化學(xué)發(fā)光免疫標記分析技術(shù)(基本原理 )（課堂PPT）

1、免疫分析免疫分析u免疫反應(yīng)： 抗原進入機體，刺激機體的免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這種反應(yīng)叫免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)應(yīng)答包括對抗原物質(zhì)的感應(yīng)、反應(yīng)、效應(yīng)三個連續(xù)的階段。u 免疫分析（immunoassay，IA）： 在臨床檢驗中，基于抗原與其配對抗體能夠發(fā)生特異反應(yīng)，用已知的抗原或抗體檢測分析體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。 抗原抗原抗體免疫反應(yīng)特點抗體免疫反應(yīng)特點u高特異性 抗原抗體的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性?？乖贵w反應(yīng)的高特異性是免疫學(xué)檢測的基礎(chǔ)。u高親和性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物

2、的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+AbAgAb。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。 免疫學(xué)檢測免疫學(xué)檢測u免疫學(xué)檢測是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計的一系列測定抗原、抗體、免疫細胞及其分泌的細胞因子的實驗手段及分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用。它包括：l抗原抗體的檢測技術(shù)l免疫細胞的檢測l細胞因子的檢測l免疫相關(guān)基因分析l免疫免疫標記技術(shù)標記技術(shù)l免疫PCR(IM-PCR)技術(shù) l雜交瘤技術(shù)與T細胞克隆技術(shù)放免放免酶免酶免發(fā)光發(fā)光60年代年代70年代年代90年代年代免疫分析標記技術(shù)的發(fā)展免疫分析標記技術(shù)的發(fā)展化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光u化學(xué)發(fā)光：由于化學(xué)反應(yīng)

3、（通常是氧化）底物從基態(tài)躍遷為激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，躍遷能量以光子形式釋放的現(xiàn)象。吸收光譜吸收光譜發(fā)射光譜發(fā)射光譜物質(zhì)激發(fā)態(tài)物質(zhì)激發(fā)態(tài)物質(zhì)基態(tài)物質(zhì)基態(tài)吸吸能能放放能能光譜產(chǎn)生過程基本原理光譜產(chǎn)生過程基本原理u化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是將化學(xué)發(fā)光體系與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術(shù)。u美國臨床化學(xué)會議規(guī)定：凡是通過測量光子計數(shù)的方法都是化學(xué)發(fā)光，包括通過酶促luminol發(fā)光。u化學(xué)發(fā)光免疫分析1980s進入體外診斷領(lǐng)域，第一臺全自動檢測儀1993年誕生?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)待測樣品待測樣品標記抗體或抗原標記抗體或抗原洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物洗

4、滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物發(fā)光底物發(fā)光底物（或發(fā)光劑）（或發(fā)光劑）儀器檢測儀器檢測包包被抗體或抗原的被抗體或抗原的磁珠或反應(yīng)管磁珠或反應(yīng)管反應(yīng)反應(yīng)15-60分鐘分鐘反應(yīng)反應(yīng)0-5分鐘分鐘發(fā)光免疫分析基本操作發(fā)光免疫分析基本操作步驟步驟( (一步法一步法) ) 魯米諾及其衍生物的增敏化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)H2O2+NH2OONHNHN2OH-HRPNH2CO2-CO2-+Photon (425nm)ROHROH NSRBOHOH增強劑（Enhancer）魯米諾在免疫測定中既可用作標記物，也可用作過氧化物酶的底物 魯米諾化學(xué)發(fā)光魯米諾化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)系統(tǒng)CH3C=OORN+OH-H+H2O2+ H2O+ROH光子 +

5、 CO2 +CH3C=OORNHOCH3C=OORNHOOCH3ONCH3ONC=OO吖啶酯化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)吖啶酯化學(xué)發(fā)光吖啶酯化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)系統(tǒng)堿性磷酸酶及其衍生物的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)+*光子(477nm)APOOOCH3OPO32-O-OOOCH3OO-OOCH3 金鋼烷（發(fā)光底物）及其衍生物的增敏化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光按化學(xué)發(fā)光按化學(xué)反應(yīng)類型分為：化學(xué)反應(yīng)類型分為：u直接化學(xué)發(fā)光（非酶促化學(xué)發(fā)光）l吖啶酯系統(tǒng)l異魯米諾系統(tǒng)u間接化學(xué)發(fā)光（酶促化學(xué)發(fā)光）l辣根過氧化物酶魯米諾系統(tǒng)（HRP系統(tǒng)）l堿性磷酸酶金剛烷系統(tǒng)（AP系統(tǒng)）u其它l電化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光的檢測化

6、學(xué)發(fā)光的檢測類型類型u直接化學(xué)發(fā)光直接化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)物質(zhì),如異魯米諾、吖啶酯等直接標記抗原或抗體，免疫反應(yīng)后，直接引發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進行檢測。u 產(chǎn)品：產(chǎn)品：l吖吖啶酯標記啶酯標記 : 西門子Siemens Centaur XP CP 雅培Abbott Architect i2000l異異魯米諾標記魯米諾標記 ：索林DiaSoin Liaison 新產(chǎn)業(yè)直接化學(xué)發(fā)光直接化學(xué)發(fā)光u間接化學(xué)發(fā)光間接化學(xué)發(fā)光：用參與發(fā)光反應(yīng)的酶來標記抗原或抗體，免疫反應(yīng)后，加入發(fā)光底物，測定發(fā)光體系的發(fā)光強度來進行抗原或抗體的檢測。兩大反應(yīng)體系：u辣根過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)：氧化還原反應(yīng)，穩(wěn)定性差l源德、科美、安

