免疫分析法學習教案

1、會計學1免疫免疫(miny)分析法分析法第一頁，共57頁。一、概述一、概述二、抗原二、抗原(kngyun)(kngyun)三、抗體與免疫反應三、抗體與免疫反應四、免疫分析方法及應用四、免疫分析方法及應用主要主要(zhyo)內(nèi)容內(nèi)容第1頁/共56頁第二頁，共57頁。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗體與免疫反應三、抗體與免疫反應(fnyng)(fnyng)四、免疫分析方法及應用四、免疫分析方法及應用主要主要(zhyo)內(nèi)容內(nèi)容第2頁/共56頁第三頁，共57頁。 免疫學是研究免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，了解其在免疫應答反應中對機體有益的防衛(wèi)功能和有害的病理損傷(snshng)的機制，研究有效的免疫措

2、施，實現(xiàn)以防病，治病為目的的一門現(xiàn)代醫(yī)學學科。一、概述一、概述(i sh)第3頁/共56頁第四頁，共57頁。 什么叫免疫分析？什么叫免疫分析？基于抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種技術(shù)手基于抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種技術(shù)手段。抗原抗體反應是指抗原與相應的抗體之間發(fā)段。抗原抗體反應是指抗原與相應的抗體之間發(fā)生的特異性結(jié)合反應。它既可以發(fā)生在體內(nèi)生的特異性結(jié)合反應。它既可以發(fā)生在體內(nèi)(t (t ni)ni)，也可以發(fā)生在體外。，也可以發(fā)生在體外。在體內(nèi)在體內(nèi)(t ni)(t ni)發(fā)生的抗原抗體反應為體液免疫應答發(fā)生的抗原抗體反應為體液免疫應答的效應作用。體外的抗原抗體結(jié)合反應主要用于

3、的效應作用。體外的抗原抗體結(jié)合反應主要用于抗原或抗體的檢測，用于免疫學診斷?？乖蚩贵w的檢測，用于免疫學診斷。第4頁/共56頁第五頁，共57頁。(1) 在實驗在實驗(shyn)藥物動力學和臨床藥物學中，測定生物利用度藥物動力學和臨床藥物學中，測定生物利用度和藥物代謝動力學參數(shù)等生物藥劑學中的重要數(shù)據(jù)，以便了解藥和藥物代謝動力學參數(shù)等生物藥劑學中的重要數(shù)據(jù)，以便了解藥物在體內(nèi)的吸收、分解、代謝和排泄情況；物在體內(nèi)的吸收、分解、代謝和排泄情況；(2) 在藥物的臨床檢測中，對治療指數(shù)小、超過安全劑量易發(fā)生嚴在藥物的臨床檢測中，對治療指數(shù)小、超過安全劑量易發(fā)生嚴重不良反應或最佳治療濃度和毒性反應濃度有

4、交叉的藥物血液濃重不良反應或最佳治療濃度和毒性反應濃度有交叉的藥物血液濃度進行監(jiān)測；度進行監(jiān)測；(3) 在藥物生產(chǎn)中，從發(fā)酵液或細胞培養(yǎng)液中快速測定有效組分的在藥物生產(chǎn)中，從發(fā)酵液或細胞培養(yǎng)液中快速測定有效組分的含量，以實現(xiàn)對生產(chǎn)過程的在線監(jiān)測；含量，以實現(xiàn)對生產(chǎn)過程的在線監(jiān)測；(4) 對藥品中是否存在特定的微量有害雜質(zhì)進行評價。對藥品中是否存在特定的微量有害雜質(zhì)進行評價。在藥物分析中，免疫分析法的應在藥物分析中，免疫分析法的應用用(yngyng)主要集中在以下主要集中在以下幾方面：幾方面：第5頁/共56頁第六頁，共57頁。非標記免疫分析（抗原抗體結(jié)合理化性質(zhì)發(fā)生變化非標記免疫分析（抗原抗體結(jié)

