03發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化(精)

1、第三章 發(fā)酵工藝條件的確定主講人：劉萍第三章發(fā)酵工藝條件的確定第一節(jié)培養(yǎng)基的選擇和確定第二節(jié) 培養(yǎng)條件的確定第一節(jié)培養(yǎng)基的選擇和確定 、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分二、培養(yǎng)基的用途-、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇四、培養(yǎng)基成分的營養(yǎng)與作用五、培養(yǎng)基確定方法六、正交試驗在培養(yǎng)基確定中的應用、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分微生物的營養(yǎng)活動，是依靠向外界分泌大量的酶.將周圍環(huán)境中大分子的蛋白質(zhì)、糖類、脂 肪等營養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子化合物，再借助細 胞膜的滲透作用，吸收這些小分子營養(yǎng)來實現(xiàn)的。所有發(fā)酵培養(yǎng)基都必須提供微生物生長繁殖和豔欝鑒隸巔黠跚需要外還必須微生物的營養(yǎng)來源(1)能源自養(yǎng)菌：光；氫，硫胺；亞硝酸鹽，亞 鐵鹽。異養(yǎng)菌：碳水化合

2、物等有機物，石油 天然氣和石油化工產(chǎn)品，如醋酸。產(chǎn)物合成所需的能源，包括碳源、氮源、無機元素、生長因子及水、氧氣等。對于大規(guī)模發(fā)(2)碳源：碳酸氣；淀粉水解糖，糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液石油、正構石蠟，天然氣醋酸、甲醇、乙醇等石油化工產(chǎn)品(3)氮源豆餅或蠶蛹水解液，味精廢液，玉米漿, 酒糟水等有機氮尿素，硫酸錢，氨水，硝酸鹽等無機氮氣態(tài)氮(4)無機鹽磷酸鹽，鉀鹽，鎂鹽，鈣鹽等其他礦鹽鐵、猛、鉆等微量元素其他(5)特殊生長因子硫胺素、生物素、對氨基苯甲酸、肌醇 等 培養(yǎng)基的用途(-)、培養(yǎng)基的分類(二)、發(fā)酵生產(chǎn)中的 培養(yǎng)基類型(一)、培養(yǎng)基的分類(1)按培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學成分 合成培養(yǎng)基、天然培

3、養(yǎng)基。-(2)按物理性質(zhì)固體，液體(3)按用途H選擇性培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、富集培養(yǎng) 基等篩選菌種 保藏菌種 檢驗雜菌 培養(yǎng)種子 發(fā)酵生產(chǎn)(1)天然培養(yǎng)基是采用化學成分還不清楚或化學成分還不恒定的各種植物和動物 組織或微生物的浸出物、水解液等 物質(zhì)(例如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、 蛋白腺等)制成的。適合于各類異養(yǎng)微生物生長， 而一般自養(yǎng)微生物都不能生長。(2)合成培養(yǎng)基是用化學成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制而成 的。成分精確，重復性強，可以減少不能控制 的因素適用于在實驗室范圍作有關營養(yǎng)、代謝、 分類鑒定、生物測定及選育菌種、遺傳分析等 定量研究工作。但一般微生物在合成培養(yǎng)基上生長較慢， 有些微生物

4、營養(yǎng)要求復雜，在合成培養(yǎng)基上不 能生長。(3)半合成培養(yǎng)基多數(shù)培養(yǎng)基配制是采用一部分天然有機物作碳 源、氮源和生長因子的來源，再適當加入一些 化學藥品以補充無機鹽成分，使其更能充分滿 足微生物對營養(yǎng)的需要。大多數(shù)微生物都能在此培養(yǎng)基上生長繁殖。因 此，在微生物工業(yè)生產(chǎn)上和試驗研究中被廣泛 使用。(1)液體培養(yǎng)基：常用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)及生理代謝等基本理論研究工作。發(fā)酵工業(yè)多用作培養(yǎng)種子和發(fā)酵的培養(yǎng)基。根據(jù)微生物對氧的要求情況，分別作靜止 或通風攪拌培養(yǎng)。在菌種篩選工作和菌種培養(yǎng)工作中，也常 用液體培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)微生物在液體培養(yǎng)基中生長的情況有時也 可用作鑒定菌種的參考。(2)固體培養(yǎng)基分類

