分子生物學(xué)方法在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用

1、年第期月出版tr品工程© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版分子生物學(xué)方法在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用土鑫車振明黃韜睿兩華大學(xué)生物工種學(xué)院成都© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishi

2、ng House. All rights reserved, 年第期月出版© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版摘 耍 綜述了食品中病原微生物的快速檢測(cè)方 法詳述r 技術(shù)和基岡芯片這兩種技術(shù)的研究 進(jìn)展并對(duì)這兩種方法特點(diǎn)與應(yīng)用進(jìn)行了探討。關(guān)鍵詞 僅品安全 微生物 基因芯片 檢 測(cè)方法在 年 我國(guó)食品安全事件頻發(fā) 福壽螺 爭(zhēng)件、人造蜂蜜事件、毒豬油事件、多寶他爭(zhēng)件等 等都再次給人們敲響了食品安全的警鐘。隨著食品 匸業(yè)的發(fā)展以及對(duì)食品安全的巫視傳

3、統(tǒng)分析方法 已經(jīng)遠(yuǎn)不能滿足食品檢測(cè)的需耍迫切盂耍靈敏度 更高、特界性更強(qiáng)、簡(jiǎn)便快捷的fr品安全檢測(cè)技術(shù) 和方法因此近年來世界國(guó)的許多機(jī)構(gòu)和學(xué)者 都致力于快速檢測(cè)技術(shù)和方法的研究 改進(jìn)和開發(fā) 了一些快速的檢測(cè)技術(shù)和方法 現(xiàn)將兒種主耍方法 概述如下。技術(shù) 技術(shù)即聚合福 王鑫女年出生西華大學(xué)生物丁程學(xué)院在讀碩I：研究生。收稿日期鏈?zhǔn)椒磻?yīng)也稱無細(xì)胞克隆系統(tǒng)是 年誕生的 一項(xiàng) 體外擴(kuò)増技術(shù) 該技術(shù)自問世以來 就以 驚人的速度廣泛地應(yīng)用丁生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域。前 在食品工程領(lǐng)域中致病性微生物、轉(zhuǎn)卑因tr品的檢測(cè) 等方面的應(yīng)用也越來越受關(guān)注。技術(shù)的基本原理與方法技術(shù)是一種利用變性與復(fù)性原理在體外利用聚合酶活性

4、在引物的引導(dǎo)和脫氧核糖核口酸等參與下將模板在數(shù)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行百萬倍擴(kuò)増。該技術(shù)利用兩段寡核口酸作為 反應(yīng)的引物以及四種脫氧核昔三磷酸 、 聚合師作為反應(yīng)物將提取到的 稱為模 板片段精確擴(kuò)増。該酚促反應(yīng)最基本的個(gè)環(huán)節(jié)是模板 的變性即在°C下模板雙 鏈變?yōu)閱捂溡锱c模板鏈的特異性復(fù)性由聚合幽催化引物引導(dǎo)璉山 向 延伸從而完成一個(gè)變性復(fù)性延伸 的 循環(huán)。至此完成了的第一輪反應(yīng) 而后反復(fù)進(jìn)行變性、復(fù)性和延伸的循環(huán) 從而使擴(kuò)増 產(chǎn)鼠呈指數(shù)上升。技術(shù)在食品微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用單核細(xì)胞増多性李斯特氏菌單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌是一種巫耍的人備共患病致病病菌 能引起人和動(dòng)物腦膜炎、敗血癥及孕婦流產(chǎn)等 且

5、死亡率極高可達(dá) 。 廣泛存在于動(dòng)物、水產(chǎn)品等中 主要通過食物進(jìn)行傳播。過去對(duì) 食胡中進(jìn)行檢測(cè)時(shí)克隆培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法需耍周的時(shí)間才能得出結(jié)果血涓學(xué)檢測(cè)方法如等也存在著特異性、敏感性差等問題 技術(shù)的出現(xiàn)給李氏菌的檢測(cè)帶來J'曙光。姜永強(qiáng)等 根據(jù)發(fā)農(nóng)的單核細(xì)胞増生性李斯特菌的巫耍毒力基 因的全皋囚字列 設(shè)計(jì)出引物 建立了該菌的 診斷方法。金大智等運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光技術(shù)建立對(duì)食晶中單増李氏菌進(jìn)行檢 測(cè)的快速方法 設(shè)計(jì)的引物和探針的序列特異性 強(qiáng)省去凝膠電泳的繁瑣降低了污染的可能性。 對(duì) 種病原進(jìn)彳j的檢測(cè)結(jié)果表明用實(shí)時(shí)熒光 法檢測(cè)單核細(xì)胞增多李斯特氏菌 更快速、敏 感、特異性更離。金黃色葡萄球菌金黃色

