雜草抗藥性檢測(cè)方法

1、會(huì)計(jì)學(xué)1雜草抗藥性檢測(cè)方法雜草抗藥性檢測(cè)方法抗藥性雜草的形成ALS抑制劑：ACCase抑制劑：其他除草劑：1/100,000？1/1,000,000 ？1/10,000,000 ？激素類&草甘膦： 1/100,000,000 ？除草劑選擇壓Heap，2015大穗看麥娘標(biāo)本。此標(biāo)本于1876年5月在俄國(guó)的葡萄園內(nèi)采集而來(lái)，保存在日內(nèi)瓦的植物公園內(nèi)（瑞士）。這個(gè)標(biāo)本為Alopecurusagrestis，是A. myosuroides（大穗看麥娘）以前的名稱樣本：734個(gè)；DNA提取不成功：49個(gè)；成功的：685個(gè)在采集于1888年的一株大穗看麥娘內(nèi)檢測(cè)出除草劑抗性ACC酶Leu1781等

2、位基因（法國(guó)）。1781突變生長(zhǎng)更旺盛？低劑量下 Lolium rigidum快速形成抗藥性Neve and Powles (2005) Theor Appl Genet抗藥性形成影響因素除草劑選擇壓（頻度，劑量）生態(tài)適合度基因流（花粉.）抗性基因型的初始頻度抗藥性機(jī)理研究靶標(biāo)抗性非靶標(biāo)抗性突變過(guò)量表達(dá)代謝吸收、傳導(dǎo)隔離靶標(biāo)突變除草劑靶標(biāo)酶除草劑靶標(biāo)酶靶標(biāo)過(guò)量表達(dá)除草劑靶標(biāo)酶靶標(biāo)抗性雜草 ALS抑制劑抗性 ACCase抑制劑抗性 草甘膦抗性 雜草對(duì)ALS抑制劑的抗性 約159種抗性雜草ALS 突變位點(diǎn)205376 377 574653654交互抗性？http:/www.weedscience.

3、org編碼區(qū)全長(zhǎng) 2000bp標(biāo)準(zhǔn)參照：擬南芥內(nèi)含子、基因拷貝數(shù)？122 197雜草對(duì)ACCase抑制劑的抗性 約48種抗性雜草CTBCCBCTPBC: biotin carboxylase 生物素羧化酶BCC: biotin carboxyl carrier 生物素羧基載體蛋白CT: carboxyl transferase 羧基轉(zhuǎn)移酶質(zhì)體 ACCase:同質(zhì)型：敏感ACCase: 2000 aa異質(zhì)型：不敏感ACCase 基因突變位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)參照：鼠尾看麥娘 A. myosuroidesPowles and Yu, 2010 Ann Rev Plant biologyShiv Shankhar

4、 KaundunPest Manag Sci 2010; 66: 12491256Lolium multiflorum精噁唑禾草靈APP炔草酯APP烯草酮CHD唑啉草酯PPZ日本看麥娘對(duì)3類ACCase抑制劑的交互抗性模式S2027位突變1781位突變Cui et al., Weed Technology 2015 29:444450草甘膦抗性cDNA分析；基因拷貝數(shù)是敏感的8倍，拷貝數(shù)和表達(dá)量呈現(xiàn)正相關(guān)；Palmer amaranth (Amaranthus palmeri)Gains et al. 2010 PNASEPSPS gene amplification and glyphosa

5、teresistance草甘膦抗性一個(gè)多抗性案例：牛筋草同時(shí)抗glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicidesJALALUDINA, YU Q & POWLES SB (2015). Multiple resistance across glufosinate,glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population.Weed Research 55, 8289.抗藥性雜草檢測(cè)方法 生物測(cè)

6、定方法整株測(cè)定（盆栽）種子測(cè)定法花粉管萌發(fā)法瓊脂法 靶標(biāo)抗性的快速分子檢測(cè)測(cè)序PCRPCR+酶切LAMP。種子采集、整理、保存雜草抗藥性水平檢測(cè)l 整株植物測(cè)定法（劑量反應(yīng)曲線Dose response experiments）通過(guò)整株雜草生物量對(duì)除草劑系列濃度的反應(yīng)，建立劑量與生物量的關(guān)系，以地上部生物量受藥劑的抑制程度來(lái)評(píng)價(jià)其對(duì)除草劑抗性。生長(zhǎng)抑制中量 使雜草地上部鮮重比不用藥處理降低50%的藥劑劑量計(jì)算抗性指數(shù)敏感抗性-1抗性-2抗性-3Shiv Shankhar Kaundun PestManag Sci 2010; 66: 12491256生物測(cè)定20g a.i./ha苯磺隆用藥后2

7、1天MP11-3#敏感MP11-6#抗MP11-7#抗2（河北）/16（河北、山東、河南、陜西）吡嘧磺隆20g a.i./ha為1倍劑量01/641/321/161/81/41/2124816倍生物測(cè)定生物測(cè)定雜草抗藥性檢測(cè)l 種子生物測(cè)定法通過(guò)種子在一定濃度梯度除草劑中的萌發(fā)率或胚根（胚芽）長(zhǎng)度，建立劑量與雜草發(fā)芽（長(zhǎng)度）的關(guān)系。種子測(cè)定法檢測(cè)不同日本看麥娘種群對(duì)高效氟吡甲禾靈的抗性水平 (A-F種群)楊彩宏，等. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007,40（12）：2759-2765.lRISQ （Resistance in Season Quick ）快速檢測(cè)法2011，在當(dāng)季對(duì)田間疑似抗性植株進(jìn)行