5、：斜面試管、平板等是在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑配 成的，最常用的凝固劑是瓊脂。生理代AYSeed cufturg |種子發(fā)酵培養(yǎng)作用：固體培養(yǎng)基在菌種的分 離、保藏、菌落特征的觀察、活菌計數(shù)和鑒定菌種方面是 不可缺少的。在制曲、酶制劑、檸檬 酸等生產(chǎn)中，用來培養(yǎng)霉菌 等的固體種子和發(fā)酵培養(yǎng)基是由隸皮等農(nóng)作物加無機元 素等制成的。增殖培養(yǎng)基：可以配制成適合某種微生 物生長而不適合其他微生物生長，從而 達到從自然界分離這種微生物的目的。鑒別培養(yǎng)基：是根據(jù)微生物能否利用培 養(yǎng)基中某種營養(yǎng)成分，借助指示劑的顯 色反應，以鑒別不同種類的微生物。選擇培養(yǎng)基：是在培養(yǎng)基內(nèi)加入某種化 學物質(zhì)以抑制不需要菌的生長

6、，而促進 某種需要菌的生長。o d *8 S（二）、發(fā)酵生產(chǎn)中的培養(yǎng)基類型工業(yè)發(fā)酵中培養(yǎng)基往往是依據(jù)生產(chǎn) 流程和作用分為：斜面培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)基1.斜面培養(yǎng)基作用：這是供微生物細胞生長繁殖用 的，包括細菌，酵母等的斜面培養(yǎng)基 以及霉菌、放線菌生抱子培養(yǎng)基或隸 曲培養(yǎng)基等。這類培養(yǎng)基主要作用是 供給細胞生長繁殖所需的各類營養(yǎng)物 質(zhì)。特點： 1 富含有機氮源，少含或不含糖分。有機氮有 利于菌體的生長繁殖，能獲得更多的細胞。 2.對于放線菌或霉菌的產(chǎn)孑包子培養(yǎng)基，則氮源 和碳源均不宜太豐富，否則容易長菌絲而較少 形成抱子。 3斜面培養(yǎng)基中宜加少量無機鹽類，供給必要 的生長因子和微量

7、元素。2.種子培養(yǎng)基（包括搖瓶種子和小罐種子培養(yǎng)基）：培養(yǎng)種子的目的： 1擴大培養(yǎng)，增加細胞數(shù)量；同時也必須培養(yǎng)出強壯、健康、活性高 的細胞。為了使細胞迅速進行分裂或菌 絲快速生長。種子培養(yǎng)基特點：1.必須有較完全和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，特別需要 充足的氮源和生長因子。2.種子培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度不必太高。 供抱子發(fā)芽生匕用的種了培養(yǎng)基，可添加一些 易被吸收利用的碳源和氮源。3.種子培養(yǎng)基成分還應考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主 要成分相近。3.發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基是發(fā)酵生產(chǎn)中最主要的培養(yǎng)基， 它 不僅耗用大量的原材料，而且也是決定發(fā)酵生 產(chǎn)成功與否的重要因素。（1）根據(jù)產(chǎn)物合成的特點來設計培養(yǎng)基：對菌體

8、生長與產(chǎn)物相偶聯(lián)的發(fā)酵類型，充 分滿足細胞生長繁殖的培養(yǎng)基就能獲得最大的 產(chǎn)物。對于生產(chǎn)氨基酸等含氮的化合物時，它的 發(fā)酵培養(yǎng)基除供給充足的碳源物質(zhì)外，還應該 添加足夠的鞍鹽或尿素等氮素化合物。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度應 盡可能高些，這樣在同等或相近的轉(zhuǎn)化 率條件下有利于提高單位容積發(fā)酵罐的 利用率，增加經(jīng)濟效益。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基需耗用大量原料，因此,原料來源、原材料的質(zhì)量以及價格等必 須予以重視。三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇(1)必須提供合成微生物細胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基 本成分。(2)有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗，即提高單位營養(yǎng)物質(zhì)所合成產(chǎn)物數(shù)量或最大產(chǎn)率。(3)有利于提高培養(yǎng)基和產(chǎn)物的濃度，