6、葡萄球菌腸帝素 可引起人類中毒 其內(nèi)毒素一中毒休克綜合癥毒素 可引起中 毒休克綜合癥產(chǎn)生的脫皮毒索 、 與一系 列膿皰性匍籀球菌感染有關(guān)。等建立了檢測(cè)上述毒素叢因的 技術(shù)可在較短的時(shí)間內(nèi)檢 測(cè)出匍轉(zhuǎn)球菌莓株并ILJI有極高的特異性、敏感 性。國(guó)內(nèi)2；泓若等選擇腸毒素基因的第 堿基為上游引物 第 堿基為下 游引物應(yīng)用 技術(shù)擴(kuò)增出 基因的 長(zhǎng)的 片段并建立了肖接利用細(xì)繭裂解液作 為模板的方法。沙門氏菌等根據(jù)腸炎沙門氏菌克隆株貝有的屬特異性序列片段設(shè)計(jì)出一對(duì)引物能快速地檢測(cè)出肉食品標(biāo)本中的沙門氏繭檢測(cè)的 敏感性和特異性均為這保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。沈孝民用技術(shù)對(duì)各種不同血消型的沙f J繭和C知被該菌污染

7、的魚粉和動(dòng)物產(chǎn)品的肉湯培養(yǎng)物 進(jìn)行了檢測(cè) 結(jié)果顯示該方法特異性高 IL靈敬、 快速并可在 之內(nèi)完成。腸弗素大腸桿菌腸毒素大腸桿菌簡(jiǎn)稱耐熱菌是一種嗜熱、嗜 酸、好氧的細(xì)甫能從濃縮蘋果汁中分離得到該 繭能經(jīng)受巴氏殺菌而存活嚴(yán)巫影響濃縮果汁的胡 質(zhì)國(guó)際上已有多起耐熱菌導(dǎo)致犬規(guī)模果汁敗壞事 件的報(bào)道。目前國(guó)際上耍求每蘋果濃縮汁中耐熱葡含帚小T 耐熱菌超標(biāo)已成為制約我國(guó)濃 縮蘋果汁出口的主耍障礙之一。H前對(duì)耐熱繭的檢 測(cè)方法仍為常規(guī)的培養(yǎng)檢測(cè)法耗時(shí)很長(zhǎng)一般需 耍 才能出檢測(cè)報(bào)告。檢測(cè)結(jié)果的滯后性使 Z無法及時(shí)指導(dǎo)生產(chǎn)無法及時(shí)向生產(chǎn)線反饋信息 以采取相應(yīng)的防范、控制與淸洗措施.技術(shù)能使微最的核酸在數(shù)小時(shí)之

8、內(nèi)擴(kuò)増至 原來的數(shù)白力倍以上只耍選擇適合的引物就可 特異性地人量擴(kuò)增某一特定的 片斷至易檢測(cè) 水平 因此理論上可以通過特異性地?cái)U(kuò)增耐熱菌的 基因片斷而對(duì)其實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。技術(shù)存在的主要問題及展望技術(shù)雖為一種快速、特異、靈敏、簡(jiǎn)便、 高效的檢測(cè)新技術(shù)但其在食品中致毒、致病性微 生物檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用中也存在不少問題必須認(rèn)真 分析乞種JI體情況采取必耍的措施以提高反應(yīng) 的特斤件和做感件避兔假陽(yáng)件或假陽(yáng)件結(jié)果。污染問題是一種極為靈敏的反應(yīng)一旦有極少臬外 源性 污染就可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果所以在 操作時(shí)必須加以注意。假陰性問題僅品是復(fù)雜的反應(yīng)基質(zhì)影響 反應(yīng)的因索 很多如果不能冇效排除各影響因素的干擾很可 能出現(xiàn)

