件敏感而無法采用過度滅菌工藝，則要根據(jù)滅菌前產(chǎn)品的含菌量資料來制定合理的滅菌工藝條件和選擇適當?shù)纳镏甘緞?。滅菌工藝開發(fā)x確立滅菌終點任何滅菌工藝的目的都是為了完全殺滅所有微生物。但是，從微生物死亡的概率特性以及低污染水平下的檢測難度來看，無法證明一個滅菌程 序已將所有的微生物都殺滅了。那么，又該如何確定滅菌終點呢?無菌定義 為:使微生物的殘

40、存概率下降到10°,并在此基礎(chǔ)上再下降6個對數(shù)單位(即 微生物的殘存概率不超過1/百萬，或pnsuio 6)滅菌過程中所產(chǎn)生的各項物理和生物學(xué)參數(shù)應(yīng)能保證其滅菌效果達到pnsu=106o如果no和dt已知，為使滅菌終點達到10“的要求，ft =( lgno-lgnt)xdt物理因素滅菌工藝開發(fā)所涉及的生物和物理學(xué)參數(shù)生物學(xué)因素1 滅菌前微生物量:no滅菌值:ft2滅菌前微生物的耐熱性:dr3滅菌終點的殘存概率:no （10"）例如，滅菌前半成品的每個容器內(nèi)含有100個耐熱芽胞，其dt=1分i-aii鐘，進行濕熱滅菌時，滅菌值f。要達到8分鐘，才能使產(chǎn)品中的微生物降 至10&

41、#176;后，再下降6個對數(shù)單:f0=2-（-6）xl=8分鐘。f°=8分鐘是滅菌工 藝必須達到的最小目標值。也可根據(jù)滅菌設(shè)備的性能和產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性確 定f。的上限。二、控制滅菌前含菌的滅菌工藝（一）工藝概述嚴格地說，建立在含菌量控制基礎(chǔ)上的滅菌工藝，其滅菌終點是由滅 前半成品的含菌量及所含微生物的耐熱性來決定的。但是，生產(chǎn)時應(yīng)避免 產(chǎn)品被耐熱性微生物污染，而不能依賴于最終滅菌。為此，有些產(chǎn)品在滅前進行無菌生產(chǎn)和灌裝。生產(chǎn)時，控制滅菌前產(chǎn)品中的含菌量，主要的好處在于可以降低滅條件，這樣就可以降低滅菌時對產(chǎn)品及其容器/密封件的潛在破壞性。這對 熱敏性產(chǎn)品（如蛋白質(zhì)）來說，是非常重要的。

42、如果在滅菌前產(chǎn)品中沒有耐熱菌，為便于工藝開發(fā)，則可假設(shè)有一定數(shù) 量的芽胞存在于其中（常規(guī)生產(chǎn)時可能會碰到的最差狀況）。比如，可假設(shè)l-ai.每只容器內(nèi)含有d121c=0. 5分鐘的耐熱芽胞100個。開發(fā)工藝時，可根據(jù)與假設(shè)菌的數(shù)量及耐熱性相當?shù)膶嶋H生物指示劑（bi）來確定一個滅菌工藝的 滅菌效果。根據(jù)置于滅菌產(chǎn)品內(nèi)的測溫探頭的測量數(shù)據(jù)計算出理論f。值, 并對多次運行的f。值進行平均，將平均f。值與從接有生物指示劑（已知胞 子數(shù)量和d值）的類似容器中得到的平均slr值進行比較，根據(jù)生物指示etj劑的致死效果，估算出實際污染菌的下降水平：slr a=slrb xdb/da，slr a滅菌前產(chǎn)品中污

43、染菌的對數(shù)下降值;slr b生物指示劑的對數(shù)下降值;da滅菌前微生物的（已知或假定的）d值;db生物指示劑d值。例,如果da=0.5分鐘，db=2.0分鐘,在12fc，滅菌值fo=8分鐘,生物指示劑下降4個對數(shù)單位，則滅菌前微生物的數(shù)量可下降約16個對數(shù)單位：slra=4x (2.070.5)=16, lgnt =lgn0-slr=2-16=-14o圖12-2滅菌前彼生物相對丁生物指示刑的滅菌蛋4 1的對數(shù)價從圖可以看出，在滅菌結(jié)束時仍有一部分生物指示劑未被殺滅，但這并不意味著此滅菌程序無效。相反，生物指示劑起到了“生物積分器”作用。通過它們,證實了測溫探頭指示的f。值（8分鐘）所賦予容器內(nèi)物

44、品的實際滅菌效果。有些廠家誤認為，在進行工藝驗證時，必須將耐熱性最強的芽胞，以106濃度接入產(chǎn)品中，并且要下降6d或12d,才能認為此滅菌工藝有效。有時，生物指示劑在產(chǎn)品中的耐熱性會有所增強，這就需要賦予非常大的fo值才能將其完全殺滅。只要按下述方法對滅菌前的含菌量進行控制.監(jiān)測并掌握其耐熱性，此種做法是完全沒有必要的。（二）滅菌前產(chǎn)品的微生物監(jiān)控如果能嚴格執(zhí)行g(shù)mp規(guī)范。那么無菌生產(chǎn)的藥品中一般是不會含有耐熱芽胞的。即使在非無菌條件下生產(chǎn)，滅 前的產(chǎn)品中存在的微生物應(yīng)只是為數(shù)不多的不耐熱的生長態(tài)菌。對于非無生產(chǎn)的藥品而言，必須對滅菌前產(chǎn)品的微生物進行監(jiān)測，以確保半成品 的微生物處于穩(wěn)定的受控