9、以提高 單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。(4)有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周 期。(5)盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的 分離純化。(6)原料價格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易。-7)所用原料盡可能減少對發(fā)酵過程中通 氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率， 降低能耗。(8)有利于產(chǎn)品的分離純化，并盡可能減 少產(chǎn)生“三廢”的物質(zhì)。發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和注意事項1.提供必要的營養(yǎng)成分：培養(yǎng)基成分必 須滿足細胞生長，代謝活動和合成產(chǎn)物 所需的基本要求。2.配制合適的濃度： 可以從發(fā)酵動力學 有關生長、產(chǎn)物合成和基質(zhì)利用物料平 衡的關系中大致推算所需原料或大致計算出所需主要原料的需要量。.3.主成分與其他成分的配比

10、。 4.控制合適的pH：微生物的生長繁殖或 產(chǎn)物的合成往往需要一定的pH環(huán)境，在 最適pH值下有利于加快各種酶的反應。 因此在整個發(fā)酵過程中應使培養(yǎng)基的pll適合于微生物生長或產(chǎn)物合成所需。pH的具體控制方法 1.可以在微生物培養(yǎng)過程中加入酸或堿或流加*某些營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH,但更應在配制 培養(yǎng)基時考慮所用營養(yǎng)物質(zhì)的組成成分，使其pH 值適合該微生物生長或合成代謝產(chǎn)物的需要。 2.還要注意有些營養(yǎng)物質(zhì)被利用后培養(yǎng)基的 pH 變化情況. 3.控制pH最常用的方法是在培養(yǎng)基中添 加具有一定緩沖能力的物質(zhì)作為營養(yǎng)物，如以磷酸鹽作為磷的成分； 或者避免使 用容易產(chǎn)生生理酸性或堿性使培養(yǎng)基pH波

11、動太大的物質(zhì)。 4.避免產(chǎn)生微生物不能利用的物質(zhì)或形成沉 淀葡萄糖與錢鹽或氨基酸的氨基在滅菌高溫下作 用形成深褐色物質(zhì)。這種物質(zhì)不被微生物利用。 因此這兩類營養(yǎng)物不宜直接配在一起進行滅菌, 而應釆用分開滅菌后再加入發(fā)酵罐內(nèi)。硫酸鍍中的 SC 與鈣鹽易形成難溶的硫酸鈣， 因此二者也不宜直接配成培養(yǎng)基。 5.注意代謝調(diào)節(jié)物的影響：有些物質(zhì)存在于培養(yǎng)基中往往能明顯地促進或 抑制發(fā)酵產(chǎn)物的形成。前體物質(zhì)誘導劑阻遏物抑制劑金屬離子(1)添加有關前體物質(zhì)：前作物質(zhì)：是指當添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中 的某些化學物質(zhì)基本上不改變其分子結(jié) 構而直接進入產(chǎn)物中的小分子物質(zhì)，從 而在一定條件下控制產(chǎn)物的合成方向和 提高產(chǎn)量

12、。在發(fā)酵中添加前體物質(zhì)將有利于產(chǎn)物的 合成和顯著提高產(chǎn)量，如苯乙酸及其衍 生物被認為是青霉素的前體物質(zhì)。(2)添加誘導物：目前工業(yè)用微生物酶多數(shù)為誘導酶，如蛋白酶、 淀粉酶、纖維素酶等。誘導物的存在能大大強化誘導酶的生物合成。酶的正常底物或底物的類似物都可作為誘導物在各種微生物酶的發(fā)酵培養(yǎng)基中必須加入誘導 物，例如淀粉、糊精或麥芽糖是淀粉酶或糖化 酶的誘導物。只有添加這些物質(zhì)的培養(yǎng)基，才 能獲得高產(chǎn)。注意阻遏物或抑制劑的影響培養(yǎng)基中存在反饋阻遏物或分解阻遏物 均能影響酶的合成，降低發(fā)酵產(chǎn)量。有些酶的抑制劑卻能提高某些代謝產(chǎn)物 的產(chǎn)量，最早利用抑制劑提高中間代謝 物產(chǎn)量的例子是甘油發(fā)酵中加入亞硫