9、假陰性結(jié)果。此外如果在 操作過程中 各種實(shí)驗(yàn)條件控制不當(dāng)很容易導(dǎo)致產(chǎn)物突變也 會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。對(duì)于這些問題必須有充分的考 慮和排除措施。引物設(shè)計(jì)及靶序列選擇引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇是決定 結(jié)果的 關(guān)鍵因素引物不同則擴(kuò)増物不同如果引物的設(shè) 計(jì)不當(dāng)則直接彩響對(duì)關(guān)鍵靶序列的選擇降低檢測(cè)的靈敏度和特異性真至完全失敗。岡 而必須對(duì)擴(kuò)增序列有充分的了解并規(guī)范 實(shí) 驗(yàn)室操作技術(shù)。盡竹 技術(shù)在tr品的微生物安全性檢測(cè)方面 還存在著一些問題 但相信隨著研究的深入 這項(xiàng) 技術(shù)必將得以完善并迅速成為可以信賴的快速檢 測(cè)手段?；蛐酒夹g(shù)朋因芯片技術(shù)是鑒別微生物和轉(zhuǎn)展因成分厳有 效的手段之一 為全而、快速、球確地進(jìn)

10、行伶品安 全檢測(cè)提供了一個(gè)嶄新的平臺(tái)。慕因芯片 芯 片、 微陣列技術(shù)是近十兒年來在生命科學(xué)領(lǐng) 域迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)是一項(xiàng)基于基因 農(nóng)達(dá)和堆肉功能研究的革命性技術(shù) 他綜合了分子© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版王鑫分屮生物學(xué)方仏在僅胡安全檢測(cè)中的應(yīng)川© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期

11、月出版© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版生物學(xué)、半導(dǎo)體微電子、激光、化學(xué)染料等領(lǐng)域的 垠新科學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)和信息科學(xué)之.間架起了 道橋梁 是當(dāng)今世界上高度交義、髙度綜介的詢 沿學(xué)科和研究熱點(diǎn)。LI前基因芯片正在成為獨(dú)品和 僅品原料檢測(cè)中一種較新的方法檢測(cè)僅品的營(yíng)養(yǎng) 成分監(jiān)骨僅品的衛(wèi)生、安全和ft品質(zhì)杲保證人 類健廉并FI將對(duì)整個(gè)食品領(lǐng)域產(chǎn)生深刻的影響。宰內(nèi)芯片技術(shù)的基本原理與先進(jìn)性將各種基因寡核伴酸點(diǎn)樣F芯片表面微生物 樣品 經(jīng) 擴(kuò)增后

12、 制備熒光標(biāo)記探針 然 后再與芯片上的寡孩疔酸點(diǎn)朵交最后通過扌3描儀 定量和分析熒光分布模式來確定檢測(cè)樣品是否存在 某些特定微生物.該技術(shù)可檢測(cè)各種介質(zhì)中的微牛物研究復(fù)雜 微生物群體的皋兇農(nóng)達(dá)。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法細(xì)肅培 養(yǎng)、生化鑒定、血消分型等相比 皐岡芯片技術(shù)的 先進(jìn)性主耍體觀在 基因芯片可以實(shí)現(xiàn)微生物的 鬲通量和并行險(xiǎn)測(cè)-次實(shí)驗(yàn)即可得出全部結(jié)果 操作簡(jiǎn)便快速幣個(gè)檢測(cè)只而 基本可以出結(jié) 果而傳統(tǒng)方法一般需特異性強(qiáng)敏感性高。宰因芯片技術(shù)在食胡微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用Cr品衛(wèi)生檢測(cè)中一個(gè)重耍的方面是及時(shí)準(zhǔn)確的 檢測(cè)出仃胡中的病原性微生物 這些致病微t物的 存在會(huì)嚴(yán)巫威協(xié)人類的健康.不潔或音帶有致病菌

13、的fr品不僅造成大的經(jīng)濟(jì)損欠 還會(huì)嚴(yán)!（危害消 費(fèi)者的健康 從食品的生產(chǎn)、加匸、運(yùn)輸、銷倚、 消費(fèi)的各個(gè)環(huán)節(jié)都極易被各種病菌污染。統(tǒng)計(jì)農(nóng)明在抽檢的一部分負(fù)胡中過去年由于受致 病菌污染而從市場(chǎng)上撤回的tr品數(shù)屋增加了 倍。中國(guó)在加入后而臨同樣的問題過去年中不僅發(fā)現(xiàn)了許多新的病菌而且一些已知病菌 也出現(xiàn)了抗性増強(qiáng)的趨勢(shì)以前被認(rèn)為無害的微生 物在獲得致病基因和抗性厲也會(huì)導(dǎo)致許多致命的疾 病。由r缺乏介適的檢測(cè)方法這些致病繭即使偶 爾出現(xiàn)在食品屮也不能及時(shí)被檢測(cè)m來對(duì)人類 健康造成-定的威脅。僅品微生物的檢驗(yàn)是確保茂 品質(zhì)鼠和安全的重耍于段因此加強(qiáng)對(duì)有書病菌的 篩選與檢測(cè)可有效防11：倉(cāng)品被并種微生物

14、特別是 致病菌的污染和各種傳染病的蔓延。傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)檢測(cè)方法需耍經(jīng)過兒天的微生 物培養(yǎng)和復(fù)雜的計(jì)數(shù) 操作繁朵 不能及時(shí)反映生 產(chǎn)過程或銷售過程中的污染情況且靈敏度不高使得食品的安全檢測(cè)潛在一定的危險(xiǎn)給消費(fèi)者帶 來很大的威脅法快速比前者靈敏但成本高假陽(yáng)性多也不是很好的檢測(cè)食品微生物污染 的方法?；蛐酒蓮V泛的應(yīng)用于各種導(dǎo)致食卅| 敗的致病菌的檢測(cè) 該技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏 等優(yōu)點(diǎn)可以及時(shí)反映食品中微生物的污染情況。 國(guó)內(nèi)外都已開始食品微生物檢測(cè)芯片的研究 并収 得了一些肯定的結(jié)論?；鶎酒瑢Ｒ恍院媚軌?qū)κ澈形廴镜奈⑸?物實(shí)現(xiàn)快速的在線檢測(cè)及時(shí)反映茂品屮存在的問 題為危害分析的關(guān)鍵控制點(diǎn)提

15、供可行的權(quán)威性報(bào)告。芯片還能對(duì)農(nóng)作物致病繭包括病帶、細(xì) 菌、直菌和線蟲迅速作出檢測(cè)常常能達(dá)到株或?qū)?的水平保證食胡原料的安全性能對(duì)畚類、水產(chǎn) 類進(jìn)行微生物檢測(cè) 鑒別乳制品的好壞 檢測(cè)肉制 品的優(yōu)劣 真實(shí)判斷肉混合制品中某種成分的數(shù) 量。從 年開始我國(guó)每年都會(huì)爆發(fā)對(duì)蝦流行 性病帝病其危書是災(zāi)難性的中國(guó)科存院海洋所 的徐洪濤借助 雜交技術(shù)將該病即的 作 成探針進(jìn)行雜交從分子牛物學(xué)角度證明白斑病毒 感染是造成中國(guó)大陸對(duì)蝦連年爆發(fā)流行 病的主耍原 因?；蛐酒夹g(shù)存在的問題與展魁存在問題展內(nèi)芯片技術(shù)的研究和應(yīng)用前景十分誘人但 作為一項(xiàng)新技術(shù) 仍有一些問題需耍解決 該技 術(shù)需要大量的已測(cè)知的、準(zhǔn)確的 、

16、片段的信息 他們使該技術(shù)成為人規(guī)模、集成化和整體 獲取生物信息的仃效手段*亍芯片制作工藝復(fù) 雜 信號(hào)檢測(cè)也需專門的儀器設(shè)備 一般實(shí)驗(yàn)室難 以承擔(dān)其高昂的費(fèi)用樣品制備和標(biāo)記比較復(fù) 朵沒有一個(gè)統(tǒng)一的質(zhì)鼠控制標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室不能 共享數(shù)據(jù)和資料庫(kù)等。這些都在一定程度上限制了 基因芯片技術(shù)在食晶檢測(cè)中的應(yīng)用。解決方法與發(fā)展方向?yàn)槭贡耙蛐酒蔀閷?shí)驗(yàn)室研究或?qū)嵺`中可以普 遍采用的技術(shù) 須從以下兒方面著手解決問題 提高慕因芯片的特井件、幣:宜性簡(jiǎn)化樣品制備 和標(biāo)記操作 増加信號(hào)檢測(cè)的靈敏度 研制和 開發(fā)高度集成化的樣胡制備、基因擴(kuò)増、孩酸標(biāo)記 及檢測(cè)儀器。另外食胡及食品原料中不斷出現(xiàn)的 新轉(zhuǎn)入?yún)惨蚣癈T晶病原微生

17、物的復(fù)雜化也是茂品檢測(cè)中應(yīng)用基丙芯片技術(shù)需耍解決的問題?；蛐酒夹g(shù)盡管存在一定的不足和局限但 該技術(shù)八仃檢測(cè)系統(tǒng)微型化、檢測(cè)樣胡微磺化的特 點(diǎn)同時(shí)兼I檢測(cè)效率高、能同時(shí)分析多種基因或 診斷 序列的優(yōu)勢(shì)很適丁僅品中病原微生物 和轉(zhuǎn)展因成分的檢測(cè)及鑒定隨著研究的不斷深入 和技術(shù)的完善基因芯片技術(shù)一足會(huì)在食品科學(xué)研 究領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)核酸探針技術(shù)核酸探針是指帶有標(biāo)記的特異片斷.根據(jù)堿基互補(bǔ)原則 核酸探針能特異性地與冃的 雜交垠后用特定的方法測(cè)定標(biāo)記物.探針標(biāo)記方 式分為放射性標(biāo)記、非放射性標(biāo)記。放射性標(biāo)記的 核酸探針的特異性非常強(qiáng)檢測(cè)病原微生物速度比 常規(guī)方法快得多

18、。U前用的較多的是用生物索 抗生物素蛋門系統(tǒng)標(biāo)記的非放射性核酸探針該探 針已在沙門氏商、產(chǎn)腸毒索大腸桿商及乙型肝炎病 毒檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用?；蛑亟M法由于基因重組尤其是轉(zhuǎn)化作用僅出現(xiàn)丁同 種或親緣關(guān)系分近的菌株Z間 所以堆因巫組技 術(shù)可以用丁細(xì)茵的分類和鑒定中。如用轉(zhuǎn)化法測(cè)定 由食品傳染的、能引起痢疾的志賀氏細(xì)菌?；鶅?nèi)重 紐法無需對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行純培養(yǎng)而II無需什么特 殊的試劑和設(shè)備 簡(jiǎn)便易行 所以是一種很有前途 的鑒定法。食品安全檢測(cè)方法的缺點(diǎn)和不足而TI還貝有靈敏 度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)周期短、檢測(cè)成本低等優(yōu) 點(diǎn)。 探針雜交與 聯(lián)介使用檢測(cè)食胡微生 物將是今后tr品微生物檢測(cè)技術(shù)的一個(gè)巫耍研究方 向若能克服兩者存在的易污染產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果的 缺失 相信大規(guī)模推廣應(yīng)用指日可待.參考文獻(xiàn)姜永強(qiáng)雷詐榮李瑾等應(yīng)用 方法檢 定單孩細(xì)胞増多性李斯特菊 中華預(yù)防醫(yī) 學(xué)雜志金大智謝明杰曹際姐代品中單增李氏菌 實(shí)時(shí)熒光 檢測(cè)鑒定方法的建立 遼寧 師范大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版云泓若 李月琴 周天鴻 技術(shù)檢測(cè)金黃色爸萄球繭腸毒索自然科學(xué)版沈孝民涂書淸用中沙門氏菌的研究基因 暨南大學(xué)學(xué)報(bào)技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物產(chǎn)品 追究動(dòng)物檢疫社巍定屋 技術(shù)在食源性致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用 食晶科學(xué)王元平 吳淸平 張菊梅 等基因芯片技術(shù)及 貳在食品衛(wèi)生微生物檢測(cè)中的應(yīng)用 中國(guó) 衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志© 1994-20