7、圖u堿性磷酸酶（AP）系統(tǒng)：水解反應(yīng)，靈敏度較高l貝克曼：Access 1、Access 2，DXI600、DXI800l西門子：Immulite1000 , Immulite 2000l達成生物：AULIN200間接化學(xué)發(fā)光間接化學(xué)發(fā)光以堿性磷酸酶系統(tǒng)為例u電化學(xué)發(fā)光：電化學(xué)發(fā)光：一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，直接由三聯(lián)吡啶釕 Ru(bpy)32+ 標記抗體，反應(yīng)時標記物直接發(fā)光。u 產(chǎn)品：產(chǎn)品：lRoche：Elecsys2010、COBAS e411、COBAS e601電化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光u第一代：魯米諾及其衍生物u第二代：l直接標記：吖叮酯標記l間接標記：堿性磷酸酶

8、-金剛烷系統(tǒng)l電化學(xué)發(fā)光：三聯(lián)砒啶釕化學(xué)發(fā)光的發(fā)展史化學(xué)發(fā)光的發(fā)展史國際主流免疫診斷公司均采用第二代化學(xué)發(fā)光標記物：吖啶酯（雅培、西門子）、堿性磷酸酶-金剛烷（貝克曼、西門子）、三聯(lián)砒啶釕（羅氏）?；瘜W(xué)發(fā)光按檢測方式分為：化學(xué)發(fā)光按檢測方式分為：u隨機處理模式：管式化學(xué)發(fā)光（磁微粒分離）u批處理模式： 板式化學(xué)發(fā)光（物理吸附）化學(xué)發(fā)光的檢測化學(xué)發(fā)光的檢測方式方式u適合流行病調(diào)查、疾病預(yù)防與控制、體檢中心，以及醫(yī)院血站等大樣本檢測項目的使用（比如HIV、TP、HCV和乙肝兩對半等）。u通常采用96孔白色不透明微孔板進行包被，不方便隨到隨測和醫(yī)院急診；u對于定量檢測需要做標準曲線。國內(nèi)廠家主要是板

9、式化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)國內(nèi)廠家主要是板式化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)板式化學(xué)發(fā)光板式化學(xué)發(fā)光u采用管式或微粒子發(fā)光，測定快速、準確；u可以隨到隨測，適用于醫(yī)院急診；u定量檢測的標準曲線存儲在試劑條形碼中，可在2-4周內(nèi)直接使用。國外廠家全部是管式化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)國外廠家全部是管式化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)管式管式化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光磁微粒示意圖磁微粒示意圖Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y磁微粒分離技術(shù)特點：l較微孔板擴大抗原抗體結(jié)合表面積，增加抗原或抗體的結(jié)合量，

10、提高檢測靈敏度。l加快反應(yīng)速度，迅速捕獲抗原抗體。l易于結(jié)合相、游離相的分離，提高檢測準確性。l提高發(fā)光強度，快速達到穩(wěn)定發(fā)光。管式化學(xué)發(fā)光大多用磁微粒，板式化學(xué)發(fā)光使用微孔板載體。管式化學(xué)發(fā)光大多用磁微粒，板式化學(xué)發(fā)光使用微孔板載體。磁微粒分離技術(shù)磁微粒分離技術(shù)酶標酶標熒光熒光放免放免發(fā)光發(fā)光靈敏度靈敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的優(yōu)越性化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的優(yōu)越性u靈敏度高靈敏度高：CLIA靈敏度可達10-16/-21mol/L（RIA為10-12mol/L）。又如化學(xué)發(fā)光底物（如AMPPD）可檢測出的堿性磷酸酶的濃度比顯色底物要靈敏50萬倍。

11、幾種標記幾種標記/ /檢測技術(shù)靈敏度的比較檢測技術(shù)靈敏度的比較放免放免酶標酶標熒光熒光發(fā)光發(fā)光線性范圍線性范圍105104103102化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的免疫分析技術(shù)的優(yōu)越性優(yōu)越性幾種標記幾種標記/ /檢測技術(shù)線性范圍的比較檢測技術(shù)線性范圍的比較u線性范圍寬線性范圍寬：發(fā)光強度在46個數(shù)量級之間，與測定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。這與顯色的酶免疫分析吸光度（OD值）為2.0的范圍相比，優(yōu)勢明顯。也優(yōu)于放射免疫分析技術(shù)。酶標酶標熒光熒光放免放免發(fā)光發(fā)光有效期（月）有效期（月）1815129630化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的優(yōu)越性化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的優(yōu)越性幾種標記幾種標記/ /檢測試劑的有效期比較

12、檢測試劑的有效期比較u試劑有效期長試劑有效期長：有效期可長達1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰變，一般有效期只有一個月，而酶免的底物貯存性差，都無法與化學(xué)發(fā)光相比，有效期長可以降低使用成本，利于推廣應(yīng)用。u安全性安全性好好：徹底消除了放射性危害，環(huán)保、安全。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)CLIA的危害性。u光信號持續(xù)時間長光信號持續(xù)時間長：輝光型（glow type）的CLIA產(chǎn)生的光信號持續(xù)時間可達數(shù)小時甚至一天。簡化了實驗操作及測量。容易實現(xiàn)連續(xù)、動態(tài)、重復(fù)測定。u分析方法簡便快速分析方法簡便快速：絕大多數(shù)分析測定均為僅需加入一種試劑（或復(fù)合試劑）的一步法，容易實現(xiàn)自動化。u結(jié)果穩(wěn)定、誤差小結(jié)果穩(wěn)定、誤差?。簶悠废抵苯幼约喊l(fā)光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器等）給分析帶來的影響，使分析結(jié)果靈敏穩(wěn)定可靠。化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的優(yōu)越性技術(shù)的優(yōu)越性u甲狀腺激素甲狀腺激素 u生殖激素生殖激素u腎上腺腎上腺/垂體激素垂體激素 u貧血因子貧