5、合理化性質(zhì)發(fā)生變化）標記免疫分析標記免疫分析標記物標記物有無有無非放射免疫分析非放射免疫分析放射免疫分析（放射污染）放射免疫分析（放射污染）酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析熒光免疫分析熒光免疫分析電化學免疫分析電化學免疫分析化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光免疫分析免疫分免疫分析析第6頁/共56頁第七頁，共57頁。免疫分析檢測免疫分析檢測(jin c)的發(fā)的發(fā)展展放射免疫檢測（興起于放射免疫檢測（興起于2020世紀世紀(shj)70(shj)70年年代代) )酶聯(lián)免疫檢測（興起于酶聯(lián)免疫檢測（興起于2020世紀世紀(shj)80(shj)80年代，各臨床機構(gòu)普遍使年代，各臨床機構(gòu)普遍使用）；用）；以化學發(fā)光為代

6、表的光生物學標記及免疫以化學發(fā)光為代表的光生物學標記及免疫檢測技術(shù)檢測技術(shù)（2020世紀世紀9090年代開始推廣使用，產(chǎn)年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長期）三個階段。品步入成長期）三個階段。第7頁/共56頁第八頁，共57頁。 特點特點可逆性可逆性比例比例(bl)(bl)性性反應階段性反應階段性特異性特異性免疫免疫(miny)(miny)分析法的特點分析法的特點第8頁/共56頁第九頁，共57頁。特異性特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(fnyng)(fnyng)的的專一性專一性分子基礎(chǔ)分子基礎(chǔ): :抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補性空間

7、構(gòu)型的互補性第9頁/共56頁第十頁，共57頁?？赡嫘钥赡嫘钥赡嫘裕嚎乖c相應抗體結(jié)合成復合物后，在一定條可逆性：抗原與相應抗體結(jié)合成復合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體，解離后的抗原或抗件下又可解離為游離抗原與抗體，解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)體均能保持原有的結(jié)構(gòu)(jigu)(jigu)和活性。和活性。影響因素：影響因素： 抗體對相應抗原的親合力親合力越高，結(jié)合抗體對相應抗原的親合力親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離越牢固，越不易解離 環(huán)境因素對復合物的影響環(huán)境因素對復合物的影響pHpH、離子強度、離子強度 第10頁/共56頁第十一頁，共57頁。比例性和比例性和反應階段性反應

8、階段性比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(fnyng)需遵循一定需遵循一定的量比關(guān)系的量比關(guān)系前帶前帶(prezone)：抗體過量：抗體過量后帶后帶(postzone)：抗原過量：抗原過量等價帶等價帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適：抗原抗體比例合適 第11頁/共56頁第十二頁，共57頁。一、概述一、概述二、抗原二、抗原(kngyun)(kngyun)三、抗體與免疫反應三、抗體與免疫反應四、免疫分析方法及應用四、免疫分析方法及應用主要主要(zhyo)內(nèi)容內(nèi)容第12頁/共56頁第十三頁，共57頁。第13頁/共56頁第十四頁，共57頁。第14頁/共5

9、6頁第十五頁，共57頁。第15頁/共56頁第十六頁，共57頁。第16頁/共56頁第十七頁，共57頁。第17頁/共56頁第十八頁，共57頁。第18頁/共56頁第十九頁，共57頁。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗體與免疫反應三、抗體與免疫反應(fnyng)(fnyng)四、免疫分析方法及應用四、免疫分析方法及應用主要主要(zhyo)內(nèi)容內(nèi)容第19頁/共56頁第二十頁，共57頁。第20頁/共56頁第二十一頁，共57頁。第21頁/共56頁第二十二頁，共57頁。第22頁/共56頁第二十三頁，共57頁。第23頁/共56頁第二十四頁，共57頁。Fab：抗原：抗原(kngyun)結(jié)合片段結(jié)合片段Fc：可

10、結(jié)晶片段：可結(jié)晶片段第24頁/共56頁第二十五頁，共57頁。第25頁/共56頁第二十六頁，共57頁。第26頁/共56頁第二十七頁，共57頁。第27頁/共56頁第二十八頁，共57頁。n第28頁/共56頁第二十九頁，共57頁。第29頁/共56頁第三十頁，共57頁。第30頁/共56頁第三十一頁，共57頁。第31頁/共56頁第三十二頁，共57頁。第32頁/共56頁第三十三頁，共57頁。n細胞培養(yǎng)法細胞培養(yǎng)法 & 接種動物體內(nèi)接種動物體內(nèi)生產(chǎn)法生產(chǎn)法第33頁/共56頁第三十四頁，共57頁。第34頁/共56頁第三十五頁，共57頁。第35頁/共56頁第三十六頁，共57頁。n散法、間接血凝法和散法、間

11、接血凝法和ELISA法法等。等。第36頁/共56頁第三十七頁，共57頁。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗體與免疫三、抗體與免疫(miny)(miny)反應反應四、免疫四、免疫(miny)(miny)分析方法及應用分析方法及應用主要主要(zhyo)內(nèi)容內(nèi)容第37頁/共56頁第三十八頁，共57頁。四、免疫四、免疫(miny)分析方法及分析方法及其應用其應用放射免疫放射免疫(miny)分析法（分析法（RIA）熒光免疫熒光免疫(miny)分析法（分析法（FIA）克隆酶給予體免疫克隆酶給予體免疫(miny)分析法（分析法（CEDIA）酶聯(lián)免疫酶聯(lián)免疫(miny)吸附分析法（吸附分析法（ELISA）

12、第38頁/共56頁第三十九頁，共57頁。放射免疫分析法（放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）1968年年Miles和和Hales建立了免疫放射分析方法，利用標記抗體作示蹤劑，在反建立了免疫放射分析方法，利用標記抗體作示蹤劑，在反應系統(tǒng)中加入過量的抗體，故其靈敏度比放射免疫分析法明顯提高，而且標應系統(tǒng)中加入過量的抗體，故其靈敏度比放射免疫分析法明顯提高，而且標準曲線的測量范圍也明顯擴大。準曲線的測量范圍也明顯擴大。由于由于(yuy)特異性單克隆抗體用于免疫放射分析，使本法得到了更快的發(fā)展特異性單克隆抗體用于免疫放射分析，使本法得到了更快的發(fā)展。近年來，基因工程抗體和抗原應

13、用于本技術(shù)，使得免疫放射分析法更加完。近年來，基因工程抗體和抗原應用于本技術(shù)，使得免疫放射分析法更加完善。善。放射免疫分析（放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是體外放射分析技術(shù)中建立最早、）是體外放射分析技術(shù)中建立最早、應用最廣的一類競爭性體外放射分析技術(shù)應用最廣的一類競爭性體外放射分析技術(shù).第39頁/共56頁第四十頁，共57頁?；驹砘驹?基本原理：放射性標記抗原與非標記抗原（包括標準抗原或待測基本原理：放射性標記抗原與非標記抗原（包括標準抗原或待測抗原）與有限量抗原）與有限量(xinling)(xinling)的特異性抗體發(fā)生可逆性競爭結(jié)合的特異性抗體發(fā)生可逆性

14、競爭結(jié)合 , ,這種競爭可用以下反應式來表示：這種競爭可用以下反應式來表示： 抗原抗原(kngyun) 抗體抗體常用的標記物：常用的標記物：125 I和氚標記物和氚標記物放射性活度（貝克，放射性活度（貝克，Bp）1Bp：每秒一次核衰變：每秒一次核衰變(shuibin)比活度（比活度（Bp/g）：）：每單位質(zhì)量所含的放射性比活度每單位質(zhì)量所含的放射性比活度游離狀態(tài)游離狀態(tài)結(jié)合狀態(tài)結(jié)合狀態(tài)第40頁/共56頁第四十一頁，共57頁。具體步驟具體步驟 抗原抗體(kngt)反應結(jié)合(jih)的和游離的放射性物質(zhì)的分離放射性活度的測定(cdng)柱色譜法柱色譜法吸附法吸附法沉淀法沉淀法抗抗體發(fā)抗抗體發(fā)微孔濾

15、膜法微孔濾膜法固相法固相法求出結(jié)合率，繪制標準曲線（劑量反應曲線）求出結(jié)合率，繪制標準曲線（劑量反應曲線）第41頁/共56頁第四十二頁，共57頁。熒光熒光(ynggung)免疫分析法（免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA） 免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應的特異性和 敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合的一項技術(shù) 以熒光素作為標記物，與已知的抗體或抗原結(jié)合、但不影響(yngxing)其免疫學特性。然后將熒光素標記的抗體作為標準試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原第42頁/共56頁第四十三頁，共57頁。熒光熒光(ynggung)免疫分析法（免疫分析法（Fluorescence

16、immunoassay, FIA） 在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復合物及其存在的部位 在實際(shj)工作中，由于熒光素標記抗體檢查抗原的方法較為常用，所以一般通稱為熒光抗體技術(shù)第43頁/共56頁第四十四頁，共57頁。根據(jù)實驗方法(fngf)分類直接法間接法補體(bt)法其他第44頁/共56頁第四十五頁，共57頁。直接直接(zhji)(zhji)法法將熒光標記的特異性抗體（抗原(kngyun)）直接加在抗原(kngyun)（抗體）上，經(jīng)一定的溫度和時間染色，水洗-干燥-封片-鏡檢操作簡便、特異性高、非特異性染色少敏感性低抗原(kngyun)標記抗體熒光第45頁/共56頁

17、第四十六頁，共57頁。間接間接(jin ji)(jin ji)法法先用已知未標記的特異抗體（一抗）與抗原反應，再用標記的抗體（二抗）與其反應，形成(xngchng)抗原-抗體-抗體復合物，水洗-干燥-封鏡-鏡檢未知抗原未知抗原(kngyun)未標記抗未標記抗體體標記抗體標記抗體熒光熒光第46頁/共56頁第四十七頁，共57頁。補體(bt)法利用補體反應，通過形成抗原-抗體-補體復合物發(fā)射(fsh)熒光補體補體(bt)標記抗補標記抗補體抗體體抗體第47頁/共56頁第四十八頁，共57頁。時間分辨(fnbin)熒光免疫測定 利用具有雙功能基團結(jié)構(gòu)的螯合劑，將鑭系元素標記到抗體（或抗原）上，經(jīng)免疫反應形

18、成復合物，由于鑭系元素能發(fā)出熒光，故分離除去(ch q)未結(jié)合的成分后，利用時間分辨熒光儀即可測定熒光強度，從而推測待測物含量。第48頁/共56頁第四十九頁，共57頁?；驹砘驹?它采用抗原與抗體的特異反應將待測物它采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物與酶連接，然后通過酶與底物(d w)(d w)產(chǎn)生顏產(chǎn)生顏色反應，用于定量測定。色反應，用于定量測定。 測定的對象可以是抗體也可以是抗原。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有在這種測定方法中有3 3種必要的試劑：種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） 酶標記的抗原或

19、抗體（標記物）酶標記的抗原或抗體（標記物） 酶作用的底物酶作用的底物(d w)(d w)（顯色劑）（顯色劑）酶聯(lián)免疫吸附分析法（酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）第49頁/共56頁第五十頁，共57頁。第50頁/共56頁第五十一頁，共57頁。 雙抗體夾心法，屬于非競爭(jngzhng)結(jié)合測定。 它是檢測抗原最常用ELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。 其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體免疫復合物。復合物的形成量與待測抗原的含量成正比。測定復合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測抗原含量。 實驗原理實驗原理 雙抗體雙抗體(kngt)夾心法夾心法第51頁/共56頁第五十二頁，共57頁。第52頁/共56頁第五十三頁，共57頁。酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。具有酶促反應，顯示出生物放大作用。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化(ynghu)物酶(horseradish peroxidase, HRP)和