8、早期診斷，根據(jù)診斷結(jié)果給出合理用藥方案與一定體積的水混合吸干表面水分加熱溶解植株分開，洗凈根部泥土溫度降至60度，加除草劑混勻后倒入培養(yǎng)皿等容器稱取瓊脂粉移栽到培養(yǎng)基lRISQ （Resistance in Season Quick ）快速檢測(cè)法培養(yǎng)容器發(fā)芽盒培養(yǎng)皿三角瓶組培專用容器精噁唑禾草靈的檢測(cè)濃度為0.4uM精噁唑禾草靈劑量為：0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0菵草用花粉檢測(cè)看麥娘對(duì)ACCase類除草劑的靶標(biāo)抗性隨著芳氧苯氧丙酸類除草劑的濃度的增加，三個(gè)種群的花粉萌發(fā)情況受到顯著影響。A為精惡唑禾草靈；B炔草酸；S為敏感種群；Rm為中度抗性或非抗性；Rh1和Rh1為分

9、別對(duì)芳氧苯氧丙酸類和環(huán)己烯酮類具有高抗性的種群；Weed Research， 2000，40, 151162培養(yǎng)基中預(yù)先添加了120微摩爾/升的fenoxaprop，對(duì)芳氧苯氧丙酸類除草劑具有高抗種群的花粉仍能萌發(fā)。靶標(biāo)抗性的快速分子檢測(cè)測(cè)序方法：準(zhǔn)確，多位點(diǎn)很好的選擇基于酶切方法：CAPS(dCAPS)基于PCR的方法：PASA微測(cè)序方法：SNaPshotLAMP。l 靶標(biāo)酶基因突變位點(diǎn)測(cè)定-適用于靶標(biāo)酶基因突變引起的抗性Genbank：/查詢序列設(shè)計(jì)引物：（Primer、DNAMAN、DNAstar、Oligo）PCR擴(kuò)增：（溫度梯度PC

10、R）模板：DNA、RNA序列分析：直接測(cè)序、克隆測(cè)序兩端序列獲得：RACE、 Genome Walking.拼接和完整序列擴(kuò)增明確突變位點(diǎn)l 靶標(biāo)酶基因突變位點(diǎn)測(cè)定-適用于靶標(biāo)基因突變引起的抗性測(cè)序法122197205376 377 574653654播娘蒿、薺菜、雨久花、野慈姑、日本看麥娘、菵草等大部分雜草中已證實(shí)突變是其產(chǎn)生抗性主要原因編碼區(qū)全長(zhǎng) 2000bp標(biāo)準(zhǔn)參照：擬南芥ALS基因抗藥性突變位點(diǎn)Cui et al.,Pesticide Biochemistry and Physiology ，2012， 102 ：229-232.ABC

11、DALS 197位ALS 574位EF不同基因型的峰圖A、E：敏感基因型C、D、F：抗性基因型B：雜合基因型R:S=1:1R:S=1:3R:S=1:5抗性和敏感性基因以一定比例混合后檢測(cè)結(jié)果dCAPS:(cleaved amplified polymorphicsequence，CAPS)或dCAPS (derived CAPS)PCR與限制性酶切相結(jié)合DE LYE C & BOUCANSAUD K (2008). A molecular assay for the proactivedetection of target site-based resistance to herbic

12、ides inhibiting acetolactatesynthase in Alopecurus yosuroides. Weed Research 48, 97101.dCAPS:PASA:等位基因特異性PCR技術(shù)（allele-specific amplification,PASA）(bidirectional PCR amplification of specific alleles,Bi-PASA)也稱為AS-PCR ,Allele Specific PCR關(guān)鍵：PCR引物設(shè)計(jì)，錯(cuò)配堿基設(shè)計(jì)PCR條件摸索，包括引物濃度等基本原理Plant Molecular Biology Rep

13、orter 21: 281288, September 2003Barley環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)LAMP(loop-mediatedisothermal amplification)2000年由日本開發(fā)的新型核酸體外擴(kuò)增技術(shù)未來(lái)應(yīng)用精準(zhǔn)、簡(jiǎn)便、快速試劑盒謝謝！聯(lián)系方式：崔海蘭雜草對(duì)ALS抑制劑的抗性 約159種抗性雜草CTBCCBCTPBC: biotin carboxylase 生物素羧化酶BCC: biotin carboxyl carrier 生物素羧基載體蛋白CT: carboxyl transferase 羧基轉(zhuǎn)移酶質(zhì)體 ACCase:同質(zhì)型：敏感ACCase: 2000 aa異質(zhì)型：不敏感生物測(cè)定20g a.i./ha苯磺隆用藥后21天MP11-3#敏感MP11-6#抗MP11-7#抗2（河北）/16（河北、山東、河南、陜西）lRISQ （Resistance in Season Quick ）快速檢測(cè)法2011，122197205376 377 574653654播娘蒿、薺菜、雨久花、野慈姑、日本看麥娘、菵草等大部分雜草中已證實(shí)突變是其產(chǎn)生抗性主要原因編碼區(qū)全長(zhǎng) 2000bp標(biāo)準(zhǔn)參照：擬南芥ALS基因抗藥性突變位點(diǎn)Cui et al.,Pesticide Bioch