45、狀態(tài)。監(jiān)控方法是:1 在灌裝結(jié)束階段取樣。2 對這些樣品進行微生物計數(shù)。3將樣品置于100°c下暴熱10分鐘后，過濾檢查并進行需氧和厭氧條件培養(yǎng)，測定其中的總芽胞數(shù)。應(yīng)規(guī)定滅菌前產(chǎn)品中微生物含量的限度標準，對微生物計數(shù)資料進行趨勢分析，以考察批與批之間穩(wěn)定性。如果暴熱后樣品的檢測結(jié)果與預(yù)期 目標一致，即沒有任何微生物生長，則說明在滅菌前產(chǎn)品中不存在任何耐 熱芽胞。一般情況下，暴熱后的樣品中是檢測不到微生物的，一旦發(fā)現(xiàn)，貝懦對其鑒別并測定其d值。若分離菌的d值大于滅菌工藝驗證所用生物指示 劑的d值，則說明滅菌程序不充分，應(yīng)采取措施以消除產(chǎn)品中的耐熱菌。如果這些措施不可行，則應(yīng)采用具有更

46、強耐熱性的生物指示劑，或是從產(chǎn) 品中分離出的耐熱性微生物，對滅菌程序進行再驗證。三、過熱滅菌及去熱原工藝采用過熱滅菌程序時，不用考慮滅菌前含菌量問題。這并不意味著就不用對滅菌前含菌量進行控制。相反，遵照良好的衛(wèi)生生產(chǎn)規(guī)范以控制滅前產(chǎn)品中的污染菌含量是非常重要的oi-aip過熱滅菌工藝是指能使d值不小于1.0分鐘的耐熱微生物（常指嗜熱脂 肪芽胞桿菌）在數(shù)量上至少下降12個對數(shù)單位的滅菌工藝。過熱滅菌工藝 常用于熱穩(wěn)定性物品的滅菌，如包裝材料和生產(chǎn)設(shè)備等。驗證時，常常先 通過確定完全殺滅含有106個嗜熱脂肪芽胞桿菌的生物指示劑（dai值為1.5分鐘左右）所需的滅菌時間，再將這個時間加倍即為實際生產(chǎn)

47、時的過熱滅菌時間。去熱原工藝通常是和干熱滅菌聯(lián)系在一起的，去熱原的工藝條件比芽胞殺滅程序要苛刻得多，通常是fh（干熱致死時間）的數(shù)十倍。因此，如果干 熱去熱原工藝能使細菌內(nèi)毒素下降3個對數(shù)單位，那么就沒必要再進行生 物指示劑的挑戰(zhàn)性實驗。濕熱滅菌工藝的生物學(xué)驗證一. 驗證的標準最終產(chǎn)品的無菌質(zhì)量取決于兩個因素，即滅菌前產(chǎn)品中的微生物含量以及滅菌工藝的殺滅效果。微生物學(xué)驗證就是在這兩個因素的基礎(chǔ)上進行的。任何滅菌工藝均應(yīng)當能使產(chǎn)品中的污染菌含量下降至一個菌之后，再cmcel下降6個對數(shù)單位，這樣才能保證產(chǎn)品經(jīng)滅菌后其中非無菌品的概率不超 過1/百萬。生物學(xué)驗證就是要用與產(chǎn)品滅菌工藝相適應(yīng)的最苛刻

48、條件來挑戰(zhàn)該產(chǎn)品滅菌工藝的有效性、可靠性和穩(wěn)定性。二、過熱滅菌工藝（一）生物指示劑的選擇對過熱滅菌工藝是指能使d值不小于1分鐘的微生物至少下降12個對 數(shù)單位的滅菌工藝。對一般的液體產(chǎn)品而言，在121°c滅菌15分鐘即被認 為過熱滅菌工藝。但對管路、膠塞.織物以及過濾器等熱穿透性較差的物 品則需要更長的滅菌時間或更高的滅菌溫度，方能達到過熱滅菌要求。用做生物指示劑的微生物芽胞應(yīng)具有良好的耐熱性并且耐熱性也相對比較穩(wěn)定。根據(jù)滅菌工藝對微生物的強熱致死效應(yīng)，通常選用d值不低于1.5-3.0分鐘的嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞（每個指示劑的芽胞含量通常在105-107之間） 作為生物指示劑對過熱滅菌