13、酸 鈉。在培養(yǎng)基配制時必須注意加入有益的抑 . 制劑，而避免混入有害的抑制物。 6.金屬離子的影響：有些種類的發(fā)酵生產(chǎn)對金屬離子相當敏感，因 為有些金屬離子是中間代謝酶的抑制劑或激活 齊 I。因此對于有重大影響的金屬離子必須嚴格控制。 如檸檬酸發(fā)酵中鐵、鐳和鋅離子都能明顯影響 產(chǎn)量，鈣離子對細菌淀粉酶的生產(chǎn)有促進作用，而鉆離子對葡萄糖異構酶的發(fā)酵是必需的，這 些在培養(yǎng)基配制時都必須予以注意。四、培養(yǎng)基組成物質(zhì)的營養(yǎng)與作用碳素化合物氮素化合物 zK-微量元素（無機鹽類）-生長因子碳素化合物營養(yǎng)源對微生物生長發(fā)育的影響(1)碳素化合物的作用構成菌體成分的重要元素,(2)碳源種類糖：單糖中的己糖，寡

14、糖中的蔗糖、麥 芽糖、棉子糖，多糖中的淀粉、纖維素、 半纖維素、甲殼質(zhì)和果膠質(zhì)等，其中淀 粉是大多數(shù)微生物都能利用的碳源。 有機酸如糖酸、檸檬酸、反丁烯二酸、 琥珀酸、蘋果酸、丙酮酸、酒石酸等。產(chǎn)同時又是化能異養(yǎng)型微生物的能量來源。醇類中甘露醇、甘油、低濃度的乙醇。脂肪酸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低級脂肪 酸都可用作碳源。油酸和亞油酸等高級脂肪酸 可被不少放線菌和真菌作為碳源和能源利用， 低濃度的高級脂肪酸可刺激細菌生長，但濃度 較高時往往有毒害作用。正烷炷：一般是指從石油裂得到的 14C 至 18C 的 直鏈烷炷混合物。葡萄糖：是最易利用的糖，并且作為加速微生物 生長的一種有效的糖。過多的葡

15、萄糖會過分加速菌體的呼吸， 以致培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要。糖蜜： 是制糖廠生產(chǎn)糖時的結(jié)晶母液， 是蔗糖 廠的副產(chǎn)物。含有較豐富的糖、氨素化合物和 無機維生素等，是微生物工業(yè)的價廉物美的原 料。淀粉：一般要經(jīng)菌體產(chǎn)生的胞外酶水解成單糖 后再被吸收利用。可克服葡萄代謝過快的弊病。 來源豐富，價格比較低廉。常用的為玉米淀粉、 小麥淀粉和甘薯淀。油和脂肪：在微生物分泌的脂肪酶作用 下水解為甘油和脂肪酸， 在溶解氧的參 與下， 氧化成水和CO2。因此用脂肪作 碳源時需比糖代謝供給更多的氧。(2)氮素化合物氮是構成微生物細胞蛋白質(zhì)和核酸的主 要元素，而蛋白質(zhì)和核酸是微生物原生 質(zhì)的主要組成部分。氮素一般不提供能 量，但硝化細菌卻能利用氨作為氮源和 能源。就某一類微生物而言，由于其合成能力 的差異，對氮營養(yǎng)的需要也有很大區(qū)別。氮的來源可分為無機氮和有機氮：有機氮源：花生餅粉、黃豆餅粉、棉子 餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白腺、酵母膏、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲 體和酒糟等。 它們在微生物分泌的蛋白酶作用下， 水解成氨基酸，被菌體進一步分解代謝。有機氮源特點：含有豐富的蛋