49、工藝進行驗證。該類指示劑在f。值低于其存活 時間（d值x芽胞數(shù)的對數(shù)值2）時，應(yīng)當能全部呈陽性結(jié)果;當f。值高于其 殺滅時間（d值x芽胞數(shù)的對數(shù)值+4）時，所有的生物指示劑均應(yīng)呈陰性結(jié) 果。對fo值為15分鐘的滅菌工藝（藥典推薦的常用滅菌工藝），可選用d值為15分鐘、芽胞含量為106個的生物指示劑，或其他耐熱性相當?shù)纳?指示劑，對其進行驗證。根據(jù)被滅菌物品的性質(zhì)來確認所選用不同包裝方式的生物指示劑。滅溶液時，多選用自含型安瓶瓶生物指示劑;滅菌織物時，多選用芽胞條;滅菌管路時，則可能要選用特殊生物指劑（如用接有芽胞的鋼絲、線等）以 測試死角處（最冷點）的滅菌狀況。選擇時，首先。要掌握滅菌前產(chǎn)品

50、中污染菌狀況，包括污染菌的數(shù)量及其耐熱性;其次，測定生物劑在待驗證產(chǎn)品及驗證用標準溶液中的耐熱性（d值和z值）;最后，根據(jù)產(chǎn)品的最低滅菌工藝條件.滅菌前產(chǎn)品中的污染控制要求及最終產(chǎn)品的無菌保證要求，用相關(guān)公式計算出驗證時每個生物指示劑所需要的抱子數(shù)量。滅菌方式微生物（抱子）d值范圍（分）嗜熱脂肪芽抱桿菌 bacillus stearothermophilus1.5-3.0濕熱121°c枯草芽抱桿菌bacillus subtilis凝結(jié)芽抱桿菌bacillus coagulans0.4-0.8梭狀芽抱桿菌 clostridium sporogenes0.4-0.8干熱150°

51、c枯草芽抱桿菌黑色變種bacillus subtilis var. niger>1.0下面我們將以用產(chǎn)芽胞梭菌(clostridium sporogenes)芽胞作為生物指示劑驗證乳劑類產(chǎn)品滅菌工藝為實例，具體介紹生物指示劑的選擇方法。1 收集與產(chǎn)品滅菌工藝相關(guān)的基本資料 案例:某制藥公司生產(chǎn)兩種 乳劑類產(chǎn)品(a和b),h12-4乳刑產(chǎn)品a及乳刑產(chǎn)品b的相關(guān)復(fù)生需控制錨產(chǎn)品滅繃超tf我制般驗if用袍子在其屮控制限度耐熱性限度溫度x時間(nin)附性aw100個觀袋恥1小分116515分鐘9-130.8分bw血個菌/袋血10分llfitxlj 分鐘8-120.9分注：產(chǎn)品a和產(chǎn)品睛為大容i

52、t注刪(rood/軌在進行生物學(xué)驗證之前，產(chǎn)品滅菌工藝已經(jīng)過物理驗證而確定下來。因此，以上產(chǎn)品資料均可在生物學(xué)驗證之前獲取。滅菌前含菌量限度以及 污染菌的耐熱性限度均是以原材料的微生物含量和常規(guī)監(jiān)控資料為基礎(chǔ)而 建立的;滅菌條件及fq值控制是根據(jù)產(chǎn)品穩(wěn)定性研究資料而建立的;驗證用 芽胞在每種產(chǎn)品中的實際耐熱性資料由微生物實驗室測得，并且通過熱致 死曲線的線性度發(fā)現(xiàn)產(chǎn)芽胞梭菌(clostridium sparogenes)芽胞在上述兩種產(chǎn)品內(nèi)熱穩(wěn)定良好?？紤]到兩種產(chǎn)品的規(guī)格相同.且在同一滅菌設(shè)備內(nèi)滅菌并且滅菌工藝條件相似、以及生物指示劑芽胞在其中的耐熱性也較為相近，只要驗證其 中的一個產(chǎn)品b即可

53、，因為要采用fo值控制范圍的較低下限進行驗證。但是，產(chǎn)品均是乳劑類產(chǎn)品，如直接將芽胞接種在產(chǎn)品內(nèi)進行驗證，勢必 給試驗后的無菌檢測帶來很多麻煩。因此，可選擇一透明澄清的標準溶液 來替代上述二產(chǎn)品，只要芽胞在其中的耐熱性不低于在兩產(chǎn)品中的耐熱性 即可。經(jīng)測定，產(chǎn)芽胞梭狀菌芽胞在氯化鈉一磷酸鹽緩沖液(pbs，ph70)中的耐熱性為14分鐘，高于其在兩產(chǎn)品中的耐熱性，適合作為上述兩產(chǎn)品滅工藝驗證用標準溶液。2確定驗證條件 根據(jù)本案例,驗證條件確定如下:滅菌前產(chǎn)品含菌量限度設(shè)定為100個菌/袋，滅菌溫度為116°c, fo值為8分鐘，以產(chǎn)芽胞梭&芽胞作為生物指示劑，驗證標準溶液為氯化鈉一磷酸鹽緩沖液(pbs),驗 證試驗瓶數(shù)量為20袋/次。3確定芽胞的接種數(shù)量 我們知道，當滅菌條件一定時,fo=d(lgno-lgni)o產(chǎn)品中污染菌的最大耐熱性d121=1.0分鐘，那么，滅菌工藝使產(chǎn)品達到無菌保證值所需最小